高活性益生菌發酵枸杞粉的真空冷凍干燥工藝優化

于 紅，彭 珍，黃 濤，李君怡，熊 濤*

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，食品學院，江西 南昌 330031）

枸杞，茄科類植物，又名茍起子、甜菜子、枸蹄子等，是一種藥食同源的食物[1]。枸杞中含有多種生理活性成分，如枸杞多糖，具有增強免疫、抗腫瘤、抗衰老、抗疲勞、抗輻射損傷、調節血脂、降血壓、降血糖等功效，此外，枸杞中的胡蘿卜素還可以美容養顏、滋潤肌膚，適量食用有助于健康[2-3]。目前，中國市場上80%的枸杞仍以干果銷售，深加工高附加值的產品較少，隨著大健康產業的興起，枸杞作為藥食同源食物開發前景廣闊[4]。研究表明，乳酸菌生長代謝會產生乳酸、胞外多糖、抗菌肽等物質，這些不僅有利于改善食品風味，還能提高營養價值，延長保質期[5-6]。因此利用植物乳桿菌發酵枸杞，增加了枸杞的營養價值，口感更加獨特醇厚、營養成分更易吸收。枸杞中的乳酸菌又可以調節腸道菌群、降固醇等。

工業常用的干燥方式有常壓干燥、減壓干燥、噴霧干燥、冷凍干燥等[7]。常壓干燥的特點包括：設備簡單，干燥時間長，不耐熱成分破壞，產品易結塊；減壓干燥的特點是：溫度低，產品質松易粉碎；噴霧干燥的特點有：溫度高，熱敏成分被破壞，產品損失較嚴重；真空冷凍干燥的特點是：低溫環境有助于保護其風味和營養成分[8]，低壓環境可以防止被氧化，保持菌活力，凍干前后物料的形狀不會改變，內部呈現出均勻多孔的結構，并且會脫去90%～95%的水分，凍干粉的復水能力強且快，保質期也會延長[9-10]。凍干產品保持了食品特有的色香味，具有良好的貯藏保鮮和復水性，受到消費者歡迎。近幾年凍干食品產量以30%的速度增加，主要用于供給航空航天、遠洋、軍事等特殊環境人群，以及快餐和方便食品行業。

目前，番木瓜片[11]、蘋果片[12]、草莓片[13]、冬棗片[14]等果蔬食品的真空冷凍干燥已有研究報道，但對于枸杞粉的研究鮮有報道，更是缺少含有活菌的發酵枸杞粉的研究報道。現有研究大都采用共晶點作為物料的物性參數參考，但是針對一些多元復雜的溶液，有一部分的無定形態會形成玻璃體，此時共晶點并不能很好地提供依據和指導。冷凍干燥過程費時長、耗能多，需要準確測定物料的物性參數，制定準確可靠的控制程序，生產出高質量、節能、低成本的產品。本實驗以植物乳桿菌發酵枸杞漿為研究對象，通過對凍干保護劑進行優化，從而提高益生菌存活率。同時還對其凍干機制進行研究，為研制高效果蔬凍干菌劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞購于寧夏銀川；植物乳桿菌NCU137由南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室保藏。

脫脂乳 雙城雀巢有限公司；明膠 北京鑫達食品添加劑有限公司；麥芽糊精 國藥集團化學試劑有限公司；海藻糖 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蔗糖 安徽省來發食品貿易有限公司；異乳糖、菊粉、低聚異麥芽糖、麥芽糖醇、乳糖 河南圣斯德實業有限公司；所有材料與試劑均為食品級。

1.2 儀器與設備

ZSD-A1160A全自動新型生化培養箱 上海精宏試驗設備有限公司；YXQ-LS50S IIA/B3生物安全柜 蘇州安泰空氣技術有限公司；YXQ-LS-50S II立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；萬分之一精密電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SJ201A-250型榨汁機 浙江蘇泊爾股份有限公司；凍干顯微鏡 德國bt1有限公司；功率補償型差示掃描量熱儀 梅特勒-托利多國際股份有限公司；超低溫冰箱 海爾集團有限公司；真空冷凍干燥機 上海東富龍科技有限公司；西林瓶 滄州榮昌玻璃制品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 凍干工藝流程

篩選優良的干枸杞→干枸杞復水→打漿→滅菌→冷卻→接種→發酵→加入保護劑→預凍→凍干

1.3.2 發酵枸杞漿的制備

選取質量、形態好的干枸杞，以1∶3的比例進行復水，打漿，102 ℃滅菌20 min，冷卻后菌劑接種量為萬分之一，培養發酵16 h，發酵完的枸杞漿在2 h之內備用。

1.3.3 共晶點、共融點與玻璃態轉化溫度的測定

使用差示掃描量熱儀測定物料的共晶點、共融點以及玻璃態轉化溫度[15]；用電子天平稱取10 mg左右調配好的枸杞漿放置于差示掃描量熱儀的鋁盤中，壓蓋放入儀器中進行測定。儀器的程序設定：一階段以-10 ℃/min的速率從25 ℃到-50 ℃，保持2 min；二階段退火過程，以10 ℃/min的速率從-50 ℃到退火溫度-5 ℃，保持2 min；三階段再以-5 ℃/min從-5.0 ℃到-50 ℃，保持2 min；四階段以5 ℃/min的速率從-50 ℃進行連續掃描直至達到25 ℃。

1.3.4 崩解溫度的測定

取2 μL凍干前發酵枸杞漿放置在凍干顯微鏡的載物臺，以20 ℃/min的速率使物料的溫度降到-60 ℃，維持150 s，待物料完全凍實后抽真空，真空度保持在10 Pa左右，以2 ℃/min的速率升至20 ℃，顯微鏡每5 s拍攝物料的照片，用于監控并記錄凍干過程，確定物料的崩解溫度[16]。

1.3.5 凍干曲線的繪制

在凍干過程中每隔10 min記錄樣品溫度，通過記錄的樣品溫度繪制凍干曲線，每個樣品重復實驗3 次。

1.3.6 凍干樣品的制備

配制不同濃度的保護劑，102 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫，將發酵枸杞漿重懸于不同的保護劑中，混合均勻，-80 ℃保存備用[17]。

1.3.7 保護劑的選擇與優化

分別選取5%、10%、15%的脫脂乳、低聚異麥芽糖、菊粉、乳糖、海藻糖、異乳糖，10%、15%、20%的麥芽糊精，0.5%、1.0%、1.5%的明膠，1%、2%、3%的蔗糖，5%、10%、15%的麥芽糖醇，10 種不同梯度的保護劑[18-19]，分別加入到發酵枸杞漿中進行單因素試驗，確定適宜保護劑及用量。以存活率為指標，通過正交試驗進行復配，確定最佳冷凍干燥的復配保護劑。

采用MRS平板計數法，分別對凍干前和凍干后物料樣品進行計數，依次配制1∶10的樣品勻液，遞增稀釋，選擇2 個適宜的稀釋度進行平板計數。放入培養箱中培養48 h后進行計數。存活率的計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 發酵枸杞漿物性參數的測定

2.1.1 共晶點、共融點、玻璃態轉化溫度的確定

圖1 發酵枸杞漿的差示掃描量熱溫度曲線Fig. 1 DSC curve of fermented goji berry pulp with Lactobacillus

由于發酵枸杞漿屬于多元溶液，成分較為復雜，多種溶質之間相互作用，結晶情況復雜，降溫處理，水分的部分凍結成晶體的冰，其他成分結晶部分形成玻璃體[20-21]。由圖1可以看出，當溫度逐漸從25 ℃降到-50 ℃的過程中，4～6 min之間，即-22.70～-27.34 ℃之間有一個放熱峰，這是因為發酵枸杞漿在由液態變為固態的過程中需要放出大量的相變潛熱，峰為結晶峰，即確定發酵枸杞漿部分溶質的結晶點為-19.59 ℃。同理，當溫度從-50 ℃升到25 ℃時，在34 min與38 min之間有一個比較矮的吸收峰，因為發酵枸杞漿在從固態到液態的過程中會吸收相變的潛熱，起始點即共熔點為-5.28 ℃。因為發酵枸杞漿是復雜的混合物，并不能完全結晶，結晶點不能準確地反映樣品的凍結狀態，對于含有的非晶態高分子成分沒有結晶點，玻璃態轉化溫度是非晶態物質的一個重要物理性質，當處于玻璃態時，分子鏈和鏈段都不能運動，達到穩固的狀態。實驗結果顯示，經過10 ℃/min的速率從-50 ℃到-5 ℃的退火過程，在升溫速率為5 ℃/min時發酵枸杞漿的玻璃態轉化溫度為-31.82 ℃，所以預凍終點溫度低于-31.82 ℃。

預凍溫度過低會增加冷凍能耗；溫度過高，物料未能完全凍結，真空條件下水分快速蒸發，液體濃縮使凍干產品體積縮小，并且氣體迅速冒出使產品鼓泡，影響產品的結構和質量。所以依據該物料的共晶點和玻璃態轉化溫度，在本實驗中選擇-40 ℃作為預凍溫度。

2.1.2 崩解溫度的確定

圖2 凍干過程中發酵枸杞漿隨溫度改變的狀態變化Fig. 2 Change in the state of fermented goji berry pulp with Lactobacillus during freeze-drying process

凍干過程分為兩個不同的階段，第1階段稱為升華干燥階段，此階段對于凍干粉的品質有很大的影響。升華干燥的溫度是重要的控制指標，當溫度超過物料的崩解溫度時，物料結構就會遭到嚴重破壞，內部蜂窩狀結構會產生塌陷，導致升華的水蒸氣的通道被堵塞，從而影響物料的升華，使物料的質量和品質變差，所以崩解溫度的確定具有重要意義[22]。由圖2a可看出，常溫時，呈現出的是凍結前樣品為均勻分散的液態狀態，相當于凍干預凍前的狀態；圖2b中，隨著溫度的逐漸下降，當下降到-17 ℃時，樣品大部分物質凍結，即圖片中逐漸由淺變深色的部分為凍結的樣品狀態；圖2c溫度繼續下降，原來深色的部分顏色更加明顯，此時樣品已完全凍結，真空條件下凍結部分的升華界面開始逐漸形成，由于崩解坍塌的現象在凍干界面形成，生成升華界面可以更加清楚地顯示樣品崩解的狀態，確定崩解溫度。圖2d顯示，當溫度開始上升，隨著溫度的逐步升高干燥層越來越寬，此時溫度約為-38 ℃；圖2e中，當溫度上升到-35 ℃時，凍干界面開始出現小的白斑，即樣品出現坍塌崩解的狀態，白斑逐漸增大，直到完全崩塌如圖2f。因此出現小白斑的溫度確定為物料的崩解溫度約為-36 ℃，所以升華干燥階段溫度低于-36 ℃。

升華干燥階段，物料熱量被升華熱帶走，需要加熱板溫度供給升華熱。當加熱板的溫度較低時，熱通量小，物料升華界面溫度低，傳質推動力小，干燥時間較長，同時干燥效率降低，當加熱板溫度升高時與之相反，但是加熱板的溫度不超過物料的共熔點和崩解溫度，物料才能實現升華干燥。所以依據該物料的共融點和崩解溫度，在本實驗中選擇-45 ℃作為升華階段加熱板的溫度。

2.1.5 藥品劑型的影響:同一藥品的劑型不同,其在體內的吸收也不會相同,即生物利用度相異,如果不能掌握劑量就會導致不良反應的出現。

2.1.3 預凍時間的確定

圖3 制冷溫度-40 ℃條件下的發酵枸杞漿凍結曲線Fig. 3 Freezing curve of fermented goji berry pulp with Lactobacillus at -40 ℃

將物料放入凍干倉內，平衡至預凍的溫度，此時的物料并沒有完全的凍結，不可以直接進行升華干燥，此溫度保持1～2 h樣品才會凍實[23]。因此通過測定物料的凍結曲線確定預凍時間。當預凍溫度為-40 ℃時的物料凍結曲線如圖3所示，發酵枸杞物料進倉溫度為27 ℃，20 min冷卻到-5 ℃，平均速率為1.60 ℃/min。在20～30 min之間，溫度下降緩慢，維持在-5 ℃左右，因為當物料從液態轉變到固態時，會吸收較多的相變熱，所以降溫緩慢。當物料完成相變熱階段之后降溫速度加快，在80 min時，溫度下降至-23 ℃，平均速率為0.36 ℃/min。80 min后，溫度下降速率變緩慢，由于物料溫度與空氣介質之間的溫度差變小，所以溫度下降速率隨之變小，降速在115 min達到最低，并維持在-30 ℃。由此可知在約2 h物料可達到預凍溫度，因此本研究確定發酵枸杞漿在-40 ℃預凍溫度的凍結時間為4 h，此時的發酵枸杞已完全凍實。

2.1.4 發酵枸杞漿的凍干曲線繪制

圖4 益生菌發酵枸杞漿真空冷凍干燥曲線Fig. 4 Freeze drying curve of fermented goji berry pulp with Lactobacillus

如圖4所示，將一定量的發酵枸杞漿放入-40 ℃凍干倉中進行預凍4 h，凍實之后打開凍干機的冷阱，待冷阱溫度降到-80 ℃時，打開真空，物料進入凍干過程的升華干燥階段，此階段加熱板的溫度為-45 ℃。由圖4可知，該階段物料從-43 ℃緩慢升溫，20 h時，物料溫度升至-20 ℃后趨于穩定，此時大部分自由水因升華被移除，待自由水除完，進入解析干燥階段，此時除去的為結合水，之后緩慢升高加熱板的溫度，溫度不可超過物料所能承受的最大溫度。初步設置為-20 ℃，待物料穩定之后再升高至25 ℃，使物料溫度逐漸緩慢升高，由圖4可知，物料溫度隨著加熱板溫度的升高而逐漸增加，開始穩定在-10 ℃左右，待加熱板溫度升高到25 ℃時物料溫度逐漸穩定在20 ℃左右，此時物料的結合水清除完，解析干燥結束。但是發酵枸杞漿的含糖量很高，凍干結束后很難形成凍干粉。

2.2 保護劑的優化

2.2.1 保護劑的選擇

圖5 不同保護劑對于發酵枸杞漿中的乳酸菌活菌數的影響Fig. 5 Effect of different lyoprotectants on bacterial survival in fermented goji berry pulp

保護劑的選擇對于發酵枸杞凍干粉的品質有著至關重要的作用，加入有效的保護劑，可以減少惡劣環境對菌的傷害[24-25]，凍干枸杞粉復水時也能減弱對菌體的損傷，貯存期間也能很好地保持其穩定性[26-27]。對于其保護機理，目前主要有兩種假說，一種是“玻璃態假說”，即許多大分子的保護劑在冷凍過程中會隨著溫度降低、電解質濃度增大形成一種非晶體的狀態，這種狀態稱為玻璃態，由于這種狀態為高黏態，它能起到較好的固定作用，能夠防止生物大分子組織結構的變化，從而起到了保護的效果[28-29]，如大分子物質脫脂乳、麥芽糊精等通過玻璃態機制保護細胞組織結構。另一種是“水替代假說”，因為在凍干的過程中，水逐漸升華脫離物料，水的流失會使蛋白質的結構遭到破壞，一些保護劑會通過取代水的位置，通過氫鍵作用與蛋白質分子結合從而使蛋白質穩定不遭到破壞[30-31]。如海藻糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖醇等一些糖類和醇類含有多個羥基，形成氫鍵能力較強，主要通過水取代作用保護細胞結構的穩定性。本研究通過選取10 種不同種類凍干保護劑進行實驗，以活菌數作為最終的指標，確定最佳保護劑。由圖5可知，保護效果較佳的依次為15%異乳糖＞20%麥芽糊精＞10%乳糖＞5%海藻糖＞5%脫脂乳，活菌數均達到8.76（lg（CFU/mL））以上。雖然當以異乳糖為保護劑時，產品活菌數較高，但凍干產品出現物料體積縮小、鼓泡的現象，凍干不易進行，可能是因為加入異乳糖后使物料的崩解溫度降低，凍干時結構容易塌陷。故綜合考慮，選擇20%麥芽糊精、10%乳糖和5%海藻糖作為凍干保護劑。

2.2.2 復配正交試驗結果

表1 正交試驗設計與結果Table 1 Orthogonal array design with experimental results

表2 方差分析結果Table 2 Results of analysis of variance

通常整個保護劑體系，應是由多種不同類型的保護劑組成的復配體。通過上述保護劑選擇的實驗結果綜合考慮，選擇3 種保護效果較佳的保護劑進行復配優化，分別為麥芽糊精18%、20%、22%，乳糖10%、12%、14%，海藻糖4%、5%、6%，選擇L9（34）正交表，正交試驗設計與結果見表1，方差分析見表2，由極差分析可知，影響發酵枸杞中細胞存活率的主次因素依次為乳糖、海藻糖、麥芽糊精，乳糖極差最大，分析方差達到了顯著水平，對活菌的保護效果最佳，分析可知理論最佳優化組合為

A2B3C3。對最佳結果進行驗證實驗，重復3 次，結果表明組合A2B3C3的存活率達到了91%，與理論相符，即最佳的復配組合為20%麥芽糊精、14%乳糖、6%海藻糖。

2.3 樣品凍干工藝的確定

圖6 添加復配保護劑的發酵枸杞漿凍干樣品掃描電鏡圖Fig. 6 Scanning electron microscope images of freeze-dried samples from fermented goji berry pulp with the lyoprotectant combination

圖7 添加復配保護劑的發酵枸杞漿樣品凍干曲線Fig. 7 Freeze drying curve of fermented goji berry pulp with the lyoprotectant combination

由圖6可看出，當測定崩解溫度時，溫度上升到-21 ℃，小白斑開始形成，物料出現坍塌崩解，由此可以確定樣品的崩解溫度約為-21 ℃。所以當加入保護劑后，不僅保證了益生菌發酵枸杞凍干粉的高活性，還提高了樣品的崩解溫度，降低了能耗。本實驗設定升華干燥階段溫度為-30 ℃并繪制凍干曲線（圖7），實驗結果顯示，樣品從-25 ℃逐漸升溫，在13 h時升到-10 ℃并趨于穩定，與發酵枸杞漿的凍干相比，不僅升高了升華干燥溫度，縮短了時間，還降低了較多的能耗，并且凍干結束后可得到色澤好、質量佳、高活性的益生菌凍干枸杞粉。

3 結 論

凍干食品不僅保證了食品的品質和營養，相比于一些罐裝、冷凍食品，更容易運輸且能長時間保鮮[32]。本研究以復水枸杞漿為原料，經植物乳桿菌發酵16 h后，測定了發酵枸杞漿的物性參數，并以菌體存活率為指標來進行保護劑的選擇與優化，最終完成凍干曲線的繪制。結果表明，發酵枸杞漿的物性參數：結晶點為-19.59 ℃，共熔點為-5.28 ℃，玻璃轉化溫度為-31.82 ℃，崩解溫度約為-36 ℃，根據物料的物性參數，確定了預凍溫度為-40 ℃，繪制預凍曲線并確定預凍時間為4 h，升華干燥階段的溫度設置為-45 ℃，完成發酵枸杞漿的凍干曲線繪制；復配保護劑為20%麥芽糊精、14%乳糖、6%海藻糖的保護效果最佳；加入復配保護劑后，樣品的崩解溫度約為-21 ℃，確定升華干燥溫度-30 ℃并繪制樣品的凍干曲線，得到了富含活菌的枸杞粉。益生菌發酵枸杞粉凍干后活菌數高達9.6（lg（CFU/g）），含水量低于3%，色澤完好，復水性強，產品質量佳。凍干發酵枸杞粉既保持了特有的保健功能，又含有大量的活菌可以調節胃腸菌群生態平衡，迎合了消費者對高品質食品的需求，符合大健康產業發展趨勢，因此市場前景非常的廣闊，必將受到越來越多消費者的青睞。