氯化鈣-木瓜蛋白酶-碳酸氫鈉嫩化體系改善原切牦牛排嫩度

楊鴻基，韓 玲,*，孔祥穎，馬君義，張文華，余群力

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.海北州畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，青海 海北 810200；3.青海百德投資發(fā)展有限公司，青海 西寧 810000；4.中衛(wèi)市夏華清真肉食品有限公司，寧夏 中衛(wèi) 755000）

隨著人們生活節(jié)奏的加快，冷鏈物流技術(shù)的不斷完善，以及中西方飲食文化的融合，牛排因其獨(dú)特的風(fēng)味、簡(jiǎn)易的烹調(diào)方式成為家庭餐桌上的新寵。由于我國(guó)牛肉市場(chǎng)的眼肉、脊肉、腰內(nèi)肉等高檔部位牛肉價(jià)格昂貴且產(chǎn)量較少，所以大多數(shù)廠家采用牛后腿肉為原料，經(jīng)適當(dāng)調(diào)理制作牛排。牦牛肉屬于高蛋白、低脂肪肉類，是具有豐富營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的綠色食品[1-2]，也是牛排制作的絕佳原料。但由于其嫩度較低，導(dǎo)致市場(chǎng)上的調(diào)理牦牛排相對(duì)較少，同時(shí)影響了其高值化和高產(chǎn)化的進(jìn)展。

嫩度是評(píng)價(jià)牛排品質(zhì)的決定性因素，嫩化牦牛肉的主要手段是通過使用物理、化學(xué)、酶法將肌原纖維弱化或?qū)⒗w維蛋白水解、斬?cái)唷Ｑ芯勘砻鳎?dāng)Ca2＋濃度達(dá)到0.1 mmol/L時(shí)，可以激活鈣激活酶，鈣激活酶的活性致使蛋白分解，使得肉質(zhì)變嫩。盡管氯化鈣對(duì)肉的嫩化效果較好，且成本低，應(yīng)用價(jià)值很高，但氯化鈣添加量過大會(huì)影響肉的風(fēng)味和色澤，降低肉的保水性[3-4]。木瓜蛋白酶是一種低特異性巰基酶，其活性中心的半胱氨酸可以快速將纖維蛋白的—CO—NH—切開[5]，與Ca2＋的嫩化途徑有一定區(qū)別。但木瓜蛋白酶的過量使用會(huì)導(dǎo)致肉發(fā)生過度水解，造成保水性降低，感官評(píng)分下降等問題[6]。木瓜蛋白酶的最適pH值在6.0～7.0之間，牦牛肉在宰后24 h之后的pH值穩(wěn)定在5.60左右[7]。碳酸氫鈉能適當(dāng)提升牛肉pH值，使木瓜蛋白酶達(dá)到其作用的最適pH值，同時(shí)其作為一種常見的膨松劑和保水劑[8]，還可以適當(dāng)提升牦牛肉的保水性。國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)氯化鈣和木瓜蛋白酶嫩化肉的效果進(jìn)行了大量的研究[9-12]，但關(guān)于氯化鈣、木瓜蛋白酶及碳酸氫鈉復(fù)合使用鮮有報(bào)道。

本研究通過響應(yīng)面回歸設(shè)計(jì)，以氯化鈣、木瓜蛋白酶和碳酸氫鈉為嫩化手段對(duì)牦牛排進(jìn)行嫩化處理，以剪切力和感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究氯化鈣、木瓜蛋白酶和碳酸氫鈉復(fù)合嫩化牦牛排的最佳條件，構(gòu)建有效的復(fù)合嫩化體系，為牦牛肉的增值和增產(chǎn)提供有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛肉采自青海百德食品有限公司經(jīng)檢疫合格后的4 歲牦牛，屠宰后排酸3～4 d取其后腿肉，剔除筋膜及脂肪，-20 ℃冷凍備用。

氯化鈣 浙江大成鈣業(yè)有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力為100 000 U/g） 南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；碳酸氫鈉 山東海天生物化工有限公司；食鹽 甘肅武陽鹽化有限公司。以上試劑均為食品級(jí)。

K2HPO4、KH2PO4、KCl、EDTA、MgCl2天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；NaN3天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TA.XY Plus物性測(cè)試儀 英國(guó)Stable Micro System公司；JJ-2B型組織搗碎機(jī) 金壇市醫(yī)療儀器廠；TGL-16M型離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HTP-250型鋸骨機(jī) 諸城市和義機(jī)械有限公司；CR-10型色度計(jì) 柯尼美能達(dá)有限公司；ANB-135A電餅檔永康市愛寧電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

1.3.1.1 嫩化劑配制

按肉質(zhì)量的10%配制嫩化劑，其中氯化鈣質(zhì)量濃度分別為0、5、10、15、20、25 mg/mL；木瓜蛋白酶活力分別為0、5、10、15、20、25 U/g；碳酸氫鈉質(zhì)量濃度分別為0、10、20、30、40、50 mg/mL。

1.3.1.2 腌制嫩化

原料沿垂直肌原纖維方向切分為厚度1.2 cm，大小約9 cm×9 cm的原料排，4 ℃解凍。將預(yù)先配制好的嫩化劑采用機(jī)械注射的方式均勻地注射到肉中，注射量偏差范圍在5%之內(nèi)，然后放置于4 ℃環(huán)境中進(jìn)行腌制，采用間歇式滾揉方式：30 min-30 min-30 min，5～8 r/min。

1.3.1.3 煎制

將嫩化好的樣品在溫度升至160 ℃的煎鍋中煎制，用電子數(shù)顯食品溫度計(jì)測(cè)定牦牛排中心溫度，待溫度達(dá)到76.6 ℃時(shí)取出冷卻至室溫待測(cè)。

1.3.2 剪切力測(cè)定

參照馬婭俊[13]的方法并稍作修改。樣品冷卻后切成3 cm×1 cm×1 cm長(zhǎng)方體進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)樣品測(cè)6 次取其平均值。使用物性測(cè)試儀進(jìn)行測(cè)試，測(cè)前和測(cè)中速率均為10 mm/s，測(cè)后速率5 mm/s，觸發(fā)力5 g，下行距離12 mm。

1.3.3 肉色測(cè)定

參照孫志昶[14]的方法，用色差儀進(jìn)行肉樣的L*（亮度值）、a*（紅度值）、b*（黃度值）的測(cè)定，平行測(cè)定3 次，取平均值。從肉樣上切取0.5 cm厚切片，在空氣中暴露45 min，在切面上選取5 個(gè)點(diǎn)用色度計(jì)測(cè)定色度，結(jié)果以CIE系統(tǒng)坐標(biāo)的L*、a*、b*表示。

1.3.4 肌原纖維斷裂指數(shù)（myofibril fragmentation index，MFI）測(cè)定

參考Delgado等[15]的方法并稍作修改。取腌制后的肉樣2 g，加20 mL的MFI緩沖液（20 mmol/L K2HPO4、20 mmol/L KH2PO4、100 mmol/L KCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L NaN3，pH 7.1）混合均勻后，在冰水浴下進(jìn)行勻漿（8 000 r/min，勻漿時(shí)間15 s/次，間隙30 s，連續(xù)3 次）。勻漿液4 ℃、1 000×g離心15 min，棄上清液。沉淀用8 mL的MFI緩沖液懸濁、再離心，棄上清液。沉淀用5 mL的MFI緩沖液使之重新處于懸濁態(tài)，用200 目尼龍篩網(wǎng)過濾該懸濁液，另用5 mL MFI緩沖液幫助肌原纖維蛋白通過濾網(wǎng)。過濾所得的肌原纖維蛋白懸濁液用雙縮脲法測(cè)定其蛋白含量，然后用MFI緩沖液將其質(zhì)量濃度稀釋至0.5 mg/mL，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，MFI緩沖液作對(duì)照，將結(jié)果乘以200，即為MFI。

1.3.5 感官評(píng)價(jià)

參考GB/T 14195—1993《感官分析 選拔與培訓(xùn)感官分析 優(yōu)選評(píng)價(jià)員導(dǎo)則》[16]選拔、培訓(xùn)10 名優(yōu)選評(píng)價(jià)員對(duì)牦牛排進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，參照王永祥[17]的方法并略作修改，具體評(píng)價(jià)指標(biāo)見表1。使用強(qiáng)制決定法來確定各因素的權(quán)重分配方案。計(jì)算公式如下：

感官評(píng)分＝0.174×色澤＋0.168×組織狀態(tài)＋0.182×香氣＋0.252×嫩度＋0.224×滋味

表1 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of yak steak

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以氯化鈣質(zhì)量濃度（A）、木瓜蛋白酶活力（B）、碳酸氫鈉質(zhì)量濃度（C）和腌制時(shí)間（D）為自變量進(jìn)行單因素試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以剪切力（Y1）和感官評(píng)分（Y2）為響應(yīng)值，用Design-Expert 8.06進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)各因素與水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Code and level of independent variables used for response surface optimization

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 22對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行均值差異顯著性檢驗(yàn)：P＜0.05，差異顯著；P＜0.01，差異極顯著。多重比較采用最小顯著差異法。數(shù)據(jù)以樣品測(cè)定結(jié)果的表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 各因素對(duì)牦牛排嫩化效果的影響

圖1 各因素對(duì)牦牛排嫩化效果的影響Fig. 1 Effects of calcium chloride concentration, papain activity,sodium bicarbonate concentration and treatment time on tenderization of yak steak

由圖1可知，當(dāng)氯化鈣質(zhì)量濃度在0～10 mg/mL時(shí)，牦牛排的剪切力隨著氯化鈣質(zhì)量濃度的增加而顯著降低（P＜0.05），而MFI值則與氯化鈣質(zhì)量濃度呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.495。氯化鈣質(zhì)量濃度在10～20 mg/mL時(shí)，剪切力顯著增加（P＜0.05），20 mg/mL后趨于平緩，而MFI值則先下降再略有回升，各濃度梯度之間的MFI值變化不顯著（P＞0.05）。但氯化鈣的添加量并非越大越好[18]，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氯化鈣質(zhì)量濃度大于20 mg/mL后，牦牛排的色澤及組織狀態(tài)被破壞的較為嚴(yán)重，出品率也略有下降。酶活力在0～15 U/g范圍內(nèi)，剪切力隨肉中木瓜蛋白酶活力的增加而顯著降低（P＜0.05），MFI值則呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(shì)，直至酶活力為15 U/g時(shí)趨于穩(wěn)定。實(shí)際中發(fā)現(xiàn)當(dāng)酶活力為25 U/g時(shí)，剪切力均值下降為1.742 kg，此時(shí)牦牛排的外觀和組織狀態(tài)被損壞，口感較差，出現(xiàn)了過度嫩化現(xiàn)象。碳酸氫鈉質(zhì)量濃度在0～10 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，剪切力稍有上升，但變化不顯著（P＞0.05），MFI值顯著下降（P＜0.05）；碳酸氫鈉質(zhì)量濃度為10～20 mg/mL時(shí)，牦牛排的剪切力顯著降低（P＜0.05），MFI值顯著提高（P＜0.05）；碳酸氫鈉質(zhì)量濃度大于20 mg/mL時(shí)，剪切力和MFI值均趨于平緩。復(fù)合嫩化液的腌制時(shí)間在0～12 h范圍內(nèi)，剪切力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著降低（P＜0.05），MFI值則顯著上升（P＜0.05）。

2.1.2 各因素對(duì)牦牛排色澤的影響

圖2 各因素對(duì)牦牛排色澤的影響Fig. 2 Effects of calcium chloride concentration, papain activity, sodium bicarbonate concentration and treatment time on color of yak steak

由圖2可知，氯化鈣質(zhì)量濃度在0～5 mg/mL時(shí)，牦牛排的a*值顯著下降（P＜0.05），L*和b*值變化不顯著（P＞0.05）；其在5～15 mg/mL時(shí)，L*、a*、b*值差異不顯著（P＞0.05）；而當(dāng)其大于15 mg/mL時(shí)，牦牛排的a*值顯著降低（P＜0.05），這可能是由于氯化鈣溶液的注射改變了肌動(dòng)蛋白與肌漿球蛋白之間的相互作用，使肉對(duì)光的散射作用發(fā)生改變[19]。木瓜蛋白酶活力為0～10 U/g時(shí)，牦牛排的L*、a*、b*值均無顯著變化（P＞0.05）；酶活力為10～25 U/g時(shí)，L*、a*、b*值均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)槊溉芤旱奶砑佑绊懥嗣撗跫〖t蛋白、氧合肌紅蛋白和高鐵肌紅蛋白的比例[20]。但綜合以上，木瓜蛋白酶對(duì)肉色澤的影響較小。碳酸氫鈉質(zhì)量濃度在0～10 mg/mL時(shí)，牦牛排的L*和b*值呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)（P＜0.05）；碳酸氫鈉質(zhì)量濃度大于10 mg/mL時(shí)，L*值先上升然后趨于平緩，a*值持續(xù)下降，b*值則是先趨于穩(wěn)定然后開始下降。碳酸氫鈉溶液的添加提高了牦牛排的pH值，增強(qiáng)了線粒體中細(xì)胞色素氧化酶的活性，導(dǎo)致鮮紅色的氧合肌紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)樽霞t色的脫氧肌紅蛋白，肌肉呈暗紅色[21]。腌制時(shí)間在0～12 h時(shí)，隨著腌制時(shí)間的延長(zhǎng)，肉中的氧合肌紅蛋白被腌制劑氧化為高鐵肌紅蛋白，致使牦牛排的L*值先上升后下降，b*值顯著升高（P＜0.05），腌制時(shí)間大于12 h時(shí)，牦牛排的L*、a*、b*值均趨于穩(wěn)定，腌制劑不再對(duì)肉的色澤產(chǎn)生影響。

綜合圖1和圖2考慮，最終選取氯化鈣質(zhì)量濃度10 mg/mL、木瓜蛋白酶活力15 U/g、碳酸氫鈉質(zhì)量濃度20 mg/mL和腌制時(shí)間12 h作為響應(yīng)面的中心點(diǎn)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果及模型的建立

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取氯化鈣質(zhì)量濃度（A）、木瓜蛋白酶活力（B）、碳酸氫鈉質(zhì)量濃度（C）和腌制時(shí)間（D）進(jìn)行4因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。運(yùn)用Design-Expert 8.06對(duì)表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，分別得到剪切力（Y1）和感官評(píng)分（Y2）與4 個(gè)嫩化因子A、B、C、D的關(guān)系為：

Y1＝4.963 81-0.178 49A-0.292 5B-0.012 06C＋0.018 796D＋0.006 36AB＋0.000 63AC-0.001 912 5AD-0.003 03BC-0.004 95BD-0.001 9CD＋0.004 222 67A2＋0.011 678B2＋0.001 741 92C2＋0.004 488 54D2

Y2＝-10.094 56＋0.429 99A＋0.767 06B＋0.245 33C＋0.727D＋0.002 35AB-0.000 04AC＋0.001 387 5AD-0.001 18BC＋0.001 987 5BD＋0.000 118 75CD-0.024 389A2-0.026 679B2-0.005 521 08C2-0.031 694D2

表3 牦牛排嫩化的Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Box-Behnken design with experimental results

2.2.2 多元回歸模型分析

由表4可知，在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平范圍內(nèi)，方程的一次項(xiàng)中A、B、C、D對(duì)Y1的影響不顯著（P＞0.05），A對(duì)Y2的影響顯著（P＜0.05），B、C、D對(duì)Y2的影響極顯著（P＜0.01）；二次項(xiàng)B2、C2對(duì)Y1的影響極顯著（P＜0.01），A2對(duì)Y1的影響顯著（P＜0.05），D2對(duì)Y1的影響不顯著（P＞0.05），A2、B2、C2、D2對(duì)Y2的影響極顯著（P＜0.01）；交互項(xiàng)中，AB、BC對(duì)Y1的影響顯著（P＜0.05），對(duì)Y2的影響極顯著（P＜0.01），AC、AD、BD、CD對(duì)Y1和Y2的影響均不顯著（P＞0.05）。因此，各試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

由表4可知，兩個(gè)回歸模型均為極顯著水平（P＜0.01）且失擬檢驗(yàn)不顯著（P＞0.05），決定系數(shù)R2分別為0.858 1和0.996 4，校正決定系數(shù)R2Adj為0.816 1和0.992 8，證明模型與實(shí)際結(jié)果擬合良好；離散系數(shù)表示試驗(yàn)的精確度，數(shù)值越大，表明試驗(yàn)的可靠性越差[22]，本試驗(yàn)Y1和Y2模型的離散系數(shù)值分別為5.28%和1.06%，說明模型能較好的反應(yīng)真實(shí)值。總體而言，回歸模型能夠準(zhǔn)確分析和預(yù)測(cè)復(fù)合嫩化體系下牦牛排的剪切力和感官評(píng)分。

表4 牦牛排嫩化二次多項(xiàng)式模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of quadratic polynomial models

2.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)中各因素的交互效應(yīng)分析

響應(yīng)面圖是響應(yīng)值與各因素所構(gòu)成的三維空間曲面圖[23]。響應(yīng)面圖曲面坡度陡峭、等高線密集成橢圓形表示兩因素交互影響大，而坡度平緩、等高線呈圓形則與之相反[24]。根據(jù)得到的二次多項(xiàng)式回歸方程，利用Design-Expert 8.06對(duì)表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到交互作用的響應(yīng)面圖。

由圖3可知，剪切力最低的點(diǎn)位于等高線的中心區(qū)域。在選定的因素水平范圍內(nèi)，4 個(gè)因素對(duì)Y1的影響均不顯著（P＞0.05）。當(dāng)C和D分別為20 mg/mL和12 h時(shí)，A與B的交互作用對(duì)Y1有顯著影響（P＜0.05），Y1呈現(xiàn)明顯的先降低后升高的趨勢(shì)；當(dāng)A和D固定為10 mg/mL和12 h時(shí)，B和C的交互作用顯著影響（P＜0.05）剪切力，響應(yīng)面呈現(xiàn)先迅速下降后緩慢回升的趨勢(shì)；其余4 組的交互作用對(duì)剪切力并無顯著影響（P＞0.05）。總體可知，當(dāng)3 個(gè)因素?cái)?shù)值一定時(shí)，變量因素呈現(xiàn)較為明顯的先升后降的趨勢(shì)。

圖3 各因素對(duì)剪切力影響的響應(yīng)面圖Fig. 3 Response surface graphs showing the interactive effect of various factors on shear force

圖4 各因素對(duì)感官評(píng)價(jià)得分的響應(yīng)面圖Fig. 4 Response surface graphs showing the interactive effect of various factors on sensory evaluation score

由圖4可以看出，當(dāng)碳酸氫鈉質(zhì)量濃度和腌制時(shí)間固定為20 mg/mL和12 h時(shí)，A與B的交互作用極顯著影響（P＜0.01）牦牛排的感官評(píng)分。氯化鈣質(zhì)量濃度較低時(shí)，腌制劑對(duì)肉的嫩化作用不明顯，而氯化鈣溶液的添加量過大時(shí)，肉的pH值下降，使得木瓜蛋白酶的作用效率下降，肉的嫩度變差，感官評(píng)分下降。當(dāng)氯化鈣質(zhì)量濃度和腌制時(shí)間固定為10 mg/mL和12 h時(shí)，B和C的交互作用對(duì)感官評(píng)分有極顯著影響（P＜0.01），這可能是由于碳酸氫鈉溶液通過調(diào)節(jié)腌制劑的pH值影響了木瓜蛋白酶的作用效率，從而降低了肉的感官評(píng)分。其他交互作用的影響不顯著（P＞0.05）。從圖4也可知，有3 個(gè)因素固定時(shí)，感官評(píng)分隨另一個(gè)因素的增加而增加，達(dá)到最高點(diǎn)后急劇下降。

剪切力越低，感官評(píng)分越高，證明復(fù)合嫩化體系越顯著地改善了牦牛排的嫩度。因此，選定剪切力低和感官評(píng)分高為條件聯(lián)立兩個(gè)方程并對(duì)各變量求導(dǎo)，得出各因素嫩化牦牛排的最佳使用量為：氯化鈣質(zhì)量濃度10.19 mg/mL、木瓜蛋白酶活力14.94 U/g、碳酸氫鈉質(zhì)量濃度20.95 mg/mL、腌制時(shí)間12.32 h。在此條件下，牦牛排的剪切力預(yù)測(cè)值為1.758 kg，感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為4.67。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為證實(shí)結(jié)果能有效的改善牦牛排嫩度，對(duì)得到的最佳嫩化條件處理牦牛排，并做6 次平行實(shí)驗(yàn)。最終得到的實(shí)際結(jié)果為：剪切力1.801 kg，感官評(píng)分4.61；相對(duì)偏差分別為2.45%和1.07%。證明本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果可以顯著改善牦牛排的嫩度，而且避免了氯化鈣或木瓜蛋白酶過量使用而引起的肉質(zhì)、色澤被破壞等問題，有很好的應(yīng)用前景。

3 討論與結(jié)論

嫩化劑使用一直是肉類研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。作為一種常見的鹽類，氯化鈣主要通過增加肉中Ca2＋濃度改善牦牛肉的嫩度。牛肉細(xì)胞中含有可分解肌原纖維蛋白的酶，它的活性由Ca2＋調(diào)控，隨著Ca2＋濃度的增加，鈣激活酶的活性中心暴露，活性增加，降低內(nèi)源蛋白酶激活中性蛋白酶抑制劑的活性，從而使α-肌動(dòng)蛋白從Z線消失。鈣激活酶還可降解其他蛋白，使肌肉的伸張力減弱，促進(jìn)粗細(xì)肌微絲釋放游離[25]，肉質(zhì)變嫩。但有研究表明，Ca2＋濃度過大時(shí)，反而會(huì)抑制酶的活性，而且使肉的色澤變差，失水嚴(yán)重，感官評(píng)分下降。從本研究可以看出，氯化鈣使用量較少時(shí)，可以明顯改善牦牛排嫩度；但用量大于15 mg/mL時(shí)，肉的剪切力略有回升，感官評(píng)分下降嚴(yán)重，可能是因?yàn)楦邼舛塞}使得肉樣失水嚴(yán)重，保水性下降，嫩度變差[26]。而木瓜蛋白酶是一種天然生物酶制劑，其作用主要集中于Z線上，使Z線斷裂，肌原纖維出現(xiàn)小片化。因木瓜蛋白酶和氯化鈣的嫩化途徑不同，其和氯化鈣復(fù)合使用時(shí)，可以有效地降低氯化鈣的用量，在改善嫩度的同時(shí)保持牦牛排色澤、多汁性及組織狀態(tài)不受破壞。但一些研究發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶的過量使用，會(huì)使肉老化嚴(yán)重，風(fēng)味出現(xiàn)異常[27-28]。通過本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)木瓜蛋白酶的用量大于20 U/g時(shí)，牦牛排的感官評(píng)分急劇下降，剪切力也開始回升，這可能是由于酶的增加導(dǎo)致肌原纖維間的空隙太大而不能保持水分。碳酸氫鈉不僅能提高肉的持水力，其溶解于水中呈現(xiàn)的弱堿性還可以適當(dāng)提高牦牛肉的pH值，提高木瓜蛋白酶的嫩化效率，降低酶用量。本研究也發(fā)現(xiàn)，通過氯化鈣、木瓜蛋白酶和碳酸氫鈉的復(fù)合使用，不僅改善了牦牛排的嫩度，還穩(wěn)定了色澤和組織狀態(tài)等感官指標(biāo)。

牦牛排嫩化效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)也會(huì)影響各因素使用條件的篩選[27]。本研究還選取了MFI作為條件優(yōu)化的驗(yàn)證指標(biāo)。MFI值越高，表明肌原纖維小片化程度越高，肉的嫩度越好。本研究的目的是改善牦牛排嫩度的同時(shí)提升消費(fèi)者的感官感受，過于追求剪切力的降低和MFI值的提升可能會(huì)適得其反。因此，在優(yōu)化牦牛排嫩度的同時(shí)必須引入色度變化和感官評(píng)分這一指標(biāo)，通過色澤、風(fēng)味、組織狀態(tài)等因素的變化來改正由于剪切力過低造成的品質(zhì)降低問題，確保實(shí)驗(yàn)得出的最佳優(yōu)化工藝具有實(shí)際意義。

氯化鈣、木瓜蛋白酶或碳酸氫鈉單獨(dú)作為肉制品嫩化劑的研究較多。楊敏等[29]在4 ℃條件下用氯化鈣溶液浸泡處理宰后牦牛肉，以剪切力和MFI值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定在氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、處理時(shí)間2 d時(shí)可以獲得最佳的嫩化效果。Milligan等[30]給牛大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射氯化鈣溶液，結(jié)果顯示肉的嫩度與口感較對(duì)照組明顯提高。此外，李劼等[31]采用不同碳酸氫鈉濃度對(duì)牛肉進(jìn)行處理，證明肉質(zhì)量的0.4%碳酸氫鈉處理對(duì)醬牛肉的嫩化有一定效果。許道光等[8]分析了不同氯化鈉和碳酸氫鈉復(fù)合處理對(duì)牛肉品質(zhì)的影響，結(jié)果顯示5%氯化鈉和5%碳酸氫銨溶液的組合能明顯增加肉的嫩度，降低失水率。Kemp等[6]探究了單獨(dú)使用木瓜蛋白酶的最佳條件。本研究表明，在氯化鈣、木瓜蛋白酶和碳酸氫鈉復(fù)合使用下，氯化鈣質(zhì)量濃度10.19 mg/mL、酶活力14.94 U/g、碳酸氫鈉質(zhì)量濃度20.95 mg/mL時(shí)，剪切力、MFI值和感官評(píng)分最佳。與上述研究對(duì)比，本實(shí)驗(yàn)中氯化鈣和木瓜蛋白酶的用量分別下降了74.53%和70.12%，這主要是因?yàn)槿叩膹?fù)配使用，能夠通過不同的嫩化途徑改善牦牛排的嫩度，大大提高了嫩化效率，提高了肉的感官評(píng)價(jià)得分。通過建立氯化鈣、木瓜蛋白酶和碳酸氫鈉三者相結(jié)合的嫩化體系，不僅避免了由于氯化鈣和酶使用過量而造成的肉質(zhì)變老，風(fēng)味異常等問題，還節(jié)約了嫩化成本。

綜上可知，氯化鈣、木瓜蛋白酶和碳酸氫鈉的復(fù)配使用可以明顯改善原切牦牛排嫩度。本研究通過響應(yīng)面回歸設(shè)計(jì)最終確定的最佳嫩化條件為：氯化鈣質(zhì)量濃度10.19 mg/mL、木瓜蛋白酶活力14.94 U/g、碳酸氫鈉質(zhì)量濃度20.95 mg/mL、腌制時(shí)間12.32 h。此條件下，剪切力預(yù)測(cè)值為1.758 kg，感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為4.67，整體上較滿意，且驗(yàn)證結(jié)果與預(yù)測(cè)值擬合良好。本試驗(yàn)體系還降低了氯化鈣和木瓜蛋白酶的用量，提高了產(chǎn)品的感官評(píng)分，為工廠大規(guī)模生產(chǎn)牦牛排提供了有效依據(jù)。