氯化鈣-木瓜蛋白酶-碳酸氫鈉嫩化體系改善原切牦牛排嫩度

楊鴻基，韓 玲,*，孔祥穎，馬君義，張文華，余群力

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.海北州畜牧獸醫科學研究所，青海 海北 810200；3.青海百德投資發展有限公司，青海 西寧 810000；4.中衛市夏華清真肉食品有限公司，寧夏 中衛 755000）

隨著人們生活節奏的加快，冷鏈物流技術的不斷完善，以及中西方飲食文化的融合，牛排因其獨特的風味、簡易的烹調方式成為家庭餐桌上的新寵。由于我國牛肉市場的眼肉、脊肉、腰內肉等高檔部位牛肉價格昂貴且產量較少，所以大多數廠家采用牛后腿肉為原料，經適當調理制作牛排。牦牛肉屬于高蛋白、低脂肪肉類，是具有豐富營養價值的綠色食品[1-2]，也是牛排制作的絕佳原料。但由于其嫩度較低，導致市場上的調理牦牛排相對較少，同時影響了其高值化和高產化的進展。

嫩度是評價牛排品質的決定性因素，嫩化牦牛肉的主要手段是通過使用物理、化學、酶法將肌原纖維弱化或將纖維蛋白水解、斬斷。研究表明，當Ca2＋濃度達到0.1 mmol/L時，可以激活鈣激活酶，鈣激活酶的活性致使蛋白分解，使得肉質變嫩。盡管氯化鈣對肉的嫩化效果較好，且成本低，應用價值很高，但氯化鈣添加量過大會影響肉的風味和色澤，降低肉的保水性[3-4]。木瓜蛋白酶是一種低特異性巰基酶，其活性中心的半胱氨酸可以快速將纖維蛋白的—CO—NH—切開[5]，與Ca2＋的嫩化途徑有一定區別。但木瓜蛋白酶的過量使用會導致肉發生過度水解，造成保水性降低，感官評分下降等問題[6]。木瓜蛋白酶的最適pH值在6.0～7.0之間，牦牛肉在宰后24 h之后的pH值穩定在5.60左右[7]。碳酸氫鈉能適當提升牛肉pH值，使木瓜蛋白酶達到其作用的最適pH值，同時其作為一種常見的膨松劑和保水劑[8]，還可以適當提升牦牛肉的保水性。國內外很多學者對氯化鈣和木瓜蛋白酶嫩化肉的效果進行了大量的研究[9-12]，但關于氯化鈣、木瓜蛋白酶及碳酸氫鈉復合使用鮮有報道。

本研究通過響應面回歸設計，以氯化鈣、木瓜蛋白酶和碳酸氫鈉為嫩化手段對牦牛排進行嫩化處理，以剪切力和感官評分為評價指標，研究氯化鈣、木瓜蛋白酶和碳酸氫鈉復合嫩化牦牛排的最佳條件，構建有效的復合嫩化體系，為牦牛肉的增值和增產提供有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛肉采自青海百德食品有限公司經檢疫合格后的4 歲牦牛，屠宰后排酸3～4 d取其后腿肉，剔除筋膜及脂肪，-20 ℃冷凍備用。

氯化鈣 浙江大成鈣業有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力為100 000 U/g） 南寧東恒華道生物科技有限責任公司；碳酸氫鈉 山東海天生物化工有限公司；食鹽 甘肅武陽鹽化有限公司。以上試劑均為食品級。

K2HPO4、KH2PO4、KCl、EDTA、MgCl2天津市光復科技發展有限公司；NaN3天津市凱信化學工業有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TA.XY Plus物性測試儀 英國Stable Micro System公司；JJ-2B型組織搗碎機 金壇市醫療儀器廠；TGL-16M型離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；HTP-250型鋸骨機 諸城市和義機械有限公司；CR-10型色度計 柯尼美能達有限公司；ANB-135A電餅檔永康市愛寧電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

1.3.1.1 嫩化劑配制

按肉質量的10%配制嫩化劑，其中氯化鈣質量濃度分別為0、5、10、15、20、25 mg/mL；木瓜蛋白酶活力分別為0、5、10、15、20、25 U/g；碳酸氫鈉質量濃度分別為0、10、20、30、40、50 mg/mL。

1.3.1.2 腌制嫩化

原料沿垂直肌原纖維方向切分為厚度1.2 cm，大小約9 cm×9 cm的原料排，4 ℃解凍。將預先配制好的嫩化劑采用機械注射的方式均勻地注射到肉中，注射量偏差范圍在5%之內，然后放置于4 ℃環境中進行腌制，采用間歇式滾揉方式：30 min-30 min-30 min，5～8 r/min。

1.3.1.3 煎制

將嫩化好的樣品在溫度升至160 ℃的煎鍋中煎制，用電子數顯食品溫度計測定牦牛排中心溫度，待溫度達到76.6 ℃時取出冷卻至室溫待測。

1.3.2 剪切力測定

參照馬婭俊[13]的方法并稍作修改。樣品冷卻后切成3 cm×1 cm×1 cm長方體進行測試，每個樣品測6 次取其平均值。使用物性測試儀進行測試，測前和測中速率均為10 mm/s，測后速率5 mm/s，觸發力5 g，下行距離12 mm。

1.3.3 肉色測定

參照孫志昶[14]的方法，用色差儀進行肉樣的L*（亮度值）、a*（紅度值）、b*（黃度值）的測定，平行測定3 次，取平均值。從肉樣上切取0.5 cm厚切片，在空氣中暴露45 min，在切面上選取5 個點用色度計測定色度，結果以CIE系統坐標的L*、a*、b*表示。

1.3.4 肌原纖維斷裂指數（myofibril fragmentation index，MFI）測定

參考Delgado等[15]的方法并稍作修改。取腌制后的肉樣2 g，加20 mL的MFI緩沖液（20 mmol/L K2HPO4、20 mmol/L KH2PO4、100 mmol/L KCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L NaN3，pH 7.1）混合均勻后，在冰水浴下進行勻漿（8 000 r/min，勻漿時間15 s/次，間隙30 s，連續3 次）。勻漿液4 ℃、1 000×g離心15 min，棄上清液。沉淀用8 mL的MFI緩沖液懸濁、再離心，棄上清液。沉淀用5 mL的MFI緩沖液使之重新處于懸濁態，用200 目尼龍篩網過濾該懸濁液，另用5 mL MFI緩沖液幫助肌原纖維蛋白通過濾網。過濾所得的肌原纖維蛋白懸濁液用雙縮脲法測定其蛋白含量，然后用MFI緩沖液將其質量濃度稀釋至0.5 mg/mL，在540 nm波長處測定其吸光度，MFI緩沖液作對照，將結果乘以200，即為MFI。

1.3.5 感官評價

參考GB/T 14195—1993《感官分析 選拔與培訓感官分析 優選評價員導則》[16]選拔、培訓10 名優選評價員對牦牛排進行感官評價，參照王永祥[17]的方法并略作修改，具體評價指標見表1。使用強制決定法來確定各因素的權重分配方案。計算公式如下：

感官評分＝0.174×色澤＋0.168×組織狀態＋0.182×香氣＋0.252×嫩度＋0.224×滋味

表1 感官評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of yak steak

1.3.6 響應面試驗設計

以氯化鈣質量濃度（A）、木瓜蛋白酶活力（B）、碳酸氫鈉質量濃度（C）和腌制時間（D）為自變量進行單因素試驗。根據單因素試驗結果，以剪切力（Y1）和感官評分（Y2）為響應值，用Design-Expert 8.06進行響應面試驗設計。試驗各因素與水平見表2。

表2 響應面試驗設計因素與水平Table 2 Code and level of independent variables used for response surface optimization

1.4 數據處理

采用IBM SPSS Statistics 22對實驗結果進行均值差異顯著性檢驗：P＜0.05，差異顯著；P＜0.01，差異極顯著。多重比較采用最小顯著差異法。數據以樣品測定結果的表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 各因素對牦牛排嫩化效果的影響

圖1 各因素對牦牛排嫩化效果的影響Fig. 1 Effects of calcium chloride concentration, papain activity,sodium bicarbonate concentration and treatment time on tenderization of yak steak

由圖1可知，當氯化鈣質量濃度在0～10 mg/mL時，牦牛排的剪切力隨著氯化鈣質量濃度的增加而顯著降低（P＜0.05），而MFI值則與氯化鈣質量濃度呈極顯著正相關，相關系數為0.495。氯化鈣質量濃度在10～20 mg/mL時，剪切力顯著增加（P＜0.05），20 mg/mL后趨于平緩，而MFI值則先下降再略有回升，各濃度梯度之間的MFI值變化不顯著（P＞0.05）。但氯化鈣的添加量并非越大越好[18]，試驗發現氯化鈣質量濃度大于20 mg/mL后，牦牛排的色澤及組織狀態被破壞的較為嚴重，出品率也略有下降。酶活力在0～15 U/g范圍內，剪切力隨肉中木瓜蛋白酶活力的增加而顯著降低（P＜0.05），MFI值則呈現顯著增加的趨勢，直至酶活力為15 U/g時趨于穩定。實際中發現當酶活力為25 U/g時，剪切力均值下降為1.742 kg，此時牦牛排的外觀和組織狀態被損壞，口感較差，出現了過度嫩化現象。碳酸氫鈉質量濃度在0～10 mg/mL范圍內時，剪切力稍有上升，但變化不顯著（P＞0.05），MFI值顯著下降（P＜0.05）；碳酸氫鈉質量濃度為10～20 mg/mL時，牦牛排的剪切力顯著降低（P＜0.05），MFI值顯著提高（P＜0.05）；碳酸氫鈉質量濃度大于20 mg/mL時，剪切力和MFI值均趨于平緩。復合嫩化液的腌制時間在0～12 h范圍內，剪切力隨著時間的延長而顯著降低（P＜0.05），MFI值則顯著上升（P＜0.05）。

2.1.2 各因素對牦牛排色澤的影響

圖2 各因素對牦牛排色澤的影響Fig. 2 Effects of calcium chloride concentration, papain activity, sodium bicarbonate concentration and treatment time on color of yak steak

由圖2可知，氯化鈣質量濃度在0～5 mg/mL時，牦牛排的a*值顯著下降（P＜0.05），L*和b*值變化不顯著（P＞0.05）；其在5～15 mg/mL時，L*、a*、b*值差異不顯著（P＞0.05）；而當其大于15 mg/mL時，牦牛排的a*值顯著降低（P＜0.05），這可能是由于氯化鈣溶液的注射改變了肌動蛋白與肌漿球蛋白之間的相互作用，使肉對光的散射作用發生改變[19]。木瓜蛋白酶活力為0～10 U/g時，牦牛排的L*、a*、b*值均無顯著變化（P＞0.05）；酶活力為10～25 U/g時，L*、a*、b*值均呈現先下降后上升的趨勢，這可能是因為酶溶液的添加影響了脫氧肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白和高鐵肌紅蛋白的比例[20]。但綜合以上，木瓜蛋白酶對肉色澤的影響較小。碳酸氫鈉質量濃度在0～10 mg/mL時，牦牛排的L*和b*值呈現顯著下降的趨勢（P＜0.05）；碳酸氫鈉質量濃度大于10 mg/mL時，L*值先上升然后趨于平緩，a*值持續下降，b*值則是先趨于穩定然后開始下降。碳酸氫鈉溶液的添加提高了牦牛排的pH值，增強了線粒體中細胞色素氧化酶的活性，導致鮮紅色的氧合肌紅蛋白轉變為紫紅色的脫氧肌紅蛋白，肌肉呈暗紅色[21]。腌制時間在0～12 h時，隨著腌制時間的延長，肉中的氧合肌紅蛋白被腌制劑氧化為高鐵肌紅蛋白，致使牦牛排的L*值先上升后下降，b*值顯著升高（P＜0.05），腌制時間大于12 h時，牦牛排的L*、a*、b*值均趨于穩定，腌制劑不再對肉的色澤產生影響。

綜合圖1和圖2考慮，最終選取氯化鈣質量濃度10 mg/mL、木瓜蛋白酶活力15 U/g、碳酸氫鈉質量濃度20 mg/mL和腌制時間12 h作為響應面的中心點。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 Box-Behnken試驗結果及模型的建立

根據單因素試驗結果，選取氯化鈣質量濃度（A）、木瓜蛋白酶活力（B）、碳酸氫鈉質量濃度（C）和腌制時間（D）進行4因素3水平的Box-Behnken響應面分析試驗，試驗設計及結果見表3。運用Design-Expert 8.06對表中的數據進行二次多元回歸擬合，分別得到剪切力（Y1）和感官評分（Y2）與4 個嫩化因子A、B、C、D的關系為：

Y1＝4.963 81-0.178 49A-0.292 5B-0.012 06C＋0.018 796D＋0.006 36AB＋0.000 63AC-0.001 912 5AD-0.003 03BC-0.004 95BD-0.001 9CD＋0.004 222 67A2＋0.011 678B2＋0.001 741 92C2＋0.004 488 54D2

Y2＝-10.094 56＋0.429 99A＋0.767 06B＋0.245 33C＋0.727D＋0.002 35AB-0.000 04AC＋0.001 387 5AD-0.001 18BC＋0.001 987 5BD＋0.000 118 75CD-0.024 389A2-0.026 679B2-0.005 521 08C2-0.031 694D2

表3 牦牛排嫩化的Box-Behnken試驗結果Table 3 Box-Behnken design with experimental results

2.2.2 多元回歸模型分析

由表4可知，在本試驗設計的因素水平范圍內，方程的一次項中A、B、C、D對Y1的影響不顯著（P＞0.05），A對Y2的影響顯著（P＜0.05），B、C、D對Y2的影響極顯著（P＜0.01）；二次項B2、C2對Y1的影響極顯著（P＜0.01），A2對Y1的影響顯著（P＜0.05），D2對Y1的影響不顯著（P＞0.05），A2、B2、C2、D2對Y2的影響極顯著（P＜0.01）；交互項中，AB、BC對Y1的影響顯著（P＜0.05），對Y2的影響極顯著（P＜0.01），AC、AD、BD、CD對Y1和Y2的影響均不顯著（P＞0.05）。因此，各試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。

由表4可知，兩個回歸模型均為極顯著水平（P＜0.01）且失擬檢驗不顯著（P＞0.05），決定系數R2分別為0.858 1和0.996 4，校正決定系數R2Adj為0.816 1和0.992 8，證明模型與實際結果擬合良好；離散系數表示試驗的精確度，數值越大，表明試驗的可靠性越差[22]，本試驗Y1和Y2模型的離散系數值分別為5.28%和1.06%，說明模型能較好的反應真實值。總體而言，回歸模型能夠準確分析和預測復合嫩化體系下牦牛排的剪切力和感官評分。

表4 牦牛排嫩化二次多項式模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of quadratic polynomial models

2.2.3 響應面試驗中各因素的交互效應分析

響應面圖是響應值與各因素所構成的三維空間曲面圖[23]。響應面圖曲面坡度陡峭、等高線密集成橢圓形表示兩因素交互影響大，而坡度平緩、等高線呈圓形則與之相反[24]。根據得到的二次多項式回歸方程，利用Design-Expert 8.06對表4中的數據進行多元回歸擬合，得到交互作用的響應面圖。

由圖3可知，剪切力最低的點位于等高線的中心區域。在選定的因素水平范圍內，4 個因素對Y1的影響均不顯著（P＞0.05）。當C和D分別為20 mg/mL和12 h時，A與B的交互作用對Y1有顯著影響（P＜0.05），Y1呈現明顯的先降低后升高的趨勢；當A和D固定為10 mg/mL和12 h時，B和C的交互作用顯著影響（P＜0.05）剪切力，響應面呈現先迅速下降后緩慢回升的趨勢；其余4 組的交互作用對剪切力并無顯著影響（P＞0.05）。總體可知，當3 個因素數值一定時，變量因素呈現較為明顯的先升后降的趨勢。

圖3 各因素對剪切力影響的響應面圖Fig. 3 Response surface graphs showing the interactive effect of various factors on shear force

圖4 各因素對感官評價得分的響應面圖Fig. 4 Response surface graphs showing the interactive effect of various factors on sensory evaluation score

由圖4可以看出，當碳酸氫鈉質量濃度和腌制時間固定為20 mg/mL和12 h時，A與B的交互作用極顯著影響（P＜0.01）牦牛排的感官評分。氯化鈣質量濃度較低時，腌制劑對肉的嫩化作用不明顯，而氯化鈣溶液的添加量過大時，肉的pH值下降，使得木瓜蛋白酶的作用效率下降，肉的嫩度變差，感官評分下降。當氯化鈣質量濃度和腌制時間固定為10 mg/mL和12 h時，B和C的交互作用對感官評分有極顯著影響（P＜0.01），這可能是由于碳酸氫鈉溶液通過調節腌制劑的pH值影響了木瓜蛋白酶的作用效率，從而降低了肉的感官評分。其他交互作用的影響不顯著（P＞0.05）。從圖4也可知，有3 個因素固定時，感官評分隨另一個因素的增加而增加，達到最高點后急劇下降。

剪切力越低，感官評分越高，證明復合嫩化體系越顯著地改善了牦牛排的嫩度。因此，選定剪切力低和感官評分高為條件聯立兩個方程并對各變量求導，得出各因素嫩化牦牛排的最佳使用量為：氯化鈣質量濃度10.19 mg/mL、木瓜蛋白酶活力14.94 U/g、碳酸氫鈉質量濃度20.95 mg/mL、腌制時間12.32 h。在此條件下，牦牛排的剪切力預測值為1.758 kg，感官評分預測值為4.67。

2.3 驗證實驗

為證實結果能有效的改善牦牛排嫩度，對得到的最佳嫩化條件處理牦牛排，并做6 次平行實驗。最終得到的實際結果為：剪切力1.801 kg，感官評分4.61；相對偏差分別為2.45%和1.07%。證明本實驗得出的結果可以顯著改善牦牛排的嫩度，而且避免了氯化鈣或木瓜蛋白酶過量使用而引起的肉質、色澤被破壞等問題，有很好的應用前景。

3 討論與結論

嫩化劑使用一直是肉類研究領域的熱點。作為一種常見的鹽類，氯化鈣主要通過增加肉中Ca2＋濃度改善牦牛肉的嫩度。牛肉細胞中含有可分解肌原纖維蛋白的酶，它的活性由Ca2＋調控，隨著Ca2＋濃度的增加，鈣激活酶的活性中心暴露，活性增加，降低內源蛋白酶激活中性蛋白酶抑制劑的活性，從而使α-肌動蛋白從Z線消失。鈣激活酶還可降解其他蛋白，使肌肉的伸張力減弱，促進粗細肌微絲釋放游離[25]，肉質變嫩。但有研究表明，Ca2＋濃度過大時，反而會抑制酶的活性，而且使肉的色澤變差，失水嚴重，感官評分下降。從本研究可以看出，氯化鈣使用量較少時，可以明顯改善牦牛排嫩度；但用量大于15 mg/mL時，肉的剪切力略有回升，感官評分下降嚴重，可能是因為高濃度鹽使得肉樣失水嚴重，保水性下降，嫩度變差[26]。而木瓜蛋白酶是一種天然生物酶制劑，其作用主要集中于Z線上，使Z線斷裂，肌原纖維出現小片化。因木瓜蛋白酶和氯化鈣的嫩化途徑不同，其和氯化鈣復合使用時，可以有效地降低氯化鈣的用量，在改善嫩度的同時保持牦牛排色澤、多汁性及組織狀態不受破壞。但一些研究發現，木瓜蛋白酶的過量使用，會使肉老化嚴重，風味出現異常[27-28]。通過本實驗也發現，當木瓜蛋白酶的用量大于20 U/g時，牦牛排的感官評分急劇下降，剪切力也開始回升，這可能是由于酶的增加導致肌原纖維間的空隙太大而不能保持水分。碳酸氫鈉不僅能提高肉的持水力，其溶解于水中呈現的弱堿性還可以適當提高牦牛肉的pH值，提高木瓜蛋白酶的嫩化效率，降低酶用量。本研究也發現，通過氯化鈣、木瓜蛋白酶和碳酸氫鈉的復合使用，不僅改善了牦牛排的嫩度，還穩定了色澤和組織狀態等感官指標。

牦牛排嫩化效果的評價指標也會影響各因素使用條件的篩選[27]。本研究還選取了MFI作為條件優化的驗證指標。MFI值越高，表明肌原纖維小片化程度越高，肉的嫩度越好。本研究的目的是改善牦牛排嫩度的同時提升消費者的感官感受，過于追求剪切力的降低和MFI值的提升可能會適得其反。因此，在優化牦牛排嫩度的同時必須引入色度變化和感官評分這一指標，通過色澤、風味、組織狀態等因素的變化來改正由于剪切力過低造成的品質降低問題，確保實驗得出的最佳優化工藝具有實際意義。

氯化鈣、木瓜蛋白酶或碳酸氫鈉單獨作為肉制品嫩化劑的研究較多。楊敏等[29]在4 ℃條件下用氯化鈣溶液浸泡處理宰后牦牛肉，以剪切力和MFI值為評價指標，確定在氯化鈣質量分數4%、處理時間2 d時可以獲得最佳的嫩化效果。Milligan等[30]給牛大腿內側肌肉注射氯化鈣溶液，結果顯示肉的嫩度與口感較對照組明顯提高。此外，李劼等[31]采用不同碳酸氫鈉濃度對牛肉進行處理，證明肉質量的0.4%碳酸氫鈉處理對醬牛肉的嫩化有一定效果。許道光等[8]分析了不同氯化鈉和碳酸氫鈉復合處理對牛肉品質的影響，結果顯示5%氯化鈉和5%碳酸氫銨溶液的組合能明顯增加肉的嫩度，降低失水率。Kemp等[6]探究了單獨使用木瓜蛋白酶的最佳條件。本研究表明，在氯化鈣、木瓜蛋白酶和碳酸氫鈉復合使用下，氯化鈣質量濃度10.19 mg/mL、酶活力14.94 U/g、碳酸氫鈉質量濃度20.95 mg/mL時，剪切力、MFI值和感官評分最佳。與上述研究對比，本實驗中氯化鈣和木瓜蛋白酶的用量分別下降了74.53%和70.12%，這主要是因為三者的復配使用，能夠通過不同的嫩化途徑改善牦牛排的嫩度，大大提高了嫩化效率，提高了肉的感官評價得分。通過建立氯化鈣、木瓜蛋白酶和碳酸氫鈉三者相結合的嫩化體系，不僅避免了由于氯化鈣和酶使用過量而造成的肉質變老，風味異常等問題，還節約了嫩化成本。

綜上可知，氯化鈣、木瓜蛋白酶和碳酸氫鈉的復配使用可以明顯改善原切牦牛排嫩度。本研究通過響應面回歸設計最終確定的最佳嫩化條件為：氯化鈣質量濃度10.19 mg/mL、木瓜蛋白酶活力14.94 U/g、碳酸氫鈉質量濃度20.95 mg/mL、腌制時間12.32 h。此條件下，剪切力預測值為1.758 kg，感官評分預測值為4.67，整體上較滿意，且驗證結果與預測值擬合良好。本試驗體系還降低了氯化鈣和木瓜蛋白酶的用量，提高了產品的感官評分，為工廠大規模生產牦牛排提供了有效依據。