響應面法優(yōu)化褶牡蠣多糖多肽聯(lián)產(chǎn)工藝

楊大俏，王錦旭，李來好*，楊賢慶，馬海霞，岑劍偉，王悅齊

（1.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306；3.韓山師范學院食品工程與生物科技學院，廣東 潮州 521041）

牡蠣俗稱蠔或海蠣子，具有很高的藥用價值[1-2]，富含鋅、鐵、鈣等元素，素有“海洋牛奶”之稱[3]。褶牡蠣（Alectryonella plicatulaGmelin）分布于中國南部海域，是一種高蛋白高碳水化合物的重要經(jīng)濟貝類，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)褶牡蠣具有較強的體外抗氧化活性及體內(nèi)抗疲勞特性[3]，但是目前中國對牡蠣產(chǎn)品除直接食用外，大多通過簡單加工直接進入食品市場，產(chǎn)品附加值不高[4]，牡蠣產(chǎn)業(yè)發(fā)展受到制約。相關研究報道顯示牡蠣多糖[5]具有抗腫瘤、降糖、增強免疫力等功能[6]；天然海洋活性多肽具有較高的穩(wěn)定性[7-8]，但是海洋魚蝦貝類中的生物活性肽的研究尚處于實驗室階段[9-12]。國內(nèi)外對牡蠣的研究主要集中于多肽的活性和序列分析，少量研究針對于牡蠣多糖的提取工藝和結構研究[13-14]，而關于聯(lián)產(chǎn)制備牡蠣多糖多肽的研究較少。本研究旨在得到同時提取褶牡蠣中功能多糖和活性多肽的工藝，達到褶牡蠣多糖和多肽聯(lián)產(chǎn)制備[15-16]，以提高褶牡蠣利用率。

本實驗以褶牡蠣全臟器為原料，采用單因素試驗研究胰蛋白酶添加量、酶解時間及料液比對多糖多肽聯(lián)產(chǎn)制備的影響，在此基礎上進一步通過響應面法[17-19]分析各因素及其交互作用對多肽質(zhì)量分數(shù)、總糖質(zhì)量分數(shù)、水解度及酸性糖質(zhì)量分數(shù)[20-21]的影響，并最終得到最優(yōu)多糖多肽聯(lián)產(chǎn)工藝條件，以期為連續(xù)膜分離聯(lián)產(chǎn)制備褶牡蠣多糖及多肽的中試化放大生產(chǎn)提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

褶牡蠣全臟器（于-20 ℃冷凍保藏備用）來源于廣東省潮州市。

堿性蛋白酶（210 AU/mg）、木瓜蛋白酶（≥800 U/mg）、胰蛋白酶（≥250 U/mg）、菠蘿蛋白酶（≥500 U/mg）、胃蛋白酶（≥10 000 NFU/mg）、中性蛋白酶（≥100 U/mg）廣州齊云生物技術有限公司；甘氨酸、氯化鈉、氫氧化鈉、無水乙醇、三氯乙酸、苯酚、無水硫酸銅、甲醛、鹽酸、濃硫酸（均為分析純） 廣州佳研生物科技有限公司；硫酸軟骨素、葡萄糖、Gly-Gly-Tyr-Arg（標準品）、1,9-二甲基亞甲基藍 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

JS30-230攪拌機 蘇泊爾股份有限公司；T50均質(zhì)機德國IKA公司；Sunrise-basic吸光酶標儀 瑞士Tecan公司；ZDJ-4A雷磁自動電位滴定儀 上海儀電科學儀器股份有限公司；三聯(lián)高壓平板膜設備 廈門福美科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 聯(lián)產(chǎn)提取工藝

褶牡蠣全臟器→勻漿→均質(zhì)10 min→熱水浸提→調(diào)pH 8.0→酶解→煮沸滅酶→離心→上清液調(diào)pH 7.0→0.22 μm濾膜除雜→200 kDa膜分離→收集濾過液與截留液→濾過液經(jīng)8 kDa膜分離[22]→收集8 kDa以下濾過液（粗多肽）、8 kDa以上截留液（粗多糖）→凍干得粗多肽、粗多糖。

操作要點：熱水浸提：將牡蠣勻漿與水混勻后在55 ℃水浴0.5 h；離心：將經(jīng)過煮沸滅酶后的牡蠣酶解液9 000 r/min離心10 min；0.22 μm微濾條件：操作壓力0.12 MPa，操作溫度10 ℃；8 kDa膜分離超濾條件：操作壓力1.05 MPa，操作溫度10 ℃；200 kDa膜分離超濾條件：操作壓力0.5 MPa，操作溫度10 ℃；凍干：旋轉蒸發(fā)溫度55 ℃。

1.3.2 蛋白酶種類選擇

以褶牡蠣全臟器為原料，勻漿均質(zhì)、熱水浸提后分別按照質(zhì)量分數(shù)0.2%添加堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶及中性蛋白酶6 種酶，分別在6 種酶的最適條件下（pH 8.0、6.0、8.0、7.0、4.0、7.0，溫度55 ℃）單酶酶解80 min，酶解液9 000 r/min離心10 min，取上清液測定多肽質(zhì)量分數(shù)及水解度，酶解液上清液pH值調(diào)至中性，加入無水乙醇至終體積分數(shù)為65%，4 ℃醇沉24 h，過濾取沉淀，丙酮洗滌3 次，干燥后配制成溶液檢測酸性糖及總糖質(zhì)量分數(shù)。以酶解液中多肽、總糖及酸性糖質(zhì)量分數(shù)的極大值為指標，判定最佳酶種類（水解度作參考指標）。

1.3.3 褶牡蠣肉多糖多肽聯(lián)產(chǎn)工藝的單因素試驗

1.3.3.1 酶添加量對褶牡蠣肉多糖多肽聯(lián)產(chǎn)工藝的影響

取50.0 g褶牡蠣全臟器勻漿均質(zhì)后，加入150 mL去離子水，于55 ℃熱水浸提0.5 h，調(diào)節(jié)pH 8.0，分別加入質(zhì)量分數(shù)0.1%、0.2%、0.3%、0.4%及0.5%的胰蛋白酶，在55 ℃酶解80 min。酶解后煮沸滅酶，離心取適量上清液測量水解度以及多肽質(zhì)量分數(shù)，調(diào)節(jié)pH 7.0，加入無水乙醇至終體積分數(shù)為65%，4 ℃醇沉24 h，過濾取沉淀，丙酮洗滌3 次，干燥后配制成溶液檢測酸性糖質(zhì)量分數(shù)以及總糖質(zhì)量分數(shù)。以酶解液中多肽、總糖及酸性糖質(zhì)量分數(shù)的極大值為指標，判定最佳酶添加量（水解度作參考指標）。

1.3.3.2 酶解時間對褶牡蠣肉多糖多肽聯(lián)產(chǎn)工藝的影響

在胰蛋白酶添加量0.2%、料液比1∶3（g/mL）的情況下，分別酶解20、40、60、80 min及100 min。以酶解液中多肽、總糖及酸性糖質(zhì)量分數(shù)的極大值為指標，判定最佳酶解時間（水解度作參考指標）。

1.3.3.3 料液比對褶牡蠣肉多糖多肽聯(lián)產(chǎn)工藝的影響

在酶解時間80 min、胰蛋白酶添加量0.2%條件下，分別按照1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5（g/mL）的料液比添加去離子水。以酶解液中多肽、總糖及酸性糖質(zhì)量分數(shù)的極大值為指標，判定最佳料液比（水解度作參考指標）。

1.3.4 響應面法優(yōu)化褶牡蠣肉多糖多肽聯(lián)產(chǎn)工藝

通過單因素試驗[23]確定選取酶添加量、酶解時間、料液比3 個因素進行編碼[14]，以多肽、酸性糖和總糖質(zhì)量分數(shù)作為響應值，試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.5 指標測定

多肽質(zhì)量分數(shù)的測定采用三氯乙酸沉淀法[24]；總糖質(zhì)量分數(shù)的測定采用苯酚-硫酸法[25]；水解度的測定依照甲醛滴定法[26-27]；酸性糖質(zhì)量分數(shù)的測定采用1,9-二甲基亞甲基藍法[28]。

1.3.6 水解度及含量計算公式

式中：C1為滴定氫氧化鈉濃度/（mol/L）；V1為1 mL酶解液消耗氫氧化鈉體積/L；V0為所得酶解液總體積/mL；M為—NH2摩爾質(zhì)量/（g/mol）；M0為所用褶牡蠣全臟器質(zhì)量/g；C0為褶牡蠣全臟器蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)/%。

式中：C為褶牡蠣酶解液中多肽質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為所得褶牡蠣酶解液上清液的體積/mL；M為所用褶牡蠣全臟器的質(zhì)量/mg。

式中：C為褶牡蠣酶解液中酸性糖質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為所得褶牡蠣酶解液上清液的體積/mL；M為所用褶牡蠣全臟器的質(zhì)量/mg。

式中：C為褶牡蠣酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；D為褶牡蠣酶解液上清液的稀釋倍數(shù)；V為所得褶牡蠣酶解液上清液的體積/mL；M為所用褶牡蠣全臟器的質(zhì)量/mg。

1.3.7 多糖、多肽得率計算公式

式中：M1為多糖、多肽凍干品質(zhì)量/g；M2為500 g褶牡蠣全臟器勻漿干質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以上實驗均經(jīng)過3 次重復操作，采用IBM SPSS Statistics 20.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)值采用的形式表現(xiàn)，運用單因素方差分析（ANOVA）檢測平均值顯著性。

2 結果與分析

2.1 酶種類及添加量選擇

圖1 6 種酶對褶牡蠣勻漿各指標的影響Fig. 1 Comparison of hydrolysis efficiencies of A. plicatula with six proteases

由圖1可知，經(jīng)過胰蛋白酶水解的褶牡蠣酶解液中水解度、多肽、總糖及酸性糖質(zhì)量分數(shù)最高，故選擇胰蛋白酶酶解褶牡蠣勻漿，以期同時得到所需多糖多肽。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 酶添加量對褶牡蠣多糖多肽聯(lián)產(chǎn)的影響

如圖2所示，水解度隨酶添加量的增多逐漸升高，酶添加量0.2%以上數(shù)值間存在顯著性差異（P＜0.05）；多肽、總糖及酸性糖質(zhì)量分數(shù)隨酶添加量的增加均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，并在胰蛋白酶添加量為0.2%時達到最大值（P＜0.05），故最佳酶添加量為0.2%。

圖2 胰蛋白酶添加量對褶牡蠣多糖多肽聯(lián)產(chǎn)的影響Fig. 2 Effects of trypsase addition amount on production of polysaccharides and polypeptides from A. plicatula

2.2.2 酶解時間對褶牡蠣多糖多肽聯(lián)產(chǎn)的影響

圖3 胰蛋白酶酶解時間對褶牡蠣多糖多肽聯(lián)產(chǎn)的影響Fig. 3 Effects of hydrolysis time on production of polysaccharides and polypeptides from A. plicatula

如圖3所示，水解度隨酶解時間的延長逐漸升高，各數(shù)值間存在顯著性差異（P＜0.05）；多肽、總糖及酸性糖質(zhì)量分數(shù)隨酶解時間延長而先增大后減小，并在酶解時間為80 min時達到最大值（P＜0.05），故胰蛋白酶最佳酶解時間為80 min。

2.2.3 料液比對褶牡蠣多糖多肽聯(lián)產(chǎn)的影響

圖4 料液比對褶牡蠣多糖多肽聯(lián)產(chǎn)的影響Fig. 4 Effects of solid-to-water ratio on production of polysaccharides and polypeptides from A. plicatula

如圖4所示，隨溶劑用量增大，水解度逐漸減小；多肽、總糖及酸性糖質(zhì)量分數(shù)隨溶劑用量的增大呈現(xiàn)先增加后減小，并在料液比1∶3時達到最大值（P＜0.05），故選擇最佳料液比為1∶3（g/mL）。

2.3 響應面試驗結果

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

由圖2～4可知，在不同酶添加量、酶解時間及料液比下，褶牡蠣酶解液的多肽、總糖及酸性糖質(zhì)量分數(shù)均呈先增高后降低趨勢，且水解度達到12%左右，可以同時得到較高含量的多肽、總糖及酸性糖，故而在單因素試驗的基礎上，根據(jù)Box-Behnken設計原理，選取酶添加量（A）、酶解時間（B）、料液比（C）作為3因素，并以具有顯著性差異的多肽質(zhì)量分數(shù)（Y1）、總糖質(zhì)量分數(shù)（Y2）、水解度（Y3）、酸性糖質(zhì)量分數(shù)（Y4）作為響應值，試驗方案及結果見表2。

運用Design-Expert 8.0.5.0軟件對實驗結果進行回歸擬合，得到的回歸方程如下：

為檢驗上述方程的有效性，運用Design-Expert 8.0.5.0軟件對上述結果進行數(shù)據(jù)分析，可信度分析見表3，方差分析結果見表4。4 種響應值的可信度分析的模型相關系數(shù)R2分別為0.98、0.99、0.97、0.78，前3 種響應值的模型相關系數(shù)都接近于1，表示Y1、Y2、Y3模型相關度很好；變異系數(shù)分別為1.63%、1.46%、1.44%、10.03%，數(shù)值越小表明置信度越好，說明該數(shù)學模型的對Y1、Y2、Y3的置信度極高，對響應值Y4的置信度較高，該模型可以較好地反映試驗的真實值[29]。由表4可知，對于多肽質(zhì)量分數(shù)、總糖質(zhì)量分數(shù)、水解度和酸性糖質(zhì)量分數(shù)4 個響應值，該模型的F值分別為70.52、149.70、52.51、7.34，P值均小于0.01，可以判斷該模型是極顯著的；同時4 個響應值的模型失擬項P值均大于0.05，說明模型失擬項不顯著。綜上所述，該回歸模型對4 個響應值的擬合程度較好，試驗誤差小。

表3 模型的可信度分析Table 3 Reliability analysis of models

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Analysis of variance (ANOVA) of regression equations

續(xù)表4

利用此模型可擬合出對4 個響應值相應的響應面分析圖，其三維圖形是響應值對試驗因素（單因素變量）所構成的三維空間曲面圖，當因素交互作用時，三維曲面圖可直觀看出響應值的變化趨勢[30]。二維等高線圖則進一步總結出各個變量間的交互作用并確定最優(yōu)點。圖5a中，隨著酶添加量和酶解時間水平的增加，多肽質(zhì)量分數(shù)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，且其二維等高線圖偏圓形，判斷兩個因素之間的交互作用不顯著；圖5b中，隨著酶添加量和料液比水平的增加，多肽質(zhì)量分數(shù)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，等高線圖偏圓形，說明兩因素之間交互作用不顯著；圖5c中，隨著酶解時間和料液比水平的增加，多肽質(zhì)量分數(shù)先增加后降低，其等高線圖偏橢圓形，表明兩個因素之間有一定的交互作用。結合表4可知，3因素對多肽質(zhì)量分數(shù)影響力為：酶解時間＞料液比＞酶添加量。

圖5 酶添加量、酶解時間和料液比交互作用對褶牡蠣多肽提取的影響Fig. 5 Interactive effects of enzyme dosage, hydrolysis time and solidto-water ratio on the yield of polypeptides from A. plicatula

圖6 a中，隨著酶添加量的增加和酶解時間的延長，總糖質(zhì)量分數(shù)呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，其等高線圖偏橢圓形，判斷兩個因素之間有一定的交互作用；圖6b中，隨著酶添加量和料液比水平的增加，總糖質(zhì)量分數(shù)先增加后減小，兩者的等高線圖偏橢圓形，說明兩者有一定的交互作用；圖6c中，隨著酶解時間和料液比水平的增加，總糖質(zhì)量分數(shù)同樣先增加后降低，且兩因素的交互作用較弱。綜合圖6可以看出對總糖提取，3 種因素之間交互作用不顯著。結合表4可知，3因素對總糖含量影響力為：酶添加量＞酶解時間＞料液比。

圖6 酶添加量、酶解時間和料液比交互作用對褶牡蠣總糖提取的影響Fig. 6 The interactive effects of enzyme dosage, hydrolysis time and liquid-solid ratio on the yield of total-sugar from A. plicatula

圖7 a中，隨著酶添加量和酶解時間水平的增加，水解度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，且其二維等高線圖偏橢圓形，判斷兩個因素之間有一定的交互作用；圖7b中，隨著酶添加量的增加，水解度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢；隨著料液比水平的增加水解度逐漸降低，與單因素試驗結果一致。圖7c中，隨著酶解時間的延長，水解度先增加后降低；隨著料液比水平的增加水解度逐漸降低，其等高線圖表明兩個因素之間無交互作用。結合表4可知，3因素對水解度影響力為：酶添加量＞料液比＞酶解時間。

圖7 酶添加量、酶解時間和料液比兩兩交互作用對褶牡蠣水解度的影響Fig. 7 The interactive effects of enzyme dosage, hydrolysis time and liquid-solid ratio on the degree of hydrolysis from A. plicatula

圖8 a中，隨著酶添加量和酶解時間水平的增加，酸性糖質(zhì)量分數(shù)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，且其二維等高線圖偏橢圓形，判斷兩個因素之間有交互作用顯著；圖8b中，隨著酶添加量和料液比水平的增加，水解度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，其二維等高線圖偏橢圓形，表明兩個因素之間交互作用顯著。圖8c中，隨著酶解時間的延長和料液比水平的增加，酸性糖先增加后降低，其等高線圖表明兩個因素之間交互作用顯著。結合表4可知，3因素對酸性糖質(zhì)量分數(shù)影響力為：料液比＞酶添加量=酶解時間。

圖8 酶添加量、酶解時間和料液比兩兩交互作用對褶牡蠣酸性糖提取的影響Fig. 8 Interactive effects of enzyme dosage, hydrolysis time and solidto-water ratio on the yield of glycosaminoglycan from A. plicatula

經(jīng)Design-Expert 8.0.5.0軟件分析可得最佳工藝條件為添加胰蛋白酶0.21%、酶解時間79.26 min、料液比1∶3.08（g/mL），相應的響應面二次模型預測多肽質(zhì)量分數(shù)為86.31%，總糖質(zhì)量分數(shù)為31.40%，水解度為11.79%，酸性糖質(zhì)量分數(shù)為2.07%。為驗證該響應面法的可行性，考慮到實際操作問題，選取最佳提取工藝為胰蛋白酶添加量0.2%、酶解時間80 min、料液比1∶3（g/mL），重復3 次實驗得到褶牡蠣酶解液中多肽質(zhì)量分數(shù)為（85.14±1.67）%，總糖質(zhì)量分數(shù)為（28.35±2.72）%，水解度為（11.12±0.61）%，酸性糖質(zhì)量分數(shù)為（1.60±0.10）%，與回歸方程預測值相近，說明褶牡蠣多糖多肽聯(lián)產(chǎn)工藝是可行的，并在此條件開展以下實驗。

取500.0 g褶牡蠣勻漿，按照所得最佳工藝酶解褶牡蠣，經(jīng)過超濾膜分離酶解上清液，得粗多糖制品和粗多肽制品，重復3 次，粗多糖凍干品（19.11±0.41）g，得率為（2 9.3 9±0.4 1）%；粗多肽凍干品（23.93±0.74）g，得率為（36.81±0.47）%。得率與褶牡蠣干粉中總糖質(zhì)量分數(shù)及蛋白質(zhì)含量相近，判斷其可用于聯(lián)產(chǎn)制備褶牡蠣多糖及多肽制品。

另外，經(jīng)過8 kDa超濾膜超濾分離后，使用三氯乙酸沉淀法、苯酚-硫酸法、1,9-二甲基亞甲基藍法測定各濃縮凍干粉，其顏色反應證實8 kDa超濾膜分離效果良好，可用于褶牡蠣多糖多肽聯(lián)產(chǎn)工藝。

3 結 論

通過響應面法建立3 種影響因素酶添加量、酶解時間及料液比與4 個響應值多肽質(zhì)量分數(shù)、總糖質(zhì)量分數(shù)、水解度及酸性糖質(zhì)量分數(shù)相互作用的模型，得出褶牡蠣多糖多肽聯(lián)產(chǎn)的最優(yōu)工藝為勻漿褶牡蠣全臟器后，添加3 倍體積水，55 ℃水浴0.5 h，調(diào)節(jié)pH 8.0，添加質(zhì)量分數(shù)為0.2%的胰蛋白酶，酶解80 min，即可得到最大含量的褶牡蠣多糖與多肽。本研究具有高效、簡潔、生物友好性等特點，為褶牡蠣活性多糖和多肽的聯(lián)產(chǎn)制備提供了理論依據(jù)，為企業(yè)創(chuàng)造更大的經(jīng)濟效益，實現(xiàn)褶牡蠣資源的綜合利用。