超聲波輔助法制備牛骨源檸檬酸鈣的工藝優化

單媛媛，劉葉虹萱，代雨柔，周 元，伊揚磊，王 欣，劉變芳，呂 欣*

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

我國是畜牧業大國，畜禽的生產總量居世界前列，近年來，隨著人們對肉類食品消費量的增多，畜骨產量也在急劇增加，尤其牛骨產量增長幅度最大[1]。牛骨占牛活體質量的6%～12%，主要特點是脂肪含量低，但蛋白質及鈣、磷、鐵等礦物質含量豐富，在食品醫藥方面具有廣泛的潛在用途[2]。但在目前牛骨消費市場，除排骨和腔骨以原料的形式直接上市消費外，不宜食用或口感較差的部分由于價格低及貯存不便，往往加工成飼料或肥料等附加值較低的產品或直接被廢棄，造成了極大的資源浪費和環境污染[3-4]。因此，充分利用骨類資源，開發高附加值產品，對食品行業，尤其是肉類加工業的健康發展具有重要意義。

牛骨的化學組成受品種、年齡、飼養條件等多種因素的影響，變化較大，但硬骨的組成相對穩定，硬骨中70%左右為以鈣鹽為主的礦物質，98%以上的鈣鹽為磷酸鈣和碳酸鈣，因此動物骨骼是天然的補鈣源[5]。由于牛骨中富含鈣磷，因而將其制成骨泥和骨粉作為鈣磷添加劑是利用骨資源的重要途徑[3]，但是由于骨骼鈣的羥基磷灰石水溶性極差，并且骨鈣通常與膠原纖維結合，使得骨粉中離子型鈣含量甚微[6]，如果直接食用骨泥或骨粉，鈣的吸收利用率非常低，必須經過加工處理才能有效利用其中的鈣。目前報道的提高骨鈣溶解度方法主要有酸解法、堿解法、酶解法和微生物發酵法等[7-9]，這些方法可以在一定程度上提高骨鈣的溶出率，但是酸堿水解法會導致牛骨中蛋白質的不可逆變性，其中效果較好的微生物發酵法中游離鈣的轉化率較低，僅為36.9%。近年來也有利用高壓脈沖電場[4,10-11]、感應電場輔助技術[12]等高新技術進行骨鈣溶出的研究，效果較好，但是需要特殊的設備。超聲波技術作為加速有機反應的重要手段，具有機械效應、熱效應和空化效應[13]，理論上可以破壞骨膠原與羥基磷灰石的結合，加速溶質的擴散，促進有效物質的溶出，提高反應速率。超聲波輔助法在生物活性物質的提取制備[14-17]、蛋殼源有機鈣的轉化[18-21]等方面已有廣泛的應用，但在畜禽骨骼有機鈣的轉化方面的應用報道很少。

鈣是人體不可或缺的重要營養素，目前市場上的鈣制劑種類很多，但均存在一定的局限性。作為新一代鈣源，檸檬酸鈣是一種無臭無味的白色粉末，它的吸收效率為普通碳酸鈣的2.6 倍，對腸胃刺激較小[22]，可以在醫藥行業用作人和動物的補鈣劑，診治骨質疏松癥[23-24]；在食品工業，檸檬酸鈣也是一種安全的食品添加劑、緩沖劑及酸度調節劑；檸檬酸鈣還被認為是最具有潛在市場價值的飼料添加劑而用于水產養殖中[25-26]。此外，檸檬酸鈣能保證飼料不吸潮，并有效改良飼料風味，提升動物進食量，緩解動物對激烈現象做出的反應，還能對動物體形和肉色進行改良，使肉的品質得到提高。因此將牛骨中的羥基磷灰石轉化成易于被人體吸收的檸檬酸鈣具有廣闊的應用前景。

本研究目的是探索一種利用超聲輔助直接中和法制備牛骨源檸檬酸鈣的新工藝，提高鈣的轉化效率，縮短反應時間，提供鈣補充劑的同時解決廢棄牛骨造成的環境污染問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃牛長骨 西北農林科技大學菜市場；檸檬酸（食品級） 西北農林科技大學食品學院食品工藝研究室；NaOH、鹽酸、硝酸、碳酸鈣、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）-Na2（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LDP-1000A型高速多功能粉碎機 浙江永康市紅太陽機電有限公司；電熱恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司；SHB-D(Ⅲ)循環水多用真空泵 河南省泰斯特儀器有限公司；R100型磁力攪拌器 上海佑科儀器儀表有限公司；超聲波細胞粉碎機、SB-5200DTD超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-S數顯恒溫水浴鍋 常州市國立實驗設備研究所。

1.3 方法

1.3.1 牛骨預處理

牛長骨清洗后粗碎成10～20 cm大小的骨塊，然后把骨塊在0.1 MPa、121 ℃條件下蒸煮1 h。煮后的骨塊置于烘箱中40 ℃鼓風干燥4 h后用多功能粉碎機粉碎，過150 目篩備用。

1.3.2 超聲輔助法制備牛骨源檸檬酸鈣的工藝流程

稱取一定量的牛骨粉置于燒杯中，加入一定比例的檸檬酸溶液，放入超聲波細胞粉碎機中按照預先設定參數進行超聲反應，其中超聲3 s，間歇5 s。待反應完成進行抽濾，濾液加熱濃縮、干燥后用研缽碾碎，用細網紗布過濾后即得白色粉末狀檸檬酸鈣。

1.3.3 鈣離子化效率測定

參考文獻[4]的方法略作改進。即加入檸檬酸反應結束后的濾液定容到50 mL，取5 mL溶液到250 mL錐形瓶中，加蒸餾水稀釋至50 mL。加氫氧化鈉調節溶液pH值至11～12之間，滴加2～3 滴鈣離子指示劑（鉻藍黑R），溶液變為酒紅色后緩慢滴加EDTA-Na2溶液，邊滴邊搖勻，當溶液從酒紅色變為藍色且30 s不褪色即為滴定終點，記錄所消耗的EDTA-Na2的量，同時以蒸餾水為空白對照，記錄消耗EDTA-Na2的量。離子鈣溶出率按照式（1）計算：

式中：CEDTA為EDTA-Na2溶液的濃度/（mol/L）；V為樣品滴定時消耗EDTA-Na2體積/L；V0為空白對照消耗EDTA-Na2體積/L；β為稀釋倍數，10；m為骨粉的質量/g；α為骨粉中鈣的質量分數/%。

1.3.4 檸檬酸鈣的純度和轉化率的測定[27]

采用減量法精確稱量檸檬酸鈣粉末質量m1，定容于100 mL容量瓶，每次取20 mL溶液于250 mL錐形瓶中，加入20 mL蒸餾水，再用1 mol/L NaOH溶液調pH值至11～12，隨后滴加鈣指示劑搖勻。用EDTA標準液小心滴定樣品溶液，至酒紅色完全褪去，溶液呈純藍色，且30 s不褪色為滴定終點，記錄消耗EDTA標準液的體積V。同時以蒸餾水為空白對照，記錄消耗EDTA標準液的毫升數記為V0。檸檬酸鈣純度按式（2）計算：

式中：V為樣品滴定時消耗EDTA-Na2體積/L；V0為空白對照消耗EDTA-Na2體積/L；CEDTA為EDTA-Na2溶液的濃度/（mol/L）；V總為檸檬酸鈣溶液的總體積/L；V滴為參加滴定的檸檬酸鈣溶液體積/L；M為檸檬酸鈣的摩爾質量/（g/mol）；m1為檸檬酸鈣粉末的質量/g。

檸檬酸鈣轉化率按照式（3）計算：

式中：m0為檸檬酸鈣粗粉的質量/g；m為骨粉的質量/g。

1.3.5 單因素試驗

超聲輔助制備牛骨源檸檬酸鈣的過程中影響鈣轉化率的因素較多，如超聲功率、時間、溫度、料酸比、料液比等。以離子鈣溶出率為衡量指標，采用單因素試驗考察上述因素對離子鈣溶出率的影響，每個水平重復3 次。

1.3.5.1 超聲功率對牛骨鈣溶出率的影響

在固定料液比為1∶15（g/mL）、料酸比（牛骨粉與檸檬酸的質量比，下同）1∶1.5、超聲溫度30 ℃、超聲時間10 min的條件下，考察超聲功率（0、50、100、150、200、250、300、350、400 W）對牛骨離子鈣溶出率的影響。

1.3.5.2 超聲時間對牛骨鈣溶出率的影響

在固定料酸比1∶1.5、料液比1∶15（g/mL）、超聲功率250 W、超聲溫度30 ℃、超聲10 min的條件下，考察超聲時間（0、5、10、15、20、25、30 min）對牛骨離子鈣溶出率的影響。

1.3.5.3 超聲溫度對牛骨鈣溶出率的影響

在固定料酸比1∶1.5、料液比1∶15（g/mL）、超聲時間10 min的條件下，考察不同超聲溫度（20、30、40、50、60 ℃）對牛骨離子鈣溶出率的影響。

1.3.5.4 料酸比對牛骨鈣溶出率的影響

在固定料液比為1∶15（g/mL）、超聲功率200 W、超聲溫度30 ℃、超聲時間10 min的條件下，考察料酸比（1∶0、1∶0.25、1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3）對牛骨離子鈣溶出率的影響。

1.3.5.5 料液比對牛骨鈣溶出率的影響

在固定料酸比1∶1.5、超聲溫度為30 ℃、超聲時間10 min、超聲功率200 W的條件下，考察料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL））對牛骨離子鈣溶出率的影響。

1.3.6 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，依據Box-Behnken試驗設計要求[28]，以超聲時間、超聲功率及超聲溫度為考察變量，檸檬酸鈣的轉化率為響應值，應用Design-Expert 8.0軟件設計3因素3水平響應面分析試驗，因素與水平見表1。共17 個試驗點，其中12 個為分析因子，5 個為零點，零點試驗進行5 次，以估計誤差，試驗以隨機方式進行，重復3 次。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Code and value of independent variables used for response surface design

1.3.7 超聲處理次數對離子鈣溶出率的影響

將骨粉（5.0 g）、水和檸檬酸按最佳配比混合均勻后，按響應面試驗優化出的最佳工藝參數進行超聲波處理，離心得到上清液和骨渣，分別測定游離鈣的含量。離心分離得到的骨渣經膠體磨研磨、干燥后，再重復上述步驟2 次，分別計算每次的離子鈣溶出率。

1.3.8 超聲處理對離子鈣溶出效果的驗證

為驗證超聲波輔助法對促進牛骨可溶性鈣快速溶出的強化作用，將超聲輔助法與酸煮法得到的牛骨源檸檬酸鈣轉化率進行比較分析，同時設置靜置組（不超聲）和常規處理組（攪拌代替超聲），分析不同處理后溶液中檸檬酸鈣含量。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

圖1 超聲功率、超聲時間、超聲溫度、料酸比、料液比對牛骨鈣離子化效果的影響Fig. 1 Effects of ultrasonic power, sonication time, temperature, solidto-citric acid ratio and solid-to-solvent ratio on dissolution of free calcium from bovine bone

由圖1a可以看出，與對照組相比，超聲處理有助于牛骨鈣的離子化，在0～350 W范圍內，離子鈣溶出率隨超聲功率增加而顯著提高，超過250 W以后，離子鈣溶出率增加幅度趨于平緩。分析其原因可能是因為當超聲功率在100～300 W時，在超聲波功率增加時，超聲波的空化作用和機械振動增強有助于檸檬酸分子擴散，提高傳質速率，從而促進檸檬酸與牛骨中的羥基磷灰石進行反應；此外，超聲波與料液作用產生大量的泡沫，泡沫破碎后產生局部瞬間壓力[29]，促使骨膠原斷裂也有利于牛骨鈣的溶出，因此從牛骨中釋放離子鈣的效率得到了改善。但是超過300 W以后，牛骨鈣的溶出率有所降低，可能因過高強度的超聲處理會導致生成的檸檬酸鈣發生降解或者性質改變。出于能耗與生產周期等因素的綜合考慮，選擇300 W左右的超聲功率進行響應面試驗優化。

從圖1b可以得出，在0～20 min內，離子鈣溶出率隨超聲時間延長而上升，超出20 min后，離子鈣溶出率增加緩慢甚至下降。分析其原因，可能隨著超聲時間的延長，促進了檸檬酸與牛骨中羥基磷灰石的接觸，加快反應效率，超聲時間越長，所得到的檸檬酸鈣越多；但當超聲時間超過20 min以后，超聲波的作用從牛骨顆粒表面擴散到牛骨顆粒內部，繼續延長時間不會對牛骨顆粒產生影響，但是會使生成的檸檬酸鈣分解加速或使檸檬酸鈣的物理性質發生改變，導致超聲過程中絮凝，產生不同程度的沉淀[19]，直接阻礙了離子鈣含量的測定。因此，依據生產實際和成本考慮，選取超聲時間約為18～22 min進行后續響應面優化試驗。

由圖1c可以看出，在0～40 ℃范圍內，離子鈣溶出率隨超聲溫度升高而提高，當超聲溫度達40 ℃時，牛骨鈣的離子化率顯著高于其他溫度時的離子鈣溶出率（P＜0.05），這是因為反應溫度升高會加快溶質的擴散速率，有利于檸檬酸滲透并與牛骨顆粒接觸，因而更有利于反應進行。但是超過40 ℃以后，隨著超聲溫度的繼續升高，離子鈣溶出率反而下降，可能是由于溫度過高，檸檬酸鈣結晶導致溶解性下降，使測定的溶液中鈣含量降低[30]。因此，將超聲反應溫度的范圍確定在35～45 ℃，進行后續響應面優化試驗。

由圖1d可以看出，離子鈣溶出率隨酸用量增加而提高，當骨粉與檸檬酸的比例為1∶2時，鈣的離子化效率增加很快，超過此區間以后，離子鈣溶出率增加幅度趨于平緩。因此選擇料酸比1∶2作為最優條件。

由圖1e可以看出，在料液比1∶15（g/mL）以下時，隨著溶劑用量的增大，離子鈣溶出率顯著上升（P＜0.05）。當料液比為1∶15（g/mL）時，離子鈣溶出率達到最大值73.0%，繼續增大料液比對離子鈣溶出率無顯著性影響（P＞0.05）。原因可能與檸檬酸鈣在水中的溶解度有關，料液比在1∶15（g/mL）之前，轉化出的檸檬酸鈣不能完全溶于水中，導致測得離子鈣的含量降低。綜合考慮實際生產成本，選擇料液比1∶15（g/mL）進行后續響應面優化試驗。

2.2 響應面分析

2.2.1 響應面回歸模型的建立與分析

根據單因素試驗結果，固定料酸比1∶2、料液比1∶15（g/mL），以超聲功率（X1）、超聲溫度（X2）和超聲時間（X3）為試驗因素，以檸檬酸鈣轉化率為響應值，利用響應面法對超聲輔助制備牛骨源檸檬酸鈣的制備工藝進行優化，結果如表2所示。

表2 響應面試驗優化結果Table 2 Experimental design with results for response surface analysis

根據表2結果，通過Design-Expert 8.0軟件對數據進行多元回歸擬合分析，檸檬酸鈣轉化率（Y）與超聲功率（X1）、超聲溫度（X2）和超聲時間（X3）之間建立二次回歸模型：

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic polynomial regression model

為進一步分析所獲得的回歸方程的擬合度，對模型進行了ANOVA方差分析，其結果如表3所示。可以看出，擬合方程的P值為0.005 6，這表明所獲得的方程在99%水平下具有顯著性。方程的失擬項（P＝0.057 9）不顯著，說明方程的擬合程度較好，回歸方程可以很好地準確分析和預測各因素與鈣轉化率之間的關系。該模型一次項X1和交互項X1X2、X1X3的P值小于0.01，對模型貢獻大，因此其對牛骨源檸檬酸鈣轉化的影響極顯著，而一次項X2、X3和交互項X2X3的P值小于0.05，表明其對牛骨源檸檬酸鈣轉化的影響顯著。由F檢驗可以得出各因素對牛骨檸檬酸鈣轉化率的影響依次是X1（超聲功率）＞X2（超聲溫度）＞X3（超聲時間）。

2.2.2 響應面優化

根據回歸擬合方程，每2 個因素對牛骨源檸檬酸鈣轉化率作響應面和等高線圖（圖2）。通過觀察響應面的變化情況和等高線的稀疏程度可直觀地反映超聲功率（X1）、超聲溫度（X2）、超聲時間（X3）之間交互作用對牛骨檸檬酸鈣轉化率的影響，等高線的形狀越接近橢圓形，表明其自變量間交互作用對響應值的影響越大[16-17]。綜合分析可知，超聲溫度（X2）和超聲功率（X1）的交互作用對牛骨源檸檬酸鈣轉化率的影響最為明顯。

圖2 各因素交互作用對檸檬酸鈣轉化率的影響Fig. 2 Response surface and contour plots showing interactive effects of variables on dissolution of free calcium from bovine bone

2.2.3 最佳條件的預測及驗證

表4 不同處理方法牛骨源檸檬酸鈣的轉化率Table 4 Yields of calcium citrate prepared by different methods

通過回歸模型的預測，確定超聲波輔助牛骨鈣離子化制備檸檬酸鈣的最佳工藝條件為：超聲功率317 W、超聲溫度39.45 ℃、超聲時間20.52 min、料酸比1∶2、料液比1∶15（g/mL）。在此條件下檸檬酸鈣轉化率為73.22%。結合生產實際，將各因素調整為：超聲功率320 W、超聲溫度39 ℃、超聲時間21 min、料酸比1∶2、料液比1∶15（g/mL）。在此條件下進行5 次平行實驗驗證，同時設置取消超聲處理和用常規方法代替超聲（反應60 min）進行比較。由表4可知，在超聲輔助的最佳工藝條件下，牛骨源檸檬酸鈣轉化率可達71.21%，與理論預測值73.45%，誤差值僅為3.05%，證實了該模型的有效性。同時，在最佳工藝條件下檸檬酸鈣的純度為94.38%。超聲輔助反應21 min比常規方法反應60 min時的檸檬酸鈣的轉化率顯著提升，表明超聲波輔助在促進牛骨有機鈣轉化的速率和效率方面均具有明顯優勢。

2.3 超聲波處理次數對牛骨鈣離子化效果的影響

在優化出的最佳工藝參數基礎上，探索將牛骨鈣全部溶出的工藝，即將骨粉、水和檸檬酸按最佳配比混合均勻后，進行超聲波處理，然后離心得到上清液和骨渣，分別測定游離鈣的含量（表5）。離心分離得到的骨渣經膠體磨研磨后干燥后，再重復上述步驟2 次。牛骨粉只經1次超聲處理后，骨中72.19%的鈣被游離出來；經超聲波第2次處理后，仍有17.04%的離子鈣溶出，2次總離子鈣溶出率達89.23%；對牛骨粉進行3 次循環超聲處理后，可溶性離子鈣溶出率達到96.18%，牛骨中的絕大部分鈣基本變為離子鈣。

表5 超聲處理次數對牛骨鈣離子化效果的影響Table 5 Effect of number of ultrasonic cycles on dissolution of free calcium from bovine bone

3 結 論

在單因素試驗基礎上，利用Box-Behnken響應面優化試驗設計，確定了超聲波輔助制備牛骨源檸檬酸鈣的最優工藝條件為料液比1∶15（g/mL）、料酸比1∶2.0、超聲功率320 W、超聲溫度39 ℃、超聲時間21 min，在此條件下獲得的檸檬酸鈣轉化率為71.21%，檸檬酸鈣純度為94.38%。經循環3 次超聲波處理后牛骨離子鈣溶出率高達96.18%。由響應面方差分析和各因素交互作用分析各因素對牛骨源檸檬酸鈣轉化的影響順序為超聲功率＞超聲溫度＞超聲時間，且超聲溫度和超聲功率對檸檬酸鈣得率的交互作用最為明顯。相對于常規方法，超聲波輔助制備工藝可顯著提升牛骨源檸檬酸鈣的轉化率，同時縮短反應時間，具有明顯優勢。