基于色譜-質(zhì)譜技術(shù)分析高濕條件下霉變黑毛茶品質(zhì)成分變化及真菌毒素殘留

胥 偉，姜依何，田雙紅，朱 旗,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川 成都 611130）

黑茶初制生產(chǎn)工序歷經(jīng)殺青、揉捻、渥堆和干燥，由此將茶樹鮮葉制得黑毛茶[1]，黑毛茶再通過(guò)篩分、軋切、風(fēng)選、拼堆、蒸壓、發(fā)花等精制工序加工成不同品質(zhì)風(fēng)格的黑茶產(chǎn)品。中國(guó)茶葉流通協(xié)會(huì)報(bào)道了2018年全國(guó)黑茶產(chǎn)量為31.89萬(wàn) t，占比六大茶類總量的12.20%，位居六大茶類第2位[2]。由于生產(chǎn)黑茶的鮮葉原料采摘通常較為粗老，加工成的黑毛茶需在庫(kù)房中存放1～2 a才能進(jìn)行精制[3]，同時(shí)，售出的黑茶商品，消費(fèi)者通常將其存放一段時(shí)間以改善其粗澀的口感。在黑毛茶或成品黑茶貯存過(guò)程中，如果遇到高濕高溫的環(huán)境條件，特別是南方的梅雨季節(jié)，茶葉表面則極易滋生霉菌[4-5]，輕者有風(fēng)霉味，重者失去飲用價(jià)值[6]，甚至產(chǎn)生安全問(wèn)題。

從有關(guān)黑茶微生物群落構(gòu)成的研究成果看，正常生產(chǎn)上暫未發(fā)現(xiàn)黃曲霉菌株的報(bào)道[7]。但從外源接種的角度看，黃曲霉可在潮水或回潮的茶葉樣本上生長(zhǎng)[8-11]。赭曲霉素A是一類重要的廣泛存在于食品和飼料中的真菌毒素[12]，赭曲霉毒素最初從赭曲霉代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)[13]，進(jìn)一步研究表明曲霉屬（Aspergillus）和青霉屬（Penicillium）真菌[14]均產(chǎn)生該類具有致癌、致畸、致免疫抑制、致肝臟毒性及嚴(yán)重腎毒性的次生代謝產(chǎn)物[15-16]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），俗稱“嘔吐毒素”，主要是一類由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產(chǎn)生[17]的能夠引起動(dòng)物或人類嘔吐、腹瀉甚至腸道壞死的次生代謝產(chǎn)物[18]，而嘔吐毒素因其具有明顯的急性致嘔作用而在相關(guān)研究中常被報(bào)道[9]。

為了解高濕條件下霉變給黑毛茶品質(zhì)帶來(lái)的影響，本研究人工設(shè)定溫度和相對(duì)濕度環(huán)境促進(jìn)霉菌在黑毛茶上生長(zhǎng)，通過(guò)高效液相色譜法及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定黑毛茶霉變過(guò)程中多種品質(zhì)化學(xué)組分及3 種真菌毒素的含量，為高濕霉變導(dǎo)致黑毛茶品質(zhì)劣變的發(fā)生規(guī)律提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

將來(lái)源于黑茶生產(chǎn)企業(yè)的黑毛茶（2016年5月產(chǎn)于湖南省桃源縣，一級(jí)，含水量（10.05±0.20）%）樣品盛于培養(yǎng)皿（培養(yǎng)皿開口，每份培養(yǎng)皿15 g茶樣，分別置于培養(yǎng)箱內(nèi)5 層?xùn)艩罡舭迳希繉?2 份，合計(jì)60 份），并置于生化培養(yǎng)箱進(jìn)行促霉培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，相對(duì)濕度90%。

人工促霉培養(yǎng)過(guò)程中分別按培養(yǎng)至第0、5、7、9、11、13、15天依照柵狀隔板分層取樣混勻，-20 ℃密封凍存。

從市場(chǎng)收集2 份自然霉變黑茶樣品（霉變茯磚茶：ZM1，霉變花卷茶：ZM2）用于真菌毒素的對(duì)照分析。

1.2 儀器與設(shè)備

GZ-150-HSII恒溫恒濕箱 韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；PB303-N電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；LDP-350型高速多功能粉碎機(jī) 浙江永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司；XMTD-7000恒溫水浴鍋箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；N13462C移液器 德國(guó)Eppendorf公司；KQ3200B超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)、LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司；ACCQ·TagTM氨基酸分析色譜柱（3.9 mm×150 mm，5 μm） 美國(guó)Waters公司；ECOSIL-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm） 廣州綠百草科學(xué)儀器有限公司；R-300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；1290-6460液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent公司；Aquelix 5超純水制備儀 美國(guó)Millipore公司；35R超速離心機(jī) 德國(guó)Rotina公司；3001型酶標(biāo)儀美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 茶湯制備

準(zhǔn)確稱取粉碎茶樣5.0 g于500 mL三角瓶中，加沸騰蒸餾水450 mL，沸水浴浸提45 min，過(guò)濾，洗滌殘?jiān)瑸V液合并于500 mL容量瓶中，冷卻后定容，搖勻，待測(cè)。測(cè)定前待測(cè)樣過(guò)0.45 μm濾膜，取濾液上機(jī)待測(cè)。

1.3.2 水分及多酚總量測(cè)定

水分含量測(cè)定參考GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》[19]；茶多酚含量測(cè)定參考GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》[20]。

1.3.3 高效液相色譜分析

兒茶素組分、嘌呤堿、游離氨基酸含量及沒(méi)食子酸含量測(cè)參考劉建軍等[21]的方法。

兒茶素及嘌呤堿含量測(cè)定色譜條件：ECOSIL-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫40 ℃；流速1.0 mL/min；流動(dòng)相A為超純水，流動(dòng)相B為40% N,N-二甲基甲酰胺溶液溶液。梯度洗脫程序：0.01 min，9% B；10 min，14% B；15 min，23% B；27 min，36% B；31 min，36% B；32 min，9%B；37 min，停止。

給出一個(gè)訓(xùn)練集Τ={(xi,yi),i=1...l}，其中xi∈RN,yi∈R，在特征空間F 中構(gòu)造一個(gè)線性回歸方程：

游離氨基酸組分色譜條件：ACCQ·TagTM色譜柱（3.9 mm×150 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；進(jìn)樣量20 μL；柱溫37 ℃；流速1.0 mL/min；流動(dòng)相A為10% ACCQ·TagTM洗脫液，流動(dòng)相B為60%乙腈溶液。梯度洗脫程序：0.01 min，0% B；0.5 min，2% B；15 min，7% B；19 min，10% B；32 min，33% B；34 min，100% B；37 min，100% B；39 min，0% B；42 min，0% B；42.01 min，停止。1.3.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)

1.3.4.1 試樣制備

稱取2.0 g茶樣于50 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)物玉米烯酮（10 μg/kg）和DOM-1（25 μg/kg）。加入10 mL乙酸乙酯-甲酸（99∶1，V/V）溶液，振搖30 min。3 200×g離心15 min。上清液定容到10.0 mL。取2.0 mL于試管中，氮吹近干再用1.0 mL乙腈-水（84∶16，V/V）復(fù)溶，這部分提取液稱為“提取液1”。剩下8.0 mL提取液（提取液2）通過(guò)200 mg/3 mL的NH2固相萃取柱（用3 mL乙酸乙酯-甲酸（99∶1，V/V）溶液活化），過(guò)濾液收集于試管中，NH2柱抽干10 min，過(guò)濾液氮吹近干，然后用2.0 mL乙腈-水（84∶16，V/V）復(fù)溶并通過(guò)500 mg/6 mL C18固相萃取柱（用5 mL乙腈-水（84∶16，V/V）活化）。提取液2通過(guò)C18柱后，提取液1也通過(guò)同一根C18柱。兩部分過(guò)濾液都收集于試管中，C18固相萃取柱抽干10 min，過(guò)濾液氮吹近干，然后用100 μL流動(dòng)相水-甲醇（60∶40，V/V）和0.3%甲酸溶液復(fù)溶。14 000×g離心15 min，然后上機(jī)測(cè)定[22]。

1.3.4.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定條件

液相色譜條件：柱溫60 ℃；進(jìn)樣量10.0 μL；流動(dòng)相A為0.3%甲酸溶液，流動(dòng)相B為甲醇-0.3%甲酸溶液；流速0.55 mL/min；洗脫程序：0～1 min，0% B；1～1.5 min，0%～15% B；1.5～8 min，15% B；8～8.5 min，15%～30% B；8.5～11 min，30%～40% B；11～12 min，40% B；12～14 min，40%～55% B；14～16 min，55% B；16～19 min，55%～85% B；19～20 min，85%～100% B；20～22 min，100% B；22～23 min，100%～0% B；23～25 min，0% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子模式，溫度120 ℃；脫溶劑溫度400 ℃；毛細(xì)管電壓3.2 kV；碰撞氣體為氬氣；錐氮和脫溶劑氣流50～800 L/h。在每個(gè)分析物的前體離子選擇之后，產(chǎn)物離子與錐孔電壓和碰撞能相結(jié)合。為提高靈敏度和選擇性，在選定的反應(yīng)監(jiān)測(cè)中進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。離子化質(zhì)荷比分別為：AFB1：母離子m/z313.0，子離子m/z241.0、269.0；赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）：母離子m/z404.0，子離子m/z358.0、239.0；DON：母離子m/z297.0，子離子m/z249.0、203.3。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Microsoft Excel 2007軟件和SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑毛茶霉變過(guò)程氨基酸組分變化

表1 氨基酸組分含量Table 1 Changes in amino acid composition during incubation of raw black tea at high humidity

氨基酸是茶湯呈味物質(zhì)的主要構(gòu)成之一，口感主要體現(xiàn)為鮮爽味，氨基酸含量的高低對(duì)茶湯鮮爽味的呈現(xiàn)起著很大的作用。如表1所示，氨基酸總量隨著霉變時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，在霉變之初0～5 d降低最快，降低率約為80.23%。茶氨酸為測(cè)定的18 種游離氨基酸組分中含量最高的一類氨基酸，未霉變時(shí)約占游離氨基酸總量的40.92%。在未霉變黑毛茶樣本中，含量前5的氨基酸組分為茶氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和蛋氨酸，霉變第15天時(shí)排名前5的氨基酸組分為茶氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸。精氨酸和蛋氨酸含量在霉變過(guò)程中降解速度很快，說(shuō)明精氨酸較容易成為霉菌的氮源而被霉菌所利用轉(zhuǎn)化。在18 種氨基酸組分中僅酪氨酸含量略有增加，未見因霉菌生化代謝轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致某類氨基酸含量明顯上升的現(xiàn)象。采用最小顯著性差異法對(duì)茶氨酸和18 種氨基酸總和在不同霉變時(shí)期的含量進(jìn)行差異顯著性分析。結(jié)果表明：茶氨酸從霉變起始至霉變第5天時(shí)含量變化呈顯著性差異（P＜0.05）；18 種氨基酸總量從霉變起始到霉變第7天時(shí)含量變化呈顯著性差異，霉變第9～15天含量變化呈現(xiàn)顯著性差異。

2.2 黑毛茶霉變過(guò)程嘌呤堿組分變化

表2 嘌呤堿組分含量Table 2 Changes in contents of purine alkaloids during incubation of raw black tea at high humidity

茶樹中的嘌呤堿主要為3 類：咖啡堿（1,3,7-三甲基黃嘌呤）、茶葉堿（1,3-二甲基黃嘌呤）、可可堿（3,7-二甲基黃嘌呤），是茶湯呈味物質(zhì)的主要構(gòu)成之一，口感主要體現(xiàn)為苦味。如表2所示，嘌呤堿總量在霉變起始階段（0～7 d）中的變化存在顯著性差異，而且表現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。這可能與霉變起始階段其他內(nèi)含成分降低迅速而嘌呤堿化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定不易被霉菌利用有關(guān)。霉變第9～15天，嘌呤堿總量基本保持穩(wěn)定，無(wú)顯著性差異。茶堿霉變第9～15天呈顯著性差異，呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而這種上升的趨勢(shì)與咖啡堿的下降趨勢(shì)又表現(xiàn)出相對(duì)應(yīng)的數(shù)量關(guān)系，這表明茶堿的變化主要由咖啡堿轉(zhuǎn)化而來(lái)。嘌呤堿總量隨著霉變時(shí)間的延長(zhǎng)而表現(xiàn)出先升高后穩(wěn)定的規(guī)律，同時(shí)也說(shuō)明霉菌生長(zhǎng)所利用的氮源主要來(lái)源于氨基酸，而嘌呤堿的利用度較小。

2.3 黑毛茶霉變過(guò)程兒茶素組分及多酚含量變化

表3 兒茶素組分及多酚含量Table 3 Changes in contents of catechins and polyphenols during incubation of raw black tea at high humidity

茶多酚類物質(zhì)是茶葉的主要呈味品質(zhì)成分，本研究測(cè)定茶葉中主要存在的幾類兒茶素及沒(méi)食子酸，觀察霉變過(guò)程兒茶素組分的變化情況。如表3所示，EGC含量由起始的16.19 mg/g下降至6.26 mg/g；EGCG含量則由起始的31.51 mg/g下降至15.28 mg/g。而沒(méi)食子酸含量也相應(yīng)有所降低，由起始的1.66 mg/g降低至0.96 mg/g；EC、DL-C及GCG含量則變化不大。茶多酚總量在促霉培養(yǎng)前5 d下降速度較快，由126.01 mg/g降低至110.18 mg/g（第5天檢出數(shù)據(jù)顯示與第0天呈顯著性差異），表明多酚類物質(zhì)在霉菌侵染的過(guò)程中能夠被轉(zhuǎn)化吸收利用于霉菌自身代謝。從霉變起始至霉變第5天，無(wú)論是兒茶素組分還是多酚總量均表現(xiàn)出顯著性差異，呈現(xiàn)降低規(guī)律。而茶多酚總量從霉變第5天開始，隨著霉變時(shí)間的延長(zhǎng)而不再表現(xiàn)顯著性降低趨勢(shì)。表明霉菌在霉變起始利用多酚類物質(zhì)做為碳源最為劇烈，隨著霉菌的生長(zhǎng)，開始向其他類物質(zhì)攝取碳源物質(zhì)。

2.4 霉變黑毛茶霉變過(guò)程3 種真菌毒素含量測(cè)定結(jié)果

圖1 3 種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品色譜-質(zhì)譜圖Fig. 1 Chromatograms and mass spectra of three mycotoxin standards

有學(xué)者采用酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)黑茶中的真菌毒素[23-25]，但本研究前期實(shí)驗(yàn)表明，由于黑茶茶色素的干擾導(dǎo)致酶聯(lián)免疫技術(shù)不適用于黑茶樣品的真菌毒素檢測(cè)，與相關(guān)文獻(xiàn)研究結(jié)論一致[26-28]。故采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)研究霉變過(guò)程中AFB1、OTA和DON在霉變黑茶樣本及霉變過(guò)程中的存在情況。

如圖1和表4所示，測(cè)定的霉變黑茶樣品中OTA、DON、AFB13 種真菌毒素均未檢出（或低于檢出限），表明上述3 種真菌毒素并非廣泛存在于黑茶樣品中。而外源接種黃曲霉菌株（ACCC30899）的陽(yáng)性對(duì)照黑毛茶樣品中檢出的AFB1含量為12.98 μg/kg，表明外源污染的真菌種類是導(dǎo)致霉變黑毛茶殘留真菌毒素的主要誘因。

表4 3 種真菌毒素含量Table 4 Changes in contents of three mycotoxins during incubation of raw black tea at high humidity

3 討 論

黑茶品質(zhì)化學(xué)多集中于品質(zhì)形成機(jī)理研究，但對(duì)于高濕霉變環(huán)境引起的黑茶品質(zhì)劣變的研究較少。本研究從高濕條件下誘導(dǎo)黑毛茶的霉變過(guò)程著手，模擬梅雨季節(jié)的貯藏條件，研究霉變黑毛茶的主要品質(zhì)成分變化規(guī)律及真菌毒素殘留狀況。

黑毛茶霉變過(guò)程中，氨基酸和兒茶素類物質(zhì)在霉變初期（第0～5天）含量下降迅速，其中茶氨酸作為18 種游離氨基酸組分中含量最高的氨基酸，其含量的變化是霉變過(guò)程黑毛茶氨基酸下降的主要原因，實(shí)驗(yàn)過(guò)程未檢測(cè)到因霉菌生化代謝轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致某類氨基酸含量明顯上升的現(xiàn)象。從霉變起始至霉變第5天，茶氨酸和18 種氨基酸總量分別下降了71.65%和78.67%，至霉變第15天時(shí)，其含量?jī)H為起始含量的12.31%和13.95%。表明霉變過(guò)程對(duì)黑茶品質(zhì)帶來(lái)了極大的影響。3 種嘌呤生物堿的總量在霉變過(guò)程中基本保持穩(wěn)定，茶堿在霉變過(guò)程中有所上升，而咖啡堿則有所下降，兩者存在數(shù)量相關(guān)性，其原因可能在于部分霉菌存在嘌呤堿之間的轉(zhuǎn)化能力[29]。兒茶素類組分主要以EGCG和EGC的含量降低為主，不含沒(méi)食子酸基團(tuán)的兒茶素（EC、DL-C）和非表型兒茶素（GCG）含量變化不大。這表明，霉菌存在水解兒茶素沒(méi)食子基團(tuán)的能力，這在單體物質(zhì)代謝研究中已經(jīng)被證明[30-31]，但這種能力是否還受制于兒茶素的構(gòu)型，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。茶多酚和沒(méi)食子酸含量在霉菌侵染的過(guò)程中逐漸降低，表明該類物質(zhì)能夠被霉菌所代謝和轉(zhuǎn)化，具體的代謝轉(zhuǎn)化機(jī)制及通路有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)研究霉變黑毛茶樣品中OTA、DON、AFB13 種真菌毒素，結(jié)果表明上述3 種真菌毒素并非廣泛存在于黑茶樣品中，而陽(yáng)性對(duì)照樣品的檢出結(jié)果則說(shuō)明了外源污染真菌種類可能是導(dǎo)致黑茶霉變產(chǎn)生真菌毒素的主要原因，生產(chǎn)上需要嚴(yán)格防范；高濕霉變條件下，多種茶葉有效成分降低，導(dǎo)致黑毛茶品質(zhì)的下降，因此貯存環(huán)境的控制是保持黑毛茶品質(zhì)的重要因素。與此同時(shí)，除防范生產(chǎn)過(guò)程導(dǎo)致的安全問(wèn)題外，如若在霉變過(guò)程中發(fā)生了有害真菌的污染，高濕霉變也會(huì)導(dǎo)致黑毛茶品質(zhì)的安全問(wèn)題，高濕條件的霉變和產(chǎn)毒真菌的污染，應(yīng)引起黑茶生產(chǎn)企業(yè)的高度重視。

4 結(jié) 論

高濕條件下，黑茶霉變迅速，多種內(nèi)含成分在霉變起始至霉變第5天時(shí)表現(xiàn)出顯著性降低趨勢(shì)。霉變起始階段，霉菌利用黑茶品質(zhì)成分用于自身碳代謝和氮代謝，氨基酸組分、18 種氨基酸總量、兒茶素組分及多酚總量均在霉變第5天時(shí)表現(xiàn)出顯著性降低趨勢(shì)。嘌呤堿化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，含量表現(xiàn)出先上升后維持穩(wěn)定的規(guī)律，霉變第9～15天時(shí)，茶堿含量的上升與咖啡堿含量的下降表現(xiàn)出對(duì)應(yīng)的數(shù)量關(guān)系，表明霉菌存在將咖啡堿轉(zhuǎn)化成茶堿的生化機(jī)制。

酶聯(lián)免疫測(cè)試黑茶真菌毒素時(shí)，存在假陽(yáng)性結(jié)果，不適用于黑茶真菌毒素的檢測(cè)。黑茶霉變過(guò)程中，有害霉菌污染可導(dǎo)致黑茶真菌毒素殘留。生產(chǎn)上，要嚴(yán)格保障倉(cāng)儲(chǔ)環(huán)境，杜絕高濕條件下茶葉霉變產(chǎn)生真菌毒素殘留的食品安全問(wèn)題。