酸應激對大腸桿菌O157:H7生物菌膜形成的影響

王嫻靜，董 晨，禹金龍，胡 潔，付文靜，張 蘇，江 蕓,*

（1.南京師范大學食品與制藥工程學院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省疾病預防控制中心，江蘇 南京 210009）

近年來，食源性致病菌生物菌膜已成為食品安全領域中的研究熱點[1-2]。生物菌膜是細菌在生長過程中為適應生存環境而黏附、生長于組織表面，在菌體-菌體和菌體-接觸面的相互作用下，通過菌體增殖、分泌胞外基質而形成的具有一定空間結構的細菌聚集體[3-4]。形成菌膜后，細菌菌體對外界環境的抵抗力會大大增強，對工業清洗劑和消毒劑具有更強耐受性，不易清除，殘留的生物菌膜可在環境適宜時脫落出細菌菌體，成為潛在污染源，進一步造成交叉污染，引發嚴重的食品安全問題[5-6]。大腸桿菌O157:H7是全球范圍內備受關注的食源性致病菌，每年都會爆發多起因大腸桿菌O157:H7污染而引發的食物中毒事件。有研究表明，大腸桿菌O157:H7在固體表面（如加工器械表面、畜禽胴體表面等）產生黏附的特性是其造成交叉污染的主要原因[7]。

大腸桿菌O157:H7等食源性致病菌大多是嗜中性菌。然而食品加工過程常存在低pH值環境，如使用酸性洗液和酸性食品添加劑、酸乳和發酵香腸等酸性食品的加工與貯藏等。目前關于食品加工環境影響食源性致病菌生物菌膜生長的研究較多集中在各類環境因子（如培養基類型、溫度、pH值、接觸面類型）的影響作用[8-11]，而結合食品實際加工環境探究較長時間酸應激對食源性致病菌生物菌膜形成的影響，可以揭示菌膜形成的真實規律，有助于針對性地制定消除和控制菌膜的策略和有效措施，具有更為現實的指導意義。

因此，本研究以大腸桿菌O157:H7為對象，通過比較不同菌株黏附性能，選擇代表菌株分析在較長時間酸應激時其生物菌膜形成規律，進一步采用共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）比較黏附力不同的菌株在酸性環境下生物菌膜形態結構變化。本研究將為酸性食品實際生產加工中大腸桿菌O157:H7風險評估提供理論參考，為研究致病菌生物菌膜的有效防控技術提供科學思路。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

實驗用大腸桿菌O157:H7共14 株，包括菌株CICC21530（購自中國工業微生物菌種保藏中心）菌株ATCC43895（購自美國菌種保藏中心）、菌株NCTC12900（購自廣東環凱微生物科技有限公司），其余11 株為南京師范大學食品與制藥工程學院實驗室分離自牛肉和牛糞[12]。

胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar，TSA）培養基、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂酵母提取物（tryptone soya agar yeast extract，TSAYE）培養基 北京陸橋技術有限公司；LIVE/DEAD?BacLight Bacterial Viability Kits（L7012）美國Molecular Probes公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、結晶紫、乳酸、戊二醛、鋨酸、乙醇 南京化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

M2多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司；SZX超凈工作臺 上海浦東躍欣儀器廠；LDZX-30FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；SG403A Sterile GDRD生物安全柜 美國Baker公司；拍打式均質器 青島眾瑞智能儀器有限公司；生化培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司；QL-200微型漩渦混合儀 海門其林貝爾儀器有限公司；2-16KL高速冷凍離心機 美國Sigma公司；DHP-9052型電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；LSM 710 CLSM德國Carl Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 菌液制備

凍藏的14 株大腸桿菌O157:H7經TSA平板劃線，于37 ℃培養24 h，挑取單菌落接種至3 mL TSB中，37 ℃搖床培養18 h，再吸取1 mL菌液轉接至100 mL TSB中，37 ℃搖床培養18 h，使菌液濃度達到108CFU/mL左右。取1 mL培養好的菌液離心（6 000×g、5 min、4 ℃），棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）洗滌2 次，重懸后備用。

1.3.2 大腸桿菌O157:H7黏附性能比較

采用微孔板結合結晶紫染色法[13-14]。取500 μL備用菌液，接種至一定體積TSB中（菌體濃度約為2～3（lg（CFU/mL））。吸取180 μL置于96 孔細胞培養板中，封口膜包被，于25 ℃培養72 h，以不接種細菌的TSB作為空白對照。培養結束后，棄去微孔中的細菌培養液，無菌蒸餾水洗滌3 次，室溫下干燥45 min后，每孔加入200 μL 0.25 g/100 mL結晶紫染液染色30 min，棄去染液并用無菌蒸餾水洗滌3 次，200 μL體積分數95%乙醇溶液洗脫30 min，最后將微孔板置于酶標儀中在570 nm波長處測定其OD值。每個菌株重復6 次。

1.3.3 微孔法分析大腸桿菌O157:H7生物菌膜的形成曲線

根據1.3.2節結果，選取生物菌膜形成能力不同的幾株大腸桿菌O157:H7，按1.3.2節方法進行微孔板操作，分別在培養2、4、8、12、16、24、36、48、60、72、120、168 h取樣[15]，以不接種的TSB作為對照組。經結晶紫染液染色、乙醇洗脫，570 nm波長處測定其OD值，所得OD值按照培養時間繪制菌膜形成曲線。每個菌株每個時間點均重復6 次。

1.3.4 酸應激對菌株生物菌膜形成的影響

根據1.3.2節和1.3.3節結果選取代表菌株，研究酸應激對其生物菌膜形成的影響。用3 mol/L乳酸溶液和1 mol/L鹽酸溶液分別配制系列pH值梯度（pH 3.5、4.0、4.5、5.0）TSB作為酸性培養液，同時以未經酸處理的正常TSB作為對照。采用機械脫落平板計數法檢測菌膜形成[16]。

按1.3.1節方法進行菌液制備，取100 μL備用菌液接種于10 mL載有不銹鋼片的上述不同酸度TSB中，菌液濃度約為106CFU/mL。將接種好的樣品于25 ℃靜置培養2、4、8、12、24、48、72、120、168 h，規定時間取樣后，對培養裝置里的浮游菌數和不銹鋼表面形成的生物菌膜進行計數。生物菌膜計數前用無菌生理鹽水清洗不銹鋼片3 次以去除鋼片表面未黏附的游離菌體，用拍擊-沖擊法采集鋼片表面的黏附菌體，將清洗后的載有生物菌膜的不銹鋼片放入裝有80 mL無菌生理鹽水的均質袋中，并放入少量無菌棉，在480 擊/min條件下拍擊60 s，吸取均質液進行梯度稀釋，涂布至TSAYE平板中，37 ℃下培養24 h后計數。每組實驗重復3 次。

1.3.5 酸應激下不同黏附力菌株生物菌膜的CLSM觀察

根據1.3.2節和1.3.3節結果選取黏附力不同的代表菌株，采用CLSM比較不同pH值時代表菌株生物菌膜的結構變化。按1.3.1節方法制備菌液，取100 μL備用菌液接種于10 mL載有不銹鋼片的酸性和正常TSB中，菌液濃度約為106CFU/mL。將接種好的樣品于25 ℃靜置培養，分別在24、72 h和168 h取出，無菌蒸餾水充分洗滌不銹鋼片以去除其上的游離菌體，吸取LIVE/DEAD?熒光染液對不銹鋼片表面進行染色，室溫避光條件下充分作用15 min后，用無菌蒸餾水充分洗滌不銹鋼片以除去多余熒光染料，室溫避光條件下放置自然干燥，使用CLSM（60×，油鏡）觀察染色后的生物菌膜結構。LIVE/DEAD?為由核酸染料SYTO 9和碘化丙啶（propidium iodide，PI）復配的熒光染料；其中SYTO 9激發波長和吸收波長分別為480 nm和500 nm，可以將生物菌膜中具有完整細胞膜的菌體（活菌）染成綠色，PI激發波長和吸收波長分別為490 nm和635 nm，可以將生物菌膜中細胞膜損傷的菌體（死菌）染成紅色，從而可以區別生物菌膜中的活菌和死菌[17]。每組隨機選用10 張CLSM圖像，使用NIS-Element Viewer軟件和Image J 軟件對圖像進行處理。

1.4 數據統計與分析

數據處理應用SPSS 17.0軟件，采用單因素方差分析及Duncan’s多重比較檢驗進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 大腸桿菌O157:H7不同菌株黏附性能比較

采用微孔板結合結晶紫染色法，14 株大腸桿菌O157:H7在聚苯乙烯微孔表面底部可形成淡紫色薄膜，其黏附性能如圖1所示。14 株大腸桿菌O157:H7均具有一定的黏附能力，但存在明顯的菌株差異性，其中菌株J29黏附力最強，顯著高于其他菌株（P＜0.05），菌株ATCC43895黏附力中等，其余12 株黏附力均較弱。

圖1 大腸桿菌O157:H7在微孔板表面生物菌膜形成能力比較（n＝ 6）Fig. 1 Comparison of biofilm formation abilities of E. coli O157:H7 strains on polystyrene microplate surface (n = 6)

2.2 大腸桿菌O157:H7生物菌膜形成曲線

圖2 大腸桿菌O157:H7生物菌膜形成曲線（n＝6）Fig. 2 Biofilm formation curves of E. coli O157:H7 (n = 6)

根據2.1節結果，進一步選取較強黏附力菌株J29、中等黏附力菌株ATCC43895和4 株較弱黏附力菌株（113、157、236和CICC21530），利用微孔板結合結晶紫染色法繪制各菌株生物菌膜的形成曲線，結果如圖2所示。各菌株均在培養2 h時開始產生黏附，但黏附性能不同的菌株其形成曲線差異明顯，4 株較弱黏附力菌株在2 h后隨培養時間延長，菌膜形成量變化不大，基本維持在相對穩定狀態；而中等黏附力菌株ATCC43895和較強黏附力菌株J29菌膜形成量明顯依賴于培養時間，其中菌株ATCC43895在培養2 h時完成初黏附后，2～48 h時菌膜形成量比較穩定，48～168 h時菌膜形成量呈較快增長趨勢；菌株J29在培養2 h時完成初黏附后，2～24 h時菌膜形成量比較穩定，24～48 h時菌膜形成量迅速增加，48～168 h時菌膜形成量呈較緩增長趨勢。

2.3 酸應激下中等黏附力菌株ATCC43895生物菌膜的形成過程

根據2.1節和2.2節結果，進一步選取中等黏附力菌株ATCC43895為代表菌株，利用機械脫落平板計數法觀察酸應激下不銹鋼表面該菌株生物菌膜的形成。結果表明，pH 3.5乳酸-TSB的抑菌效應強，該菌株浮游菌數和生物菌膜形成數量均未達到檢測限，而pH 3.5鹽酸-TSB對該菌株浮游菌數和生物菌膜數量影響均較小，故對pH 3.5乳酸-TSB和pH 4.0、4.5、5.0鹽酸-TSB未作進一步研究。pH 4.0、4.5、5.0乳酸-TSB、pH 3.5鹽酸-TSB對菌株ATCC43895浮游菌數及其生物菌膜形成過程的影響如圖3、4所示。

圖3 酸應激下菌株ATCC43895浮游菌數變化（n＝ 3）Fig. 3 Effect of acid stress on planktonic cell count of strain ATCC43895 (n = 3)

由圖3可知，酸應激下對照組（正常TSB）浮游菌數在2～8 h顯著增大，8 h時其浮游菌數達8.70（lg（CFU/mL）），此后至168 h基本保持穩定。乳酸-TSB各組在整個培養過程中浮游菌數均低于對照組，尤其是pH 4.0乳酸-TSB組，其浮游菌數顯著低于對照組（P＜0.05），從培養4 h起即隨培養時間的延長而減小，168 h時已減小至檢測限以下。pH 3.5鹽酸-TSB組的浮游菌數變化與pH 5.0乳酸-TSB組類似。結果表明，浮游菌數顯著依賴于pH值，pH值越低，即培養條件酸性越強，浮游菌數越少；pH值相同時乳酸對浮游菌數的抑制效應顯著高于鹽酸。

酸應激下菌株ATCC43895生物菌膜形成情況如圖4所示。對照組（正常TSB）生物菌膜形成量逐漸增多，從2 h的3.42（lg（CFU/cm2））增長至168 h時的7.03（lg（CFU/cm2））。乳酸-TSB各組和pH 3.5鹽酸-TSB組在培養2 h時的菌膜形成量顯著低于對照組（P＜0.05），表明乳酸和鹽酸顯著抑制了菌膜形成。酸應激下形成的菌膜逐漸減少，其中pH 5.0乳酸-TSB和pH 3.5鹽酸-TSB組在培養120 h時形成的菌膜略微減少，pH 4.5乳酸-TSB組生物菌膜形成量緩慢增加，介于pH 5.0乳酸-TSB組和pH 4.0乳酸-TSB組之間，而pH 4.0乳酸-TSB組從培養8 h起即逐漸減少，直至低于檢測限。結果表明，生物菌膜形成量明顯依賴于pH值，pH值越低，即培養條件酸性越強，生物菌膜形成量越少，較長時間酸處理可導致已形成的菌膜發生部分甚至全部消除；pH 3.5鹽酸-TSB組培養2 h時的菌膜形成量較少，4 h后大幅增多，至24 h時菌膜形成量接近pH 5.0乳酸-TSB組，表明pH值相同時乳酸對菌膜最終形成的抑制效應顯著高于鹽酸。

圖4 酸應激下菌株ATCC43895生物菌膜形成量變化Fig. 4 Effect of acid stress on biofilm formation of strain ATCC43895

2.4 酸應激下不同黏附力菌株生物菌膜的CLSM比較

根據2.1節和2.2節結果，進一步選取較強黏附力菌株J29和一株較弱黏附力菌株CICC21530進行生物菌膜的CLSM比較。同時根據2.3節結果，因酸性較強時菌膜形成較少，為了更好地觀察菌膜結構，選取pH 5.0乳酸-TSB作為酸應激組，以正常TSB作為對照組。

較弱黏附力菌株CICC21530在正常和酸性TSB中形成生物菌膜的CLSM圖像變化如圖5所示。培養24 h時可發現兩種培養條件下均開始有少量單個菌體黏附于不銹鋼表面，培養72 h時正常TSB中已有少量小的細菌“團狀物”出現，而pH 5.0乳酸-TSB組中的菌體出現連接趨勢，但未觀測到“團狀物”出現，培養168 h時正常TSB中的菌體連接成“網狀”結構，而pH 5.0乳酸-TSB組中的菌體網狀結構比較松散，且觀察到較多紅色菌體，表明死菌數明顯增加。

較強黏附力菌株J29在正常和酸性TSB中形成生物菌膜的CLSM圖像變化如圖6所示。培養24 h時可發現正常TSB組中已有細菌黏附體出現，pH 5.0乳酸-TSB組中為大量單個菌體黏附，并伴有少量細菌“團狀物”出現；培養72 h時正常TSB中形成了復雜的細菌黏附聚集體，呈現密集的“網狀”結構，而pH 5.0乳酸-TSB組中的菌體呈現松散“網狀”結構；培養168 h時正常TSB中“網狀”結構更加密集，呈“云霧狀”，而pH 5.0乳酸-TSB組與正常TSB相比，“網狀”結構較松散，無“云霧狀”形成。

通過兩種培養液之間進行比較發現，兩株菌均為pH 5.0乳酸-TSB組的菌膜形成明顯弱于正常TSB組，形成過程慢、菌膜形成量少、結構較單薄，表明乳酸對菌株生物菌膜的形成具有抑制效應。而在兩株菌之間比較發現，黏附力較弱的菌株CICC21530和黏附性較強的菌株J29形成生物菌膜的數量和結構變化明顯不同，菌株CICC21530黏附少，且成熟期“網狀”結構單薄，而J29黏附量大，且成熟期“網狀”結構更致密，表明生物菌膜的形成過程表現出明顯的菌株差異性。

圖5 不同pH值時菌株CICC21530生物菌膜的CLSM圖（600×）Fig. 5 CLSM images of biofilms formed by CICC21530 at different pH values (600 ×)

圖6 不同pH值時菌株J29生物菌膜的CLSM圖（600×）Fig. 6 CLSM images of biofilms formed by J29 at different pH values (600 ×)

3 討 論

食源性致病菌生物菌膜比游離菌體對食品安全的威脅更大，菌體形成成熟生物菌膜的初始步驟是黏附于接觸面[1-3]，因此本研究首先對14 株大腸桿菌O157:H7黏附性能進行比較，發現14 株菌株均能在聚苯乙烯微孔表面產生黏附，表明這些大腸桿菌O157:H7都具有形成生物菌膜的能力，但不同菌株菌膜形成能力存在差異。楊沁南[18]采用微孔結晶紫法評價北京市市售雞肉中的大腸桿菌黏附性能，Díez-García等[13]比較了69 株雞源沙門氏菌黏附性能，李瓊瓊[19]研究112 株金黃色葡萄球菌菌膜形成能力，均發現不同菌株的菌膜形成能力具有較大差異。近年對肉類腐敗相關的腸桿菌、雞源性莓實假單胞菌的研究也發現不同菌株菌膜形成能力存在差異[20-21]，這與本研究結果一致。然而，Lianou等[14]研究認為沙門氏菌生物菌膜的形成與血清型及菌株無關，這可能與各自研究中所用的測試菌株不同有關。致病菌的黏附特性應引起高度重視，因為食品加工設備表面會用到類似材質，如分隔板、傳送帶、集裝框和包裝袋等，由于清洗消毒不完全，殘留的致病菌可發生黏附進而形成生物菌膜，引發食品安全風險。

食品加工工業中，食源性致病菌更傾向于黏附、生長于食品及加工器械表面，通過形成生物菌膜以應對外界各種不良環境的刺激[2,4]。本實驗進一步選用中等黏附力的菌株ATCC43895為測試菌株，采用食品級不銹鋼片為黏附表面，研究在長時酸應激環境中菌膜形成能力的變化。選用乳酸和鹽酸分別作為有機酸和無機酸的酸應激代表物，設置系列pH值梯度，選擇25 ℃（室溫）為培養溫度，在這些條件下研究大腸桿菌O157:H7的生物菌膜可獲得與實際生產情況更為接近的信息，為了解實際食品加工環境中致病菌生物菌膜的形成狀況提供更可靠的科學依據。

本實驗結果表明無論是在有機酸還是無機酸環境中，菌株ATCC43895均能夠黏附在不銹鋼表面形成生物菌膜，且生物菌膜形成量顯著依賴于pH值，其中酸度較強的有機酸（pH 3.5乳酸）可以明顯抑制該菌株生物菌膜的形成，而在酸度相對較弱的有機酸（pH 4.5、5.0乳酸）環境中，該菌株可在很長一段時間內不斷形成生物菌膜。王虎虎[22]研究沙門氏菌在酸應激條件下生物菌膜的形成時得到了相似結論。本實驗結果表明，大腸桿菌O157:H7在較強的酸性環境中可在很長一段時間內不斷形成生物菌膜，需要對這一結果引起重視。現代食品工業中有較多食品加工體系處于酸性環境中，如酸乳生產、發酵香腸加工、食醋釀造等。此外，有機酸和無機酸作為食品添加劑、防腐劑和消毒劑也被廣泛應用于食品工業中，尤其是當酸性消毒劑使用后沒有被完全清洗而殘留在食品加工接觸面上時，將會給食源性致病菌提供一個弱酸性生存環境[23-25]，而在弱酸性環境中可以形成生物菌膜的食源性致病菌將會對食品安全造成極大的威脅。

本實驗發現，菌株ATCC43895在相同pH值的乳酸和鹽酸環境中其黏附能力也存在顯著差異，這說明酸種類是影響大腸桿菌O157:H7成膜能力的關鍵因素。已有研究發現有機酸對細菌存活能力的影響比無機酸更大[26]，另有學者指出，相對于無機酸而言，有機酸可以以未解離的方式進入菌體細胞，在細胞質內釋放質子，使得胞內pH值迅速降低，從而對微生物代謝活動起到抑制作用而達到顯著抗菌效果[27]，不同的有機酸由于未解離分子結構不同，對大腸桿菌O157:H7生物菌膜形成的影響亦不同[23]。

隨著CLSM技術的發展，研究者對細菌生物菌膜的微觀結構進行了較多探索[28-31]。本研究應用CLSM對酸應激下不同黏附力的2 株大腸桿菌O157:H7生物菌膜結構變化規律進行比較發現，正常TSB培養液中2 種菌株均能形成一定形態結構的生物菌膜，而黏附力較弱菌株的菌膜形成量顯著少于黏附力較強菌株（P＜0.05），這與上述微孔板結合結晶紫染色法觀察到的菌膜形成（圖2）結論相一致。pH 5.0乳酸條件下，菌膜仍可逐漸形成，但菌膜形成量和微觀結構與正常TSB組相比受到明顯抑制，這與上述平板計數法觀察到的酸應激下菌膜形成（圖4）結論相符合。pH 5.0乳酸條件下，菌株CICC21530從培養24 h初始黏附到培養72 h時呈現片狀、網狀的菌膜結構，表明弱酸性環境中黏附性能較弱的菌株仍然能夠逐漸形成菌膜；而黏附性能較強菌株J29在24～72 h逐漸形成大量菌膜，至168 h時形成大量黏附聚集體，導致其中死亡菌體的比例大大減少，故反而不易觀察到其中的紅色死亡菌體（圖5、6）。為較好地觀察到菌膜微觀結構的動態變化，本研究采用pH 5.0弱酸性條件，實驗結果提示一定濃度乳酸能夠有效抑制大腸桿菌O157:H7生物菌膜的形成。當然其他菌膜抑制劑應用[31-32]或多種防控技術聯合效應[9]值得進一步深入研究。

4 結 論

生物菌膜是食品加工中微生物交叉污染的源頭，本實驗結合食品加工實際環境探究較長時間酸應激對大腸桿菌O157:H7生物菌膜形成的影響。采用微孔板結合結晶紫染色法比較14 株大腸桿菌O157:H7黏附性能差異，結果發現黏附性能存在明顯菌株差異。選取較強黏附力菌株J29，中等黏附力菌株ATCC43895和4 株較弱黏附力菌株，采用微孔板結合結晶紫染色法觀察菌膜形成曲線，結果表明各菌株均在培養2 h開始產生黏附，但黏附性能不同的菌株其菌膜形成曲線呈現明顯差異。選取中等黏附力菌株ATCC43895作為代表菌株，采用平板計數法觀察酸應激對生物菌膜形成的影響，結果表明環境pH值越低，其浮游菌數和生物菌膜形成量越少，pH值相同時乳酸抑制效應顯著高于鹽酸。CLSM發現黏附能力較強的菌株J29和較弱的菌株CICC21530在酸性和正常TSB培養液中均能形成一定結構的生物菌膜，且前者的菌膜形成量多于后者，酸性條件成膜過程較正常條件（pH 7.2）時緩慢。本實驗結果揭示了大腸桿菌O157:H7菌膜形成的菌株差異性，及酸應激時菌膜形成和微觀結構的變化規律，可為酸性食品實際生產加工中大腸桿菌O157:H7風險評估提供理論參考，并為研究致病菌生物菌膜的有效防控技術提供科學思路。