乳酸菌調控膽固醇代謝的物質基礎研究進展

田建軍，張開屏，李權威，趙艷紅，靳 燁,*

（1.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.內蒙古商貿職業學院食品工程系，內蒙古 呼和浩特 010070）

膽固醇是膽汁酸、類固醇類激素和VD合成的底物，也是細胞膜的重要組成部分[1]。膽固醇既是人體生長發育必需的物質，又與許多疾病密切相關，如脂肪肝、膽結石以及糖尿病等[2]。如今隨著人們飲食習慣的改變，肉類食品攝入量增加，心腦血管疾病的發病率也在上升。研究表明，血清膽固醇濃度每增加1 mmol/L，心腦血管患病率就升高約35%，猝死率約升高45%[3-4]。

如今降血脂、降膽固醇的藥物很多，但是多數藥物都具有一定的副作用，長期服用不利于患者健康，人們更希望以非藥物、健康的方法來控制血清膽固醇的水平。因此，關于乳酸菌降膽固醇的物質基礎及其代謝通路的研究越來越受到國內外學者的高度關注。

1 膽固醇的代謝通路及其調控的物質基礎

人體血液中的膽固醇可分為內源性和外源性膽固醇，內源性膽固醇即由體內的肝臟與外周組織細胞利用乙酰輔酶A（acetyl-coenzyme A，Ac-CoA）從頭生物合成的膽固醇；外源性膽固醇是指腸道吸收的來自飲食中的膽固醇和膽汁肝腸循環再吸收而獲得的膽固醇[5]。膽固醇在體內的代謝途徑如圖1[6]所示。膽固醇的合成主要在肝細胞和小腸上皮細胞中進行。膳食中膽固醇經胃腸道酶的分解產生游離膽固醇，游離的膽固醇、植物甾醇等會與膽鹽復合成可溶于水的微膠粒，經特異介導膽固醇分子吸收的功能蛋白轉運經過小腸上皮細胞、淋巴系統轉入肝細胞，而低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）和極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）是運輸內源性膽固醇的主要載體，可將脂類物質由肝臟向外周轉運，如果LDL或VLDL含量升高，會引起血漿膽固醇和甘油三酯含量增高，形成高脂血癥，所以把與LDL、VLDL結合的膽固醇認為是對人體健康不利的膽固醇。

圖1 膽固醇在體內的代謝途徑[6]Fig. 1 Cholesterol metabolism pathways[6]

1.1 膽固醇的合成

由圖1可知，膽固醇合成的主要場所是在肝細胞和小腸上皮細胞，體內70%～80%的膽固醇是由肝細胞合成，10%由小腸上皮細胞合成。在肝細胞和腸上皮細胞內，以含有兩個碳的Ac-CoA為原料，經多步酶促反應而合成含有27 個碳的膽固醇。HMG-CoA R為這一合成過程的限速酶，它催化了膽固醇合成過程中HMG-CoA轉化為甲羥戊酸[7]。臨床上使用的降血脂藥物（Statin）就是通過抑制HMG-CoA R活性來實現降血脂的作用。

HMG-CoA R同時也是轉錄因子膽固醇調節元件結合蛋白（sterol regulatory element binding protein，SREBP）2調控的靶基因之一[8]。SREBPs是體內重要的調控脂質合成的核轉錄因子，有SREBP1和SREBP2兩種亞型結構，其中SREBP1優先調控與脂肪酸合成有關的基因，而SREBP2則優先調控與膽固醇合成和攝取相關的基因，如SREBP2可直接調控負責外源膽固醇攝取的LDLR基因和負責內源膽固醇生物合成速率的HMG-CoA R基因[9-10]。

1.2 膽固醇的吸收與轉運

在腸腔中，膽汁、食物和脫落的小腸上皮細胞是膽固醇的主要來源。膳食中的油脂、磷脂、固醇等脂類物質在胃腸道多種消化酶的作用下，分解消化而釋放出游離脂肪酸、單甘油酯、雙甘油酯、甘油三酯以及游離的膽固醇，而游離的膽固醇會與膽鹽復合成微膠粒，這些可溶于水的微小顆粒能透過細胞膜進入肝腸循環。腸上皮細胞中游離的膽固醇，可由細胞膜上的ABCG5/G8介導外排到腸腔中，進而能夠促進體內膽固醇的清除[11]。小腸細胞能夠從膽汁和食物中吸收大量膽固醇，NPC1L1是該過程中的關鍵蛋白，NPC1L1能夠特異性參與小腸對膽固醇的吸收過程，是高效、特異介導膽固醇分子吸收的功能蛋白質[12]。NPC1L1是臨床上使用的膽固醇吸收抑制劑（Ezetimibe）的作用靶點[13]。小腸吸收的游離膽固醇大部分被ACAT重新酯化形成膽固醇酯[14]，在載脂蛋白的作用下同甘油三酯、磷脂及少部分的游離膽固醇一起裝配形成乳糜微粒，經淋巴系統，在脂蛋白脂酶作用下分解成乳糜微粒殘體，再由肝細胞攝取進入血液循環[15]。

1.3 調控膽固醇代謝的信號通路

在肝細胞內，調控膽固醇代謝的信號通路主要有以下5 個[16]：1）LDL可將肝細胞中的膽固醇通過低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）攝取到血漿中，是負責運輸膽固醇到血液中的主要脂蛋白，當LDL特別是氧化后的LDL（oxidized LDL，OX-LDL）過量時，它攜帶的膽固醇就會在血管壁上積存而引起血管硬化，所以人們也把LDL看作是不好的脂蛋白。2）高密度脂蛋白主要在肝臟細胞和小腸上皮細胞內合成，可以攝取血管壁沉浸下來的膽固醇、甘油三酯、LDL等有害物質，轉運到肝臟進而分解后排泄，是一種抗動脈硬化的血漿脂蛋白，俗稱“血管清道夫”，是冠心病的預防因子。3）VLDL可通過脂肪酸合成酶、Ac-CoA羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）和微粒體轉移酶蛋白將膽固醇輸送到血漿中，為動脈硬化的誘導因子，代謝的中間密度脂蛋白也被認為有致動脈硬化的作用。4）肝X受體（liver X receptor，LXR）-α蛋白質和膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7 alpha hydroxylase，CYP7A1）可將胞內的膽固醇分解代謝成膽汁酸，研究發現膽汁酸在動物機體內可通過乳化作用擴大脂肪與脂肪酶的接觸面積進而促進脂肪的水解代謝，在腸道內轉運脂肪，促進脂肪的吸收。5）膽固醇的從頭合成，HMG-CoA R是膽固醇生物合成的限速酶，是SREBP2調控的靶蛋白，其活性的高低直接影響著膽固醇合成的速度，影響體內膽固醇的水平。因此，可通過抑制HMG-CoA R的活性來減少膽固醇的合成。

綜上可知，機體主要通過膽固醇的肝臟細胞和腸上皮細胞的合成、小腸的吸收以及膽汁和糞便的排泄來維持機體內膽固醇的動態平衡，其中HMG-CoA R、NPC1L1、ABCG5/G8、ACAT是調控膽固醇動態平衡的關鍵因子，膽固醇的體內代謝平衡關鍵依賴SREBP2及其下游靶基因LDLR和HMG-CoA R的轉錄調控。

2 乳酸菌調控膽固醇代謝的物質基礎

2.1 體內膽固醇代謝的調控途徑

目前調節血清膽固醇含量的主要措施有：控制攝入食物來源的膽固醇、去除食品中的膽固醇、通過藥物或某些乳酸菌制品控制血清中膽固醇的含量。乳酸菌可通過抑制NPC1L1表達而抑制膽固醇在體內的吸收、介導ABCG5/G8表達上調以及代謝過程中產生膽鹽水解酶（bile salt hydrolases，BSHs）等促進膽固醇的外排，作為調節血清膽固醇含量的主要措施[17-21]。

益生乳酸菌調控體內膽固醇的代謝通路如圖2所示。乳酸菌菌體細胞可通過菌體表面吸附膽固醇、共軛膽固醇解離促進外排來調控機體內脂質和膽固醇的水平。乳酸菌代謝產生的BSHs能將進入腸道內的牛磺酸膽酸鹽、甘氨酸膽酸鹽等結合型膽酸鹽水解成牛磺酸、甘氨酸等游離膽汁酸，游離的膽汁酸不容易被小腸上皮細胞吸收，進入大腸后直接排出體外，由于反饋調節作用導致膽固醇在肝臟內被進一步分解生成新的膽汁酸，從而可以改變體內膽固醇的水平[22]。Kumar等研究表明，具有產生BSHs活性的植物乳桿菌Lp91和Lp21可將介質中膽固醇分別降低（69.30±0.61）μg/mL和（68.88±0.69）μg/mL[23]。由此可見，實驗動物糞便中游離膽酸含量的增加和血清膽固醇水平的減少，間接反映了供試乳酸菌可能是通過其自身產生的BSHs來改變血清中膽固醇的含量。

圖2 益生乳酸菌對機體膽固醇代謝途徑的調控[19]Fig. 2 Probiotic lactobacilli regulate the metabolic pathways of cholesterol in the body[19]

2.2 乳酸菌對膽固醇的調控作用

圖3 益生乳酸菌膽固醇同化機制示意圖[21]Fig. 3 Schematic representation of cholesterol assimilation mechanism by probiotic lactobacilli[21]

由圖3A可知，進入腸腔的膽固醇，經腸上皮細胞的選擇吸附與轉運，再經體循環進入血清，提高了血清膽固醇的含量；由圖3B可知，如腸腔中含有一定數量的益生菌時，益生乳酸菌可與游離的膽固醇結合，經小腸排出體外，阻止多數游離膽固醇被腸細胞吸附而進入血清中。2014年Catherine等研究了11 株乳酸菌降膽固醇的能力，結果發現L. plantarum ATCC 14917對MRS培養基中膽固醇的降解量為（15.18±0.55）mg/1010CFU，L. reuteri NCIMB 701089在模擬腸道中對膽固醇的降解率超過了67%（（2 254.70±63.33）mg/1010CFU）[21]。2018年郭晶晶等從自然發酵豆醬中分離獲得的285 株乳酸菌中選出1 株耐受人工胃腸道環境的植物乳桿菌，研究了該菌株對大鼠血清膽固醇的影響，結果顯示，菌液干預組中大鼠血清中總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇的含量顯著降低（P＜0.05），相對于高脂模型組分別降低了28.92%、22.47%和28.99%[24]。

乳酸菌是人體腸道中的優勢菌群，對維持宿主腸道微生態平衡和提高機體免疫功能起著極其重要的作用[25]。食用活性乳酸菌制品具有預防心腦血管發病的功效[26-28]。田建軍[29-31]、張開屏[32-33]等近幾年先后篩選出1 株嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、1 株敏捷乳桿菌（Lactobacillus agilis）、1 株干酪乳桿菌干酪亞種（Lactobacillus casei subsp. casei）和1 株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），這些菌株對培養基中膽固醇有明顯的降解效果，降解率均高于40%。諸多體外和體內實驗表明，乳酸菌及其發酵產品可通過BSHs同化、吸收和共沉淀等作用來降解膽固醇[34-36]。

2.3 乳酸菌體內降膽固醇的機制

隨著人們對乳酸菌調控膽固醇研究的不斷深入，乳酸菌體內降膽固醇的機制雖然也相繼被提出，但目前主要體現在以下幾個方面。

乳酸菌通過介導轉運蛋白NPC1L1和ABCG5/G8的表達來調控膽固醇的吸收與轉運：腸道內的乳酸菌可通過抑制小腸上皮細胞對膽固醇吸收和促進膽固醇外排來調控體內膽固醇的水平。LXRs包括LXR-α和LXR-β，通過控制轉錄水平參與脂質代謝，主要介導小腸對膽固醇吸收轉運的代謝通路。LXRs被激活后能夠誘導一系列與膽固醇吸收、流出、轉運和分泌相關基因的表達。比如，乳酸菌可通過激活LXRs來抑制腸道對膽固醇吸收關鍵轉運蛋白NPC1L1的表達，進而抑制腸道對膽固醇的吸收[36]。此外，LXRs的激活可促進膽固醇轉運蛋白ABCG5/G8表達上調，ABCG5/G8的過表達將有利于膽固醇從小腸細胞內部排出進入腸腔，進而抑制膽固醇在體內的吸收并促進膽固醇的外排[38-41]。

乳酸菌通過抑制膽固醇合成限速酶HMG-CoA的活性來抑制膽固醇的體內自身合成：乳酸菌能夠通過抑制SREBPs的表達途徑來抑制HMG-CoA的活性，進而降低大鼠血清膽固醇水平。黃燕燕等研究發現，植物乳桿菌（DMDL9010）具有較高的降解膽固醇的能力，其降解機理主要是通過影響HMG-CoA的活性來抑制膽固醇的自身合成[35]。Fukushima等研究發現，用微生態制劑乳酸菌和糞鏈球菌發酵的米糠來飼喂高脂模型大鼠，能夠抑制大鼠肝臟中HMG-CoA的活性，進而降低血清膽固醇水平[42]。

乳酸菌通過調控CYP7A1和BSHs的活性來促進膽固醇的分解代謝：激活膽固醇分解代謝限速酶CYP7A1和BSHs的活性，促進膽固醇的分解也可調控體內膽固醇的水平。Li Chuan[43]和Degirolamo[44]等研究發現乳酸菌可通過提高肝臟細胞CYP7A1的活性來加速肝臟內膽固醇的分解。Shehata等研究發現，益生菌代謝過程中產生的BSHs能水解腸道中牛磺酸膽酸鹽、甘氨酸膽酸鹽等結合態膽鹽，將其轉變為氨基酸和非結合態膽酸，其活性的高低也是控制體內膽固醇的關鍵因素[45]。

雖然乳酸菌對膽固醇代謝調控的機理有以上幾個方面的報道，然而膽固醇代謝是一個多因素、多水平、多蛋白和基因參與的復雜過程，想要厘清乳酸菌與體內膽固醇代謝的關系以及乳酸菌對膽固醇調控的機理，需要從分子水平進行全面系統地研究。目前對乳酸菌調控膽固醇降解機理的研究缺乏系統性，多數研究只針對單個或有限幾個代謝酶或蛋白質的表達量和酶活性進行分析測定，乳酸菌調控這些蛋白質的物質基礎、信號通路以及這些蛋白質的相互關系等研究的很少[46-47]。國立東等從乳酸菌生長培養基、細胞模型和體內3 個方面綜述了乳酸菌降膽固醇的機制[16]。乳酸菌調控膽固醇代謝的物質是菌株代謝產物還是細胞壁組分，是直接調控還是間接調控？這些方面的研究報道相對較少。

3 展 望

乳酸菌降膽固醇機制的研究多是基于生長培養基而提出，不能反映體內的真實情況，因此通過動物機體實驗研究乳酸菌降膽固醇的物質基礎、代謝途徑、信號通路成為當前亟待解決的問題。

3.1 利用差異蛋白質組學分析技術，研究調控膽固醇代謝的功能蛋白質

小鼠、大鼠等嚙齒類動物與人類具有相似的消化道解剖結構和代謝過程，因而常被用作建立與人類代謝相關因素的重要模型。分別提取實驗小鼠血漿和肝臟組織樣品，利用差異蛋白質組學技術從中篩選出表達差異的蛋白質，利用質譜技術進行蛋白質鑒定和功能分析，探究受乳酸菌的影響膽固醇代謝過程中差異蛋白質的功能特性。

蛋白質組學通常有兩種研究策略：一種為全譜蛋白質組學；另一種為差異蛋白質組學。差異蛋白質組學著重找出有意義的差異蛋白并不要求捕獲全部蛋白，具有較好的應用前景。因此，差異蛋白組學技術已在食物蛋白質的研究、基因工程產物的鑒定、疾病的早期診斷等方面得到了廣泛應用。2012年de Magalh?es等應用差異蛋白質組學技術，鑒定出47 種芒果不同成熟階段差異表達的蛋白質，為芒果成熟過程中的生物學變化提供了依據[48]。2018年于長青等研究了降膽固醇能力不同的植物乳桿菌蛋白間的差異蛋白，得到了烯醇化酶、果糖-二磷酸醛縮酶、烯酰-酰基載體蛋白還原酶等24 種與膽固醇代謝相關的差異表達蛋白，并探討了乳酸菌調控膽固醇的作用機理，其表達量可能與菌株降膽固醇作用有關[49]。

3.2 利用PCR Array技術，分析與膽固醇代謝信號通路相關的多個基因表達變化情況

聚合酶鏈式反應芯片（polymerase chain reaction array，PCR Array）技術將熒光定量PCR技術與高通量芯片技術相結合，在一張96 孔板上同時對某個信號通路或疾病相關的多個基因的表達量變化情況進行檢測，芯片上的基因包括了與研究對象有確定關系的基因或者待研究考證的基因。Qiagen Atherosclerosis PCR Array包含脂蛋白和膽固醇代謝信號通路相關的86 個關鍵基因PCR Array，可以分析機體肝臟脂蛋白、膽固醇代謝信號通路相關基因mRNA表達的變化情況。Karén等用與人血管生長相關基因的96 孔板PCR Array功能分類芯片分析了在體外丙戊酸對人血管細胞的影響，結果表明，經丙戊酸處理后人體血管細胞中有涉及白介素-8、內皮細胞存活的血管生成素、內皮細胞血管成熟與穩定的成纖維細胞生長因子受體等14 個基因表達的改變與血管的穩定和成熟有相關性[50]。張妮等利用PCR Array技術探討了丹參酮調控高脂血癥大鼠肝臟脂質代謝的機制，結果發現Abca1、Apoa1、Lep、Cyp7a1、Hmgcr、Cyp11a1、Insig2、Ldlr、Lcat、Pcsk9共10 個基因上調不低于200%或下調不超過50%，這些基因與抑制SREBP之間存在相互調控作用[51]。

以上研究提示PCR Array功能分類芯片作為一種快速、準確的技術手段，可應用于探究機理的研究中。乳酸菌對膽固醇代謝影響機理與藥物作用機理的研究具有一定的相似性。同時，研究上述蛋白質和相關基因在影響膽固醇代謝過程的相互關系，使蛋白質差異組學分析結果和PCR Array分析結果可以進行相互驗證。

4 結 語

近年來，國內外學者從生長培養基、肝細胞模型、腸細胞模型、受試個體等多個層面分別提出了乳酸菌降膽固醇的各種機制假說，但其作用方式受多種因素影響，作用機制復雜，至今尚無定論。隨著定量PCR技術和差異蛋白質組學技術的成熟與完善，利用生物組學技術和定量PCR技術從整體上研究同一菌株在不同功能條件下蛋白質表達譜和代謝譜的差異性，為從本質上厘清乳酸菌降膽固醇機理提供新的思路。

對乳酸菌對膽固醇代謝調控物質基礎研究的展望能在一定程度上較全面、系統地提供較多的關于膽固醇代謝與肝臟脂蛋白和膽固醇代謝信號通路中相關基因mRNA表達變化的信息。結合差異蛋白質組學分析，研究乳酸菌降膽固醇的物質基礎及其對膽固醇調節的信號轉導通路，可在分子水平上揭示乳酸菌對體內膽固醇代謝影響的活性物質基礎及其調控機理。