鈣與乳蛋白的相互作用機制及對其功能特性的影響研究進展

李向瑩，趙 烜，秦于思，陳 笛，王存芳*

（齊魯工業大學（山東省科學院）食品科學與工程學院，山東 濟南 250353）

乳中蛋白質主要由酪蛋白和乳清蛋白組成，其中酪蛋白是由磷酸鹽基團和絲氨酸酯化得到的結合蛋白，約占乳中蛋白質80%，乳清蛋白是球狀蛋白，約占乳蛋白的20%[1]。鈣是人體的重要組成成分，參與人體重要的生理活性過程，能夠有效維持體內酸堿平衡，具有控制新陳代謝、激素分泌等多種生理活性[2]。乳制品是人類膳食攝取鈣的最佳途徑，能為人體提供合理的鈣磷比。由于乳蛋白自身結構的不同，鈣離子與酪蛋白、乳清蛋白發生相互作用。該反應不僅影響酪蛋白膠束結構的穩定性，對其自身的熱穩定性、乳化性、溶解性、起泡性和凝膠性等功能特性也會產生影響。因此，研究鈣與乳蛋白的相互作用以及對乳蛋白的功能性調控具有重要意義。

1 乳中鈣的組成

鈣在乳中主要以膠束鈣和可溶性鈣兩種形式存在，這兩種形式的鈣在膠束相和乳清相中形成動態平衡[3]。在膠束相中，鈣主要是作為無定形膠體磷酸鈣（colloidal calcium phosphate，CCP）存在于酪蛋白膠束中或作為與磷酸絲氨酸殘基結合的鈣離子的形式存在[4]。其中，CCP中的膠束鈣可參與中和磷酸絲氨酸殘基中的負電荷，起到連接酪蛋白的作用。而乳清相中的可溶性鈣則以檸檬酸鈣、磷酸鹽或游離鈣離子的形式存在[5]。不同乳源中鈣的含量不同，其在膠束相和乳清相中的分布也不盡相同（表1）。

表1 不同乳源中鈣的含量及其分布[6-7]Table 1 Calcium contents and distribution in different milk sources[6-7]

2 鈣與酪蛋白的相互作用機制

酪蛋白主要由αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白構成，其自身的交聯和聚合的產生均與鈣離子有關[8]。酪蛋白單體組分含有多個磷酸絲氨酸殘基的磷酸基團，可與鈣離子有效結合，降低靜電穩定機制作用，從而導致酪蛋白酸鹽亞膠束的締合，對穩定酪蛋白膠束的結構具有重要作用[9]。由于酪蛋白單體中磷酸鹽含量不同，其對鈣離子的敏感性從高到低依次為αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白[10]。此外，在鈣離子存在的情況下形成的酪蛋白絡合物與單個酪蛋白聚合體相比，酪蛋白絡合物較聚合體對鈣具有更強的親和性[11]。

2.1 鈣與αs-酪蛋白和β-酪蛋白的相互作用

圖1 鈣與酪蛋白的相互作用機制Fig. 1 Mechanism of interaction between calcium and casein

αs-酪蛋白可分為αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白。αs1-酪蛋白由199 個氨基酸組成，沒有半胱氨酸殘基，有結合8 個磷酸根離子的絲氨酸[12]。αs1-酪蛋白與鈣結合的機制如圖1A所示，αs1-酪蛋白含有3 個疏水性區域（殘基1～44、90～113和132～199），兩個親水性區域將其進行區分，其中45～89序列的親水性區域含有磷酸酯基團的結合位點，經酶解后可與鈣離子結合。與含有的磷酸根離子相似，在中性pH值下，每摩爾磷酸酯基團可結合8 mol Ca2+[13]。Ca2+與αs1-酪蛋白發生吸附作用，隨著鈣離子濃度提高，αs1-酪蛋白表面電荷減少，Zeta電位下降，導致CCP鹽含量增加，膠體發生凝集作用，穩定性降低[14]。而通過添加檸檬酸鹽或磷酸鹽可減少乳中的鈣離子含量，CCP減少，乳穩定性增加[10]。

如圖1B所示，與αs1-酪蛋白相比，αs2-酪蛋白含有2 個半胱氨酸殘基，形成二硫橋，在絲氨酸上可結合10 個磷酸根離子，對Ca2+較為敏感[15]。另外，其含有2 個磷酸化絲氨酸殘基簇（SerP-SerP-SerP-Glu-Glu），使其結合Ca2+的能力增強。αs2-酪蛋白含有2 個疏水性區域（殘基90～120、160～207）和2 個親水性區域，含有磷酸酯基團的結合位點大致位于8～12、56～63、129～133序列中，在中性pH值條件下，每摩爾αs2-酪蛋白可與10 mol Ca2+進行結合[12]。

如圖1C所示，β-酪蛋白含有一個疏水性的C端區域和高電荷的N端區域，是疏水性最強的蛋白質，在絲氨酸殘基上可結合5 個磷酸根離子。β-酪蛋白在親水性區域（殘基1～44）含有磷酸酯基團結合位點，主要位于14～21序列中，在中性條件下，每摩爾磷酸酯基團可結合5 mol Ca2+[16]。相對于αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白，β-酪蛋白對Ca2+的敏感性較低。

總之，鈣與酪蛋白相互作用機制在于αs-酪蛋白的磷酸基團以及β-酪蛋白N端的羧基，兩者均具有SerP-SerP-SerPX-SerP序列，共同構成酪蛋白的中心位置，對鈣離子較敏感，易于與大量鈣離子結合，從而產生酪蛋白沉淀[17-18]。

2.2 鈣與κ-酪蛋白的相互作用

κ-酪蛋白位于酪蛋白膠束外圍，是酪蛋白中唯一一個被糖基化的蛋白質。與其他酪蛋白不同，κ-酪蛋白沒有磷酸絲氨酸簇和蘇氨酸糖苷化殘基，只含有1 個磷酸絲氨酸殘基，不能強烈地與鈣離子結合，對鈣離子誘導沉淀不敏感[19]。在pH 6.6時，每摩爾的κ-酪蛋白只能結合2 mol Ca2+。κ-酪蛋白這種特殊的化學結構，使其具有較強的親水能力，在Ca2+存在時，它可以抑制對鈣離子敏感的αs-酪蛋白和β-酪蛋白發生沉淀，具有穩定酪蛋白膠束空間結構的作用[20-21]。同時，鈣離子也可通過屏蔽帶負電荷的基團來減少膠束電荷，防止κ-酪蛋白在特定pH值下的解離。當κ-酪蛋白中Phe105-Met106肽鍵被酶分解為副-κ-酪蛋白和酪蛋白糖巨肽時，前者隨酪蛋白膠束一同沉淀，后者由于高負電荷和強極性存在于溶液中，穩定作用喪失[22]（圖2）。

圖2 凝乳酶對κ-酪蛋白的分解示意圖[22]Fig. 2 Schematic diagram of the decomposition of κ-casein by chimosin[22]

3 鈣與乳清蛋白的相互作用機制

乳清蛋白主要由α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、乳鐵蛋白、免疫球蛋白等微量小分子蛋白構成[1]。在乳清相中，可溶性鈣質量占牛乳中總鈣的31%，主要位于α-乳白蛋白中。與含有較多鈣離子結合位點的αs-酪蛋白和β-酪蛋白不同，α-乳白蛋白含有1 個鈣活性中心，可以和鈣離子結合[23]。

3.1 鈣與α-乳白蛋白的相互作用

α-乳白蛋白是金屬結合蛋白，與鈣的相互作用機制在于其含有α-螺旋和β-片狀2 個固有結構域。該結構域由半胱氨酸殘基Cys73和Cys91之間的二硫橋連接，形成Ca2+結合環。蛋白分子中的天冬氨酸殘基Asp82、Asp87、Asp88的羧基氧配體和Asp84、Lys79的羰基氧化物以及1 個或2 個水分子均可與1 分子的Ca2+強烈結合，形成五角雙錐結構[24]（圖3）。Ca2+與α-乳白蛋白結合影響其三級結構以及分子穩定性。在pH值低于3.5時，α-乳白蛋白發生構象的酸轉變，其原因在于，高濃度的H+對Ca2+結合部位進行競爭，從而減弱α-乳白蛋白與Ca2+的結合，引起構象的轉變[25]。另外，Ca2+與α-乳白蛋白結合在抵抗熱變性方面具有穩定性：在Ca2+存在下，α-乳白蛋白與鈣發生聚合，其自然態和變性態的熱轉變溫度超過40 ℃，熱穩定性提高，即使在低溫下變性后仍可復性。但當pH值低于5時，α-乳白蛋白由于溫度和濃度的變化發生構象的改變，Asp殘基質子化，結合Ca2+的能力減弱甚至喪失[26]，熱穩定性降低，低溫下發生變性，變性后不再復性。由于α-乳白蛋白具有良好的Ca2+親合力，當Ca2+重新與α-乳白蛋白結合時，在低溫下可恢復其天然結構[12]。

圖3 鈣與α-乳白蛋白的相互作用Fig. 3 Interaction between calcium and α-lactalbumin

3.2 鈣對β-乳球蛋白和κ-酪蛋白相互作用的影響

乳清蛋白與酪蛋白膠束在經過高溫處理時，兩者通過巰基-二硫鍵反應發生相互作用，而鈣離子的存在促進了β-乳球蛋白的熱變性以及其與κ-酪蛋白間的相互作用，使得膠束表面κ-酪蛋白C-末端的“毛發”部分變得僵直，從而降低膠束的靜電排斥作用和位阻作用，在酪蛋白分子間形成鈣橋，導致乳蛋白產生絮凝[27]。關于鈣對β-乳球蛋白和κ-酪蛋白相互作用的影響機制，目前研究較少。Smits等[28]發現，Ca2+可能通過與蛋白質中的離子基團形成復合Ca2+鍵，導致分子間排斥減少以及分子間疏水鍵的形成，對于較低濃度的β-乳球蛋白和酪蛋白膠束的熱誘導結合具有促進作用。另外，在乳清相中添加鈣離子可明顯減少酪蛋白膠束中κ-酪蛋白的解離[29]。由此表明，增加乳清中鈣離子含量可促進熱處理后酪蛋白膠束-乳清蛋白聚集體的生成，而降低乳清蛋白聚集體在乳清相中的比例。

4 鈣對乳蛋白功能特性的影響

4.1 鈣對乳蛋白熱穩定性的影響

鈣離子在乳熱處理時對酪蛋白膠束完整性具有重要作用。85 ℃及以上溫度進行熱處理時，對鈣離子敏感的αs酪蛋白暴露，與游離的鈣離子結合，從而減少表面電荷量，產生活性位點，膠束平衡發生破壞，酪蛋白發生凝聚，產生沉淀[17,30]。Singh等[29]發現，將不同鈣含量乳在90 ℃處理10 min后，可溶性鈣含量低于326 mg/kg時，所有酪蛋白發生解離，而增加乳中可溶性鈣含量至434 mg/kg時，膠束中αs1酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白的解離則會被抑制。此時，鈣離子與游離無機磷酸鹽和檸檬酸鹽的結合增加，促進磷酸鈣和檸檬酸鈣復合物在膠束中的形成，pH值降低，Zeta電位增加，同時酪蛋白與CCP通過非共價二硫鍵生成酪蛋白聚合體，導致乳中可溶性酪蛋白含量降低，膠束體系不穩定，熱穩定性降低[31-33]。

當乳清蛋白溶液在65 ℃以上進行高溫處理時，蛋白構象展開，活性氨基酸暴露，疏水作用增強。鈣離子的存在不僅提高了α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的熱變性敏感度，還促進了乳清蛋白與鈣離子結合形成鈣-蛋白復合物，分子間的靜電斥力減小，溶液產生絮凝，乳熱穩定性降低[34]。

另外，螯合劑與鈣離子結合對乳蛋白的熱穩定性也會產生重要影響。當添加螯合劑時，乳中鈣鹽的含量和形式發生重要變化，可溶性鈣濃度顯著上升，而膠體鈣濃度顯著下降。郭本恒[35]認為，在pH 6.6～7.0范圍內，初乳中加入0.002～0.020 mol/L的螯合劑乙二胺四乙酸，其可與乳中的游離鈣結合，提高乳蛋白質的熱穩定性（圖4）；加入0.2 mol/L乙二胺四乙酸，其在與游離鈣結合的同時還會與CCP、酪蛋白爭奪鈣離子，從而破壞膠體平衡體系，降低乳蛋白的熱穩定性。

圖4 鈣對乳蛋白的穩定性的影響[35]Fig. 4 Effect of calcium on the stability of milk proteins[35]

4.2 鈣對乳蛋白乳化特性的影響

鈣離子與蛋白質結合，對蛋白質在油-水界面的吸附行為以及乳濁液的穩定性具有重要影響。如圖5所示，濃縮乳蛋白（milk protein concentrate，MPC）溶液的乳化活性與其脫鈣程度呈正相關，其乳化穩定性在脫鈣率為20%～40%時逐步增強，特別是脫鈣率40%的MPC溶液可獲得較好的乳化活性和乳化穩定性[36]。其原因在于，酪蛋白膠束隨鈣離子的脫除發生一定程度的解離，蛋白分子在油-水界面的吸附性增強，與油相更好地結合，同時由于鄰近蛋白間通過疏水相互作用在溶液表面形成薄膜，界面張力降低，表面活性蛋白增加，形成穩定的乳濁液，乳化能力增強[37-38]。

王耿等[39]指出，乳化前后添加鈣離子均會導致乳濁液的穩定性降低。乳化前添加鈣離子，乳蛋白特別是吸附在油滴表面的蛋白質會發生聚集，表面蛋白有效擴散受到限制，從而導致乳化液滴產生絮凝，其粒徑增大，分子排列更加致密，蛋白間排斥力下降，表面蛋白負載增加，乳濁液的穩定性降低[40-41]；在乳化后添加鈣離子，親和鈣離子基團暴露，形成蛋白質-鈣-蛋白質交聯，從而造成蛋白質絮凝。

圖5 鈣對乳蛋白的乳化特性影響[36]Fig. 5 Effect of calcium on emulsifying properties of milk proteins[36]

4.3 鈣對乳蛋白溶解性的影響

αs1酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白的溶解性與鈣離子濃度有關，而κ-酪蛋白的溶解性不受鈣離子濃度變化的影響。鈣離子濃度能夠明顯影響乳蛋白的溶解性。在鈣離子濃度為1～3 mmol/L時，鈣離子與磷酸絲氨酸基團和羧基化基團結合，大部分結合酪蛋白仍保持溶解，濁度稍微增加；在鈣離子濃度達到3～5 mmol/L時，鈣離子繼續與羧基化基團結合，減少靜電排斥，酪蛋白溶解性呈現急劇下降，溶液濁度迅速增加最終形成沉淀[11]。有研究學者認為，酪蛋白的聚集導致MPC溶解度的降低，而鈣離子的脫除減少了蛋白之間的非共價交聯，促進MPC的溶解[42]。劉大松等[43]通過測定不同脫鈣程度的MPC在不同貯藏時間的溶解度（圖6）發現，脫鈣率11%～37%的MPC溶液初始溶解度較未脫鈣MPC溶液的初始溶解度高，脫鈣程度與初始溶解度呈正相關；35 ℃培養箱中貯藏112 d，脫鈣率越高的MPC，溶解度隨貯藏時間延長降低得越慢，脫鈣率11%～19%對MPC溶液溶解度的降低具有延緩作用，脫鈣率19%及以上對MPC溶液溶解度降低具有顯著的控制作用，在此條件下，溶解度良好且均達到90%以上。

圖6 鈣對乳蛋白的溶解性影響[43]Fig. 6 Effect of calcium on the solubility of milk proteins[43]

4.4 鈣對乳蛋白起泡特性的影響

圖7 鈣對乳蛋白的起泡特性影響[47]Fig. 7 Effect of calcium on foaming properties of milk proteins[47]

乳蛋白的起泡特性不僅與其在空氣-水界面的表面張力有關，其亦與鈣離子濃度相關[44-45]。在乳清蛋白溶液中，Ca2+濃度為0.02～0.40 mol/L時，蛋白質分子發生交聯，形成黏彈性較好的膜，蛋白溶液的起泡性得到顯著改善[46]。乳中鈣離子的脫除對濃縮乳蛋白的起泡性具有促進作用。劉大松[47]通過對不同pH值誘導脫鈣處理的MPC溶液進行起泡性和泡沫穩定性（圖7）的測定時發現，pH值從6.7降低到6.0的酸化條件下，脫鈣率從37%增加到55%，MPC溶液的起泡性和泡沫穩定性略有增加；pH值從6.0降低到5.4的酸化條件下，脫鈣率從55%增加到82%，MPC溶液的起泡性和泡沫穩定性顯著提高，且脫鈣程度與起泡性和泡沫穩定性呈正相關。鈣離子的脫除使得膠束酪蛋白解離速度加快，游離酪蛋白含量增多，從而加快在泡沫體系中形成穩定的界面膜，界面張力降低，泡沫體系黏度增加，溶液的起泡性和泡沫穩定性增加[48]。

4.5 鈣對乳蛋白凝膠特性的影響

研究表明，牛奶的凝膠化可能由多種因素共同引起，比如CCP含量的增加；通過鈣離子聚集牛奶中加熱的乳清蛋白；鈣離子誘導乳的pH值降低等。因此，鈣與乳蛋白的凝膠特性具有明顯相關性[49-50]。Ramasubramanian等[51]研究表明，在未預熱的牛乳中添加10 mmol/L和12.5 mmol/L氯化鈣，加熱不會導致乳凝膠的產生，但會明顯增加牛乳樣品的黏度；而分別在未預熱的牛乳中添加15、17.5 mmol/L和20 mmol/L氯化鈣時，牛乳樣品的黏度增加，并且伴隨著凝膠的形成。其原因在于，在乳中添加可溶性鈣鹽，乳中鈣離子含量增加，引起CCP含量增加，乳中pH值降低，膠束之間的靜電排斥作用下降，從而誘導加熱乳凝膠的發生[52]。

鈣的脫除對乳凝膠形成具有抑制作用。徐雨婷[36]將脫鈣MPC凝膠進行激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）和掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察，發現未脫鈣MPC凝膠的組織結構緊密，蛋白分布均勻；11.1%鈣脫除使得凝膠出現空隙，結構變得疏松，影響形成凝膠的強度，但并未阻礙其凝膠結構的形成；18.6%～37.1%鈣脫除使得凝膠結構卷曲程度增加，空隙數量增多，孔徑增大，凝膠強度降低，阻礙凝膠網絡結構的形成（圖8中A1～A4、I～IV）。當用氯化鈣來回補脫鈣MPC系統時，發現可溶性鈣的回補可促進蛋白間的交聯，使其形成凝膠結構。11.1%～18.6%脫鈣MPC溶液進行鈣的回補后，可基本恢復未脫鈣時的凝膠結構，37.1%脫鈣MPC溶液進行鈣的回補后，則無法恢復原狀（圖8B1～B4、V～VIII）。

圖8 不同脫鈣處理MPC的凝膠特性[36]Fig. 8 Gel characteristics of milk protein with different decalcification treatments[36]

5 結 語

隨著對鈣與乳蛋白相互作用的深入研究，針對其功能特性應用于乳品生產中，具有巨大的潛在市場。胡錦華等[27]通過蛋白與難溶性鈣鹽的相互作用制得一種新型鈣增強劑，可將其應用于速溶型高鈣乳粉的生產中。Ganugapati[53]通過離子交換脫鈣處理乳蛋白保留物得到一種干燥蛋白成分，可將其應用于乳化或蛋白質穩定的食品生產中。鈣的脫除引起乳的起泡性和泡沫穩定性增強，這可擴寬其在攪拌奶油、奶油蛋糕等食品中的應用；脫鈣引起乳化能力增強，可擴寬其在巧克力、餅干等食品中的應用；脫鈣引起溶解性增強，可擴寬其在半透明或透明飲料中的應用；而對于鈣含量增加使乳凝膠性增強這一特點，可將其應用于酸奶等發酵食品中。因此，乳中鈣離子含量的高低是獲得不同需求乳制品的關鍵。目前，雖有許多研究報道了鈣與乳蛋白的相互作用及其功能特性，但是研究內容較片面。不同乳源所含蛋白質組成不同，其與鈣離子的作用機理也不盡相同，由此所產生的功能性質有待進一步的研究。繼續開展不同乳源中鈣與蛋白質相互作用的研究，根據其不同的功能特性將其應用于功能性乳制品的生產中具有重要實際意義，可為實際生產提供理論支持。