不同來源紅緣擬層孔菌粗多糖的抗氧化活性

聶琳然，郝利民,*，王滔滔，劉 陽，張黎明，魯吉珂,3，康彩彩，崔 燕，韓培培，賈士儒,*

（1.天津科技大學(xué) 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.軍事科學(xué)院軍需工程技術(shù)研究所，北京 100010；3.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001）

機(jī)體長期處于輻射、高壓、缺氧等應(yīng)激環(huán)境時(shí)會產(chǎn)生大量自由基，過多的自由基會對機(jī)體造成嚴(yán)重的氧化損傷，進(jìn)而引發(fā)癌癥、糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病[1-2]?？寡趸瘎┠軌蛴行Ц纳蒲趸瘧?yīng)激損傷，天然抗氧化劑具有來源廣、毒性低、無副作用等優(yōu)勢，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[3]。食藥用真菌富含多糖、多酚、黃酮等多種抗氧化活性物質(zhì)，不僅能有效清除多種自由基，還可與金屬離子絡(luò)合減少自由基的產(chǎn)生[4-5]，其開發(fā)前景廣闊。

紅緣擬層孔菌（Fomitopsis pinicola）又名“紅緣層孔菌”、“紅緣多孔菌”、“紅緣樹舌”等，是一種藥用價(jià)值較高的大型真菌，紅緣擬層孔菌在我國分布較廣，且以我國東北地區(qū)最為常見[6]；其味微苦、性平，具補(bǔ)肺益腎、安神定志、扶正培本、滋補(bǔ)強(qiáng)壯和祛風(fēng)除濕等作用，對腎炎、支氣管炎、癌癥、心臟病、糖尿病等有特效，民間常用于治療“寒腿”病[7]。據(jù)報(bào)道，紅緣擬層孔菌水提物具有抗腫瘤、抗菌抗炎、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等作用[8]。多糖是紅緣擬層孔菌的主要生物活性成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤、保肝護(hù)肝等多種活性[9-12]，在保健食品、功能性化妝品和抗腫瘤藥物的開發(fā)方面具有很好的前景。近年，紅緣擬層孔菌多糖抗氧化活性的主要研究對象為子實(shí)體多糖，對不同來源紅緣擬層孔菌多糖抗氧化活性的對比研究報(bào)道甚少。不同來源的多糖在結(jié)構(gòu)或組成上有明顯差異，且對紅緣擬層孔菌進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，可有效解決其子實(shí)體生長周期長、自然資源少、培植難度大等問題。本實(shí)驗(yàn)對3 種不同產(chǎn)地（吉林、黑龍江、云南）紅緣擬層孔菌子實(shí)體、菌絲體及其發(fā)酵液多糖的抗氧化活性進(jìn)行比較研究，可為了解不同產(chǎn)地紅緣擬層孔菌子實(shí)體、菌絲體及其發(fā)酵液多糖的抗氧化活性差異提供參考依據(jù)，有助于紅緣擬層孔菌的開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

紅緣擬層孔菌（Fomitopsis pinicola）菌種由軍事科學(xué)院軍需工程技術(shù)研究所提供；紅緣擬層孔菌子實(shí)體分別購自吉林、黑龍江、云南，經(jīng)軍事科學(xué)院軍需工程技術(shù)研究所鑒定。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）A.S.2399由天津科技大學(xué)省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯(lián)氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS）、牛血清白蛋白 美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L、酵母粉5 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO4·7H2O 10 g/L，pH 6；發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖50 g/L、酵母粉10 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO4·7H2O 10 g/L，pH 5；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L，自然pH值。在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的瓊脂制備固體培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

JA12002型電子天平 上海精科天平儀器廠；PHSJ-4A型pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；TDA-8002型恒溫水浴鍋天津市中環(huán)試驗(yàn)電爐有限公司；TGL16G型離心機(jī) 上海醫(yī)用分析儀器廠；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；ALPHA 1-4/LD型冷凍干燥機(jī) 德國CHRIST公司；QL-902型漩渦振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；UVmini-1240型紫外-可見分光光度計(jì) 島津國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅緣擬層孔菌粗多糖的制備

將紅緣擬層孔菌接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r/min下培養(yǎng)4.5 d，過濾分別得紅緣擬層孔菌菌絲體（Fomitopsis pinicola mycelium，F(xiàn)PM）及其發(fā)酵液（F. pinicola fermentation broth，F(xiàn)PFB），F(xiàn)PM冷凍干燥。紅緣擬層孔菌子實(shí)體（F. pinicola fruiting body，F(xiàn)PF）為自然風(fēng)干，粉碎處理后，烘干至恒質(zhì)量。

分別取FPM凍干粉及3 種不同產(chǎn)地（吉林、黑龍江、云南）FPF（分別記為JFPF、HFPF、YFPF）烘干粉各50 g，按料液比1∶25（m/V）加入蒸餾水，熱水浸提（85 ℃、2 h）2 次，抽濾合并濾液，得多糖提取液。各多糖提取液和FPFB分別濃縮至原體積的1/5，加入3 倍體積95%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇溶液，4 ℃醇沉12 h，離心（10 000 r/min、8 min）收集沉淀，沉淀用95%乙醇溶液洗2～3 次后冷凍干燥，得各樣品粗多糖[13]。按式（1）計(jì)算粗多糖提取率。

式中：m1為樣品所得粗多糖質(zhì)量/g；m2為樣品質(zhì)量/g；n為稀釋倍數(shù)。

1.3.2 粗多糖中總糖和蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法[14]測定粗多糖中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)；以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法[15]測定粗多糖中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)；以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用咔唑-硫酸法[16]測定粗多糖中糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

結(jié)合糖蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定：分別將5 mg/mL、60 mL的JFPF、HFPF、YFPF、FPM、FPFB 5 種粗多糖溶液與20 mL Sevag試劑（氯仿、正丁醇體積比為4∶1）混合，磁力攪拌20 min，將溶液轉(zhuǎn)移至分液漏斗，靜置分層，去除蛋白層和氯仿相，收集水相，重復(fù)上述操作至蛋白層不再出現(xiàn)，真空濃縮，冷凍干燥，得脫蛋白粗多糖。采用BCA法[15]測定脫蛋白后粗多糖中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即結(jié)合糖蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3 分子質(zhì)量分布的測定

待測多糖樣品的制備：5 種粗多糖經(jīng)AB-8大孔樹脂脫色、Sevag法除蛋白、真空濃縮，冷凍干燥得待測樣品。

采用高效凝膠滲透色譜法[17]對上述待測多糖樣品的分子質(zhì)量進(jìn)行測定。色譜條件：色譜柱：TSK-GEL G4000 PW XL凝膠過濾柱（7.8 mm×30.0 cm，10 μm）；流動(dòng)相：超純水；流速：0.5 mL/min；檢測器：RI-101示差折光檢測器；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

將已知分子質(zhì)量的系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下測定，以分子質(zhì)量對數(shù)為橫坐標(biāo)（X（lg Mw）），保留時(shí)間（Y/min）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：Y＝-0.274 3X+5.912 2（R2＝0.998 8）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算紅緣擬層孔菌多糖樣品分子質(zhì)量。

1.3.4 體外抗氧化活性的測定

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力

分別將1 mL 1.0～5.0 mg/mL的5 種多糖樣品溶液與0.5 mmol/L DPPH-乙醇溶液、60%乙醇按體積比1∶1∶10混合均勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測定吸光度（A517nm）?？瞻捉M和樣品本底分別以等體積無水乙醇代替樣品溶液和DPPH-乙醇溶液[18]。以VC為陽性對照。按式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：Ai為實(shí)驗(yàn)組A517nm；Aj為樣品本底A517nm；A0為空白組A517nm。

1.3.4.2 ABTS陽離子自由基清除能力

將7.4 mmol/L ABTS和2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合并于黑暗處靜置12～16 h，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）稀釋該混合液至其在734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02，得ABTS工作液。分別取1 mL 1.0～5.0 mg/mL的5 種多糖樣品溶液與ABTS工作液按體積比1∶6混合均勻，室溫下反應(yīng)6 min后于734 nm波長處測定吸光度（A734nm）?？瞻捉M和樣品本底分別以等體積蒸餾水代替樣品溶液和ABTS工作液[19]。以VC為陽性對照。按式（3）計(jì)算ABTS陽離子自由基清除率。

式中：Ai為實(shí)驗(yàn)組A734nm；Aj為樣品本底A734nm；A0為空白組A734nm。

1.3.4.3 羥自由基清除能力

將1 mL 1.0～5.0 mg/mL的5 種多糖樣品溶液中依次加入5 mmol/L H2O2溶液、5 mmol/L FeSO4溶液、蒸餾水各2 mL，最后加入2 mL 5 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，混合均勻，室溫反應(yīng)30 min，于510 nm波長處測定吸光度（A510nm）。空白組和樣品本底分別以等體積蒸餾水代替樣品溶液和H2O2溶液[20]。以VC為陽性對照。按式（4）計(jì)算羥自由基清除率。

式中：Ai為實(shí)驗(yàn)組A510nm；Aj為樣品本底A510nm；A0為空白組A510nm。

1.3.4.4 還原能力

采用鐵氰化鉀法測定樣品的還原能力。分別將1 mL 1.0～5.0 mg/mL的5 種多糖樣品溶液與1 g/100 mL鐵氰化鉀溶液、磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）按體積比1∶1∶1混合，50 ℃水浴20 min，加入2 mL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液，3 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液與等體積蒸餾水和0.2 mL 0.3 g/100 mL三氯化鐵溶液混合，50 ℃水浴10 min，于700 nm波長處測定吸光度（A700nm）。樣品本底以等體積蒸餾水代替三氯化鐵溶液[21]。以VC為陽性對照。按式（5）計(jì)算還原能力。

式中：Ai為實(shí)驗(yàn)組A700nm；Aj為樣品本底A700nm。

1.3.5 氧化損傷酵母細(xì)胞保護(hù)能力的測定

1.3.5.1 紫外損傷酵母細(xì)胞保護(hù)能力

將酵母菌在液體YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，4 000 r/min離心5 min，收集菌體。用磷酸鹽緩沖液（pH 6.9）洗1～2 次，并懸浮其中得酵母菌懸液。將不同質(zhì)量濃度（4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 mg/mL）的5 種多糖樣品溶液與菌懸液按體積比4∶1混合，然后在致死條件（20 W、距離30 cm，60 s）下進(jìn)行紫外處理。將處理后各菌液梯度稀釋涂布于固體YEPD培養(yǎng)基中，28 ℃倒置培養(yǎng)48 h，菌落計(jì)數(shù)?？瞻捉M以等體積磷酸鹽緩沖液代替樣品溶液，對照組以等體積磷酸鹽緩沖液代替樣品溶液且未經(jīng)紫外照射[22]。以VC為陽性對照。按式（6）計(jì)算酵母細(xì)胞存活率。

式中：Ai為實(shí)驗(yàn)組酵母單菌落數(shù)；Aj為空白組酵母單菌落數(shù)；A0為對照組酵母單菌落數(shù)。

1.3.5.2 H2O2損傷酵母細(xì)胞保護(hù)能力測定

按1.3.5.1節(jié)的方法制得酵母菌懸液。分別將4 mL不同質(zhì)量濃度（4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 mg/mL）的5 種多糖樣品溶液與1 mL菌懸液于試管中混合，加入致死劑量（體積分?jǐn)?shù)2%）的H2O2溶液1 mL，37 ℃水浴振蕩1 h。空白組以等體積磷酸鹽緩沖液代替樣品溶液，對照組以等體積磷酸鹽緩沖液代替樣品溶液且未經(jīng)體積分?jǐn)?shù)2%的H2O2溶液處理[22]。處理后的菌液按1.3.5.1節(jié)描述的方法培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，按式（6）計(jì)算酵母細(xì)胞存活率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源紅緣擬層孔菌粗多糖的基本組分

不同來源紅緣擬層孔菌粗多糖的基本組分見表1。FPM粗多糖得率為5.90%，明顯高于3 種子實(shí)體；在3 種子實(shí)體中，HFPF和YFPF粗多糖得率接近，分別為2.91%和2.56%，JFPF粗多糖得率最低，僅為0.75%。5 種粗多糖的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在差異，3 種子實(shí)體粗多糖的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于菌絲體粗多糖，其中YFPF粗多糖的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為71.65%，F(xiàn)PFB粗多糖的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)同樣較菌絲體粗多糖高，為56.04%。水提粗多糖中常含有部分游離蛋白質(zhì)和結(jié)合糖蛋白，因此，蛋白質(zhì)含量是粗多糖的重要檢測指標(biāo)之一[23]。由表1可知，5 種粗多糖的總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均小于13%，其中FPFB、JFPF、HFPF的總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)接近，均在7%左右；FPM和YFPF的總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)較其他3 種粗多糖高，分別為10.08%和12.20%。對5 種粗多糖中結(jié)合糖蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，JFPF、YFPF和FPM 3 種粗多糖的結(jié)合糖蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，分別為1.08%、1.26%和2.23%。另外，5 種粗多糖樣品中糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大，HFPF和YFPF的糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，分別為14.54%和15.84%，JFPF、FPM和FPFB 3 種粗多糖的糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在3%以下。這些粗多糖的基本組分對其抗氧化活性會有不同程度的影響。

表1 紅緣擬層孔菌粗多糖的基本組分Table 1 Basic components of crude polysaccharides from Fomitopsis pinicola

2.2 不同來源紅緣擬層孔菌多糖的分子質(zhì)量分布

有研究表明，多糖的分子質(zhì)量與其抗氧化活性密切相關(guān)[24]，因此測定多糖分子質(zhì)量分布對其抗氧化活性的分析是十分必要的。脫蛋白后的JFPF、HFPF、YFPF、FPM和FPFB粗多糖的凝膠色譜圖和分子質(zhì)量分布分別見圖1和表2。

圖1 脫蛋白后的5 種粗多糖的高效凝膠滲透色譜圖Fig. 1 High performence gel permeation chromatograms of five crude polysaccharides after protein removal

表2 脫蛋白后5 種粗多糖的分子質(zhì)量分布Table 2 Molecular mass distribution of five crude polysaccharides after protein removal

由圖1可知，JFPF和FPFB粗多糖在色譜圖中呈現(xiàn)2 個(gè)相近的峰，顯示JFPF和FPFB粗多糖有2 種不同組分；HFPF和YFPF粗多糖在色譜圖中呈現(xiàn)3 個(gè)主要峰，顯示HFPF和YFPF粗多糖存在3 種不同組分；FPM粗多糖在色譜圖中呈現(xiàn)5 個(gè)峰，顯示該粗多糖有5 種不同組分。

從表2可知，JFPF粗多糖中峰1、2的保留時(shí)間接近，分別為15.174 min和15.690 min，說明JFPF粗多糖組分分子質(zhì)量分布相對比較集中，其中峰1的峰面積占比為78.53%，分子質(zhì)量為5.62×104Da，峰2的峰面積占比為21.47%，分子質(zhì)量為4.06×104Da；HFPF粗多糖中峰1、2的峰面積占比分別為33.49%和55.81%，說明HFPF粗多糖主要由峰1和峰2組分組成，其中，峰1組分的分子質(zhì)量較高為2.07×106Da，峰2組分的分子質(zhì)量為8.63×104Da；YFPF粗多糖中有3 種不同組分，其中峰1、2的出峰時(shí)間早，分子質(zhì)量高，分別為2.95×106Da和1.17×106Da，對應(yīng)峰面積所占比例分別為43.72%、20.17%，表明YFPF中分子質(zhì)量高的組分含量較高；FPM粗多糖中的組分較豐富，但其保留時(shí)間相對集中，主要在8.971～13.827 min范圍內(nèi)，其中，峰1和峰2組分的分子質(zhì)量較高，分別為2.83×106、1.78×106Da，峰3、4和峰5為FPM的主要組分，分子質(zhì)量在1.31×105～4.35×105Da范圍內(nèi)；FPFB中峰1、2的保留時(shí)間接近，對應(yīng)組分的分子質(zhì)量較低，分別為3.38×104、2.75×104Da。

通過對比可以發(fā)現(xiàn)，JFPF、HFPF、YFPF、FPM和FPFB 5 種粗多糖的分子質(zhì)量構(gòu)成差異明顯，YFPF粗多糖中以2.95×106Da左右的高分子質(zhì)量多糖為其主要成分；FPM粗多糖中以1.31×105～4.35×105Da范圍的中等分子質(zhì)量多糖為其主要成分；JFPF和FPFB粗多糖分別以5.62×104Da和2.75×104～3.38×104Da的低分子質(zhì)量多糖為其主要成分；而HFPF粗多糖中高分子質(zhì)量多糖和低分子質(zhì)量多糖所占比例較均等。多糖的糖鏈與肽鏈結(jié)合，形成的糖肽或糖蛋白會增加多糖的分子質(zhì)量[25]，YFPF和FPM粗多糖中多糖較高的分子質(zhì)量，可能與其較高的糖蛋白含量有關(guān)。文獻(xiàn)[11]報(bào)道，培養(yǎng)35 d的FPM多糖主要有3 種不同分子質(zhì)量的組分，即5.37×106（19.6%）、1.06×106Da（19.3%）的高分子質(zhì)量組分和1.47×104Da（53.6%）的低分子質(zhì)量組分，此結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)有一定差異，推測可能與培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間等不同相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中紅緣擬層孔菌多糖分子質(zhì)量分布與已報(bào)道的紅緣擬層孔菌子實(shí)體與菌絲體多糖的分子質(zhì)量遠(yuǎn)高于其發(fā)酵液多糖分子質(zhì)量[9,11]基本吻合。

2.3 不同來源紅緣擬層孔菌粗多糖的抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基的醇溶液呈紫色，具有自由基清除能力的樣品，可與之結(jié)合使溶液顏色變淺，吸光度減小，因此可根據(jù)吸光度變化快速判斷樣品的DPPH自由基清除能力[26]。

圖2 JFPF、HFPF、YFPF、FPM和FPFB粗多糖對DPPH自由基的清除作用Fig. 2 DPPH radical scavenging activity of crude polysaccharides from JFPF, HFPF, YFPF, FPM and FPFB

由圖2可知，5 種粗多糖對DPPH自由基均具有一定的清除作用，且存在一定的劑量依賴關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，YFPF、JFPF、HFPF、FPM和FPFB粗多糖對DPPH自由基的清除率分別為47.01%、34.73%、27.94%、24.44%、18.75%；當(dāng)質(zhì)量濃度增加到5 mg/mL時(shí)，上述5 種多糖對DPPH自由基清除率分別為78.78%、75.92%、60.47%、41.41%、31.32%。在0～5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，5 種紅緣擬層孔菌粗多糖和VC對DPPH自由基的清除能力由大到小依次為VC＞YFPF＞JFPF＞HFPF＞FPM＞FPFB。上述結(jié)果表明，5 種粗多糖可能作為電子或氫供體清除DPPH自由基。子實(shí)體粗多糖（JFPF、HFPF和YFPF）對DPPH自由基的清除作用均高于菌絲體和發(fā)酵液所得粗多糖（FPM和FPFB）。在5 種粗多糖中，以子實(shí)體中的YFPF粗多糖對DPPH自由基清除作用最強(qiáng)，且YFPF粗多糖的雜質(zhì)蛋白和糖醛酸含量最高。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和糖醛酸含量增加時(shí)，多糖具有較高的自由基清除活性，這與已有研究結(jié)果吻合，認(rèn)為多糖分子中蛋白質(zhì)和糖醛酸物質(zhì)的存在增強(qiáng)了其自由基清除活性[27]。此外，多糖的分子質(zhì)量在抗氧化活性中起著重要的作用，分子質(zhì)量較低的多糖在提取過程中其主要分子結(jié)構(gòu)可能被破壞，如糖基類型、取代基和糖苷鍵的構(gòu)型等[9]，因此分子質(zhì)量高的YFPF粗多糖比其他4 種粗多糖具有更高的抗氧化活性。

2.3.2 ABTS陽離子自由基清除能力

ABTS經(jīng)氧化后會形成在734 nm波長處有最大吸收的藍(lán)綠色水溶性ABTS陽離子自由基，抗氧化劑可與其反應(yīng)使之褪色，且抗氧化能力與反應(yīng)速率呈正相關(guān)，可根據(jù)褪色情況直接判斷樣品抗氧化能力[19]。

由圖3可知，JFPF、HFPF、YFPF、FPM和FPFB粗多糖對ABTS陽離子自由基都有較強(qiáng)的清除作用，清除率隨多糖質(zhì)量濃度的上升而增大。在質(zhì)量濃度大于1 mg/mL時(shí)，JFPF、HFPF、YFPF和FPM 4 種粗多糖對ABTS陽離子自由基的清除效果接近陽性對照VC，且均明顯高于FPFB。當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，JFPF、HFPF、YFPF和FPM粗多糖對ABTS陽離子自由基的清除率均大于98%；而FPFB粗多糖對ABTS陽離子自由基的清除率只有72%。這可能是由于其多糖、雜質(zhì)蛋白、糖蛋白和糖醛酸含量相對較少。FPFB屬于胞外多糖，其組成、結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)（包括主要多糖組分的分子質(zhì)量）與其他多糖差異也較大，因此，影響其對ABTS陽離子自由基的清除能力。

圖3 JFPF、HFPF、YFPF、FPM和FPFB粗多糖對ABTS陽離子自由基的清除作用Fig. 3 ABTS radical scavenging activity of crude polysaccharides from JFPF, HFPF, YFPF, FPM and FPFB

2.3.3 羥自由基清除能力

羥自由基是目前已知的機(jī)體新陳代謝過程中產(chǎn)生的對機(jī)體毒性最強(qiáng)、危害最大的一種活性氧自由基，是機(jī)體氧化損傷的主要因素?？寡趸瘎┠苡行宄驕p少羥自由基的產(chǎn)生，從而抑制氧化發(fā)生，羥自由基清除率是反映物質(zhì)抗氧化作用的重要指標(biāo)[13,28]。

圖4 JFPF、HFPF、YFPF、FPM及FPFB粗多糖對羥自由基的清除作用Fig. 4 Hydroxyl radical scavenging activity of crude polysaccharides from JFPF, HFPF, YFPF, FPM and FPFB

由圖4可知，5 種粗多糖對羥自由基均具有較好的清除作用，當(dāng)質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，JFPF、FPFB、FPM、YFPF和HFPF粗多糖對羥自由基的清除率依次為47.91%、36.03%、30.84%、23.35%、20.51%；當(dāng)質(zhì)量濃度增大至5 mg/mL時(shí)，JFPF、HFPF、YFPF、FPM和FPFB對羥基自由基的清除率分別為89.71%、52.68%、64.38%、71.05%、73.44%。在0～5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)各樣品對羥自由基的清除能力呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。5 種紅緣擬層孔菌粗多糖對羥自由基清除作用最強(qiáng)的是JFPF，然后依次為FPFB＞FPM＞YFPF＞HFPF。這可能與多糖、雜質(zhì)蛋白、糖蛋白和糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)有關(guān)。FPFB屬于胞外多糖，它對羥自由基也具有較強(qiáng)的清除作用。研究表明，多糖可以作為電子或氫供體來清除羥自由基，清除羥自由基生成是一種抗氧化機(jī)制[29]。另外，JFPF和FPFB較高的羥自由基清除活性可能與它們相對較低的分子質(zhì)量有關(guān)，低分子質(zhì)量多糖活性位點(diǎn)容易暴露，利于和自由基接觸并清除。

2.3.4 還原能力

還原能力是衡量物質(zhì)潛在抗氧化能力的重要指標(biāo)，具有還原性的物質(zhì)可以通過自身的還原作用提供電子清除自由基，從而達(dá)到抗氧化的目的。當(dāng)還原性物質(zhì)存在時(shí)，鐵氰化鉀可被還原為亞鐵氰化鉀，與三氯化鐵在酸性條件下反應(yīng)并生成700 nm波長處有特征吸收峰的普魯士藍(lán)[30]。

圖5 JFPF、HFPF、YFPF、FPM和FPFB粗多糖的還原能力Fig. 5 Reducing power of crude polysaccharides from JFPF, HFPF,YFPF, FPM and FPFB

由圖5可知，5 種粗多糖（JFPF、HFPF、YFPF、FPM和FPFB）均具有一定的還原能力，且在0～5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)還原能力呈一定的劑量依賴關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，YFPF粗多糖的還原能力為0.84，其余4 種粗多糖（HFPF、JFPF、FPM、FPFB）的還原能力分別為0.34、0.32、0.25、0.10。5 種粗多糖還原能力從大到小依次為：YFPF＞HFPF＞JFPF＞FPM＞FPFB。子實(shí)體YFPF粗多糖的還原能力最高，這可能與其多糖、雜質(zhì)蛋白、糖蛋白和糖醛酸含量相對較高有關(guān)。FPFB屬于胞外多糖，其單糖組成、結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)（包括主要多糖組分的分子質(zhì)量）與其他多糖差異也較大，其還原能力最差。多糖的分子質(zhì)量也是影響其抗氧化活性的主要因素之一，分子質(zhì)量較低的多糖在提取過程中其主要分子結(jié)構(gòu)可能被破壞，YFPF中分子質(zhì)量高的組分含量較高，因此，較其他粗多糖具有更高的抗氧化活性。研究表明，還原能力通常與還原酶的存在有關(guān)，還原酶通過提供氫原子破壞自由基鏈，從而發(fā)揮抗氧化作用，此外，還原劑還可通過與H2O2的某些前體發(fā)生反應(yīng)防止H2O2形成，從而發(fā)揮抗氧化作用[29]。

2.3.5 氧化損傷酵母細(xì)胞保護(hù)能力

酵母細(xì)胞是與人體細(xì)胞接近的真核細(xì)胞，其與人體細(xì)胞的抗氧化機(jī)制相似，且生命周期短，是抗氧化活性研究的模式生物[9]。為深入考察紅緣擬層孔菌粗多糖的抗氧化活性，實(shí)驗(yàn)采用氧化損傷（紫外線和H2O2）酵母細(xì)胞保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，? 種粗多糖對氧化損傷酵母細(xì)胞的保護(hù)作用進(jìn)行評價(jià)。

2.3.5.1 紫外損傷酵母細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

紫外線輻射是造成皮膚氧化損傷的主要原因，紫外線輻射產(chǎn)生的活性氧自由基會引發(fā)細(xì)胞損傷和凋亡，進(jìn)而引起動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥等相關(guān)疾病[31-32]。抗氧化劑具有清除自由基的作用，可有效減緩紫外輻射對細(xì)胞造成的損傷[33]。

圖6 JFPF、HFPF、YFPF、FPM和FPFB粗多糖對紫外損傷酵母細(xì)胞保護(hù)能力Fig. 6 Protective effects of crude polysaccharides from JFPF, HFPF,YFPF, FPM and FPFB against UV-induced oxidative damage in yeast cells

5 種不同來源紅緣擬層孔菌粗多糖對紫外損傷酵母細(xì)胞的保護(hù)作用結(jié)果如圖6所示。當(dāng)質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，JFPF、HFPF、YFPF、FPM、FPFB對應(yīng)的酵母細(xì)胞存活率均較低，分別為1.53%、2.72%、29.43%、34.84%、21.43%，表明5 種粗多糖在較低質(zhì)量濃度時(shí)對紫外損傷酵母細(xì)胞的保護(hù)作用較弱；質(zhì)量濃度增大至20 mg/mL時(shí)，上述5 種粗多糖對應(yīng)的酵母細(xì)胞存活率分別為33.14%、27.57%、64.64%、75.48%、67.71%。因此，5 種粗多糖在較高質(zhì)量濃度時(shí)對紫外損傷酵母具有較好的保護(hù)作用，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。源于菌絲體和發(fā)酵液的粗多糖對紫外損傷酵母細(xì)胞的保護(hù)作用優(yōu)于子實(shí)體粗多糖，YFPF粗多糖對紫外損傷酵母細(xì)胞也具有較強(qiáng)保護(hù)作用。多糖的抗氧化活性與其雜蛋白和結(jié)合糖蛋白含量密切相關(guān)，研究顯示，未脫蛋白多糖的抗氧化活性優(yōu)于脫蛋白多糖的抗氧化活性[34]，Sevag法脫蛋白多糖的抗氧化活性強(qiáng)于蛋白酶法脫蛋白多糖[35]，故推測FPM和YFPF較強(qiáng)的紫外損傷酵母細(xì)胞保護(hù)作用可能與其蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)尤其是結(jié)合糖蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高有關(guān)。

2.3.5.2 H2O2氧化損傷酵母細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)

H2O2是一種常用的細(xì)胞氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑，廣泛用于誘導(dǎo)細(xì)胞建立氧化應(yīng)激損傷模型。H2O2能在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性高、破壞力強(qiáng)的羥自由基，從而對機(jī)體造成傷害?？寡趸瘎┛赏ㄟ^直接與H2O2、H2O2中間產(chǎn)物反應(yīng)或抑制過氧化物酶與H2O2結(jié)合等來降低H2O2對細(xì)胞的損傷[36]。

圖7 JFPF、HFPF、YFPF、FPM和FPFB粗多糖對H2O2損傷酵母細(xì)胞保護(hù)能力Fig. 7 Protective effects of crude polysaccharides from JFPF, HFPF,YFPF, FPM and FPFB against H2O2-induced oxidative damage in yeast cells

5 種不同來源的紅緣擬層孔菌粗多糖對H2O2氧化損傷酵母細(xì)胞的保護(hù)作用結(jié)果見圖7。當(dāng)質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí)，F(xiàn)PM、YFPF、FPFB、JFPF和HFPF 5 種粗多糖對酵母細(xì)胞的存活率分別為48.38%、43.12%、41.74%、20.35%和18.63%。這些多糖對H2O2氧化損傷酵母細(xì)胞具有不同程度的保護(hù)作用。此結(jié)果表明，F(xiàn)PM粗多糖對H2O2氧化損傷酵母細(xì)胞保護(hù)作用最強(qiáng)，YFPF、FPFB粗多糖次之，這與紫外損傷酵母細(xì)胞保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。FPM粗多糖對紫外和H2O2氧化損傷酵母細(xì)胞的保護(hù)作用均強(qiáng)于其他4 種，推測可能與色素、雜質(zhì)蛋白、糖蛋白和糖醛酸等物質(zhì)的存在及其之間的協(xié)同作用有關(guān)，這些物質(zhì)也參與了抗氧化作用。多糖抗氧化的構(gòu)效關(guān)系受多種因素影響，包括蛋白質(zhì)含量、糖醛酸含量、硫酸基含量、分子質(zhì)量、單糖組成、活性羥基數(shù)量以及分子構(gòu)象等，紅緣擬層孔菌多糖的結(jié)構(gòu)特征有待于進(jìn)一步系統(tǒng)解析。H2O2在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的羥自由基破壞力很強(qiáng)，故其存活率總體上均低于紫外處理組，這與已有研究結(jié)果[37]吻合。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)分別采用4 種體外抗氧化活性評價(jià)方法以及紫外和H2O2氧化損傷酵母細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，對JFPF、HFPF、YFPF、FPM及FPFB粗多糖的抗氧化活性進(jìn)行對比研究。結(jié)果表明，5 種不同來源紅緣擬層孔菌粗多糖對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、羥自由基均有較好的清除能力，且對氧化損傷酵母細(xì)胞均表現(xiàn)出較好的保護(hù)作用，表明5 種紅緣擬層孔菌粗多糖具有較好的抗氧化活性，提示這5 種粗多糖作為抗氧化功能因子在保健功能食品中具有良好的應(yīng)用前景。本研究還發(fā)現(xiàn)5 種紅緣擬層孔菌粗多糖雖然都具有較好的抗氧化活性，但作用效果差異明顯，其中，YFPF粗多糖對DPPH和ABTS陽離子自由基的清除作用及還原能力強(qiáng)于其他4 種粗多糖；FPM粗多糖對紫外和H2O2誘發(fā)的氧化損傷酵母細(xì)胞的保護(hù)作用均最強(qiáng)，原因可能與YFPF和FPM粗多糖的分子質(zhì)量較高及糖蛋白含量較高相關(guān)。多糖的結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ)，因此進(jìn)一步分離純化、結(jié)構(gòu)表征以及構(gòu)效關(guān)系等方面的研究工作有待進(jìn)行。不同來源紅緣擬層孔菌多糖的抗氧化活性存在一定差異，液體深層發(fā)酵是制備紅緣擬層孔菌活性多糖的一種有效方法，這為紅緣擬層孔菌多糖在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域開發(fā)應(yīng)用提供了參考依據(jù)。