超高壓激活鮮榨梨汁多酚氧化酶的酶學特性

尚海濤，宣曉婷，崔 燕，林旭東，俞靜芬，凌建剛*

（寧波市農業科學研究院農產品加工研究所，寧波市農產品保鮮工程重點實驗室，浙江 寧波 315040）

翠冠梨（Pyrus pyrifolia Nakai cv. Cuiguan）屬砂梨系統，果個大、果心小、果肉乳白色、肉質松脆細膩、石細胞少、汁多味甜，是我國南方地區的主栽早熟品種。翠冠梨以早熟、產量高、品質優而廣受生產者和消費者喜愛，又稱“六月雪”，是盛夏解渴消暑的時令佳品。但翠冠梨果實常溫下不耐貯藏，極易因發生病害而腐爛[1]。發展加工業可以延長產業鏈、效益鏈，實現農民多層次多渠道增收。

翠冠梨出汁率高、褐變程度輕、果汁鮮亮，具有良好的感官品質，是鮮榨梨汁的理想材料。傳統加工以熱加工為主，用以殺滅腐敗微生物和鈍化酶活力，但熱加工會產生不良風味和營養損失[2]。梨汁對熱極為敏感，易產生后熟味[3]。超高壓（high pressure processing，HPP）非熱加工技術是指在室溫或溫和加熱條件下利用100～1 000 MPa壓力處理食品，以達到殺菌、鈍化酶活力和加工食品的目的[4]，而對于口感、風味和營養的影響很小[5]，有助于開發高品質產品，也因此受到極大地關注。有研究表明超高壓處理果汁具有良好的殺菌效果[6]，但也有研究表明超高壓處理很難完全鈍化酶活力，甚至表現出激活效應[7]，加速果汁褐變，限制了超高壓技術的應用。

本實驗通過檢測處理前后鮮榨梨汁中溶解氧質量濃度、總酚濃度以及多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）最適pH值、最適反應溫度、熱穩定性、米氏常數（Km），研究超高壓處理對鮮榨梨汁貨架期色澤的影響。超高壓加速褐變機制的研究在應用科學上為控制酶促褐變提供參考依據，在理論科學上有助于探討物理因素引起的酶促褐變機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

翠冠梨于2018年7月20日購于寧波市鄞州綠洲果業專業合作社。

鄰苯二酚 上海展云化工有限公司；曲拉通X-100（Triton X-100） 國藥集團化學試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 上海麥克林生化科技有限公司；二甲基二碳酸鹽（dimethyl dicarbonate，DMDC） 美國Sigma公司；平板計數瓊脂（plate count agar，PCA） 杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

CC-600（R）plus原汁機 圖們惠人電子有限公司；CQC2L-600全液相超高壓設備 北京速原中天科技股份公司；CR-5色差計 日本柯尼卡美能達株式會社；UV1600紫外-可見分光光度計 上海赫爾普國際貿易有限公司；H1850R臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；FG4溶解氧測定儀 瑞士梅特勒-托利多公司；PB-10數顯pH計 德國賽多利斯公司；SDC-6低溫恒溫槽 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鮮榨梨汁加工

翠冠梨去皮、去核、去柄后，采用原汁機榨汁，果汁經200 目尼龍紗布過濾后灌裝，隨機分為兩組。一組采用超高壓處理（HPP組）；另一組未處理作為對照（CK組）。

1.3.2 超高壓處理

預實驗中采用0、100、200、300、400、500、600 MPa超高壓處理鮮榨梨汁5 min，結果表明壓力越高，殺菌效果越明顯，400～600 MPa處理梨汁菌落總數不超過100 CFU/mL，符合GB 7101—2015《食品安全國家標準 飲料》要求。貨架期觀察表明，300～600 MPa處理會加速梨汁褐變，壓力越高，褐變越早、越明顯。依據預實驗結果，選取500 MPa、5 min作為超高壓處理條件。

1.3.3 待測樣品預處理

用于色澤測定的對照組再隨機分為3 組：其中一組添加Triton X-100（最終體積分數1%）（Triton X-100組）；一組添加SDS（最終質量濃度2 g/L）（SDS組）；一組不做處理為對照組（CK組）。這3 組樣品均添加200 mg/L DMDC以防止發酵對色澤的影響；雖然超高壓處理可以控制樣品發酵，但為了保持樣品一致性，也添加相同質量濃度的DMDC。超高壓處理后0 h立即測定樣品pH值、總酚濃度、溶解氧質量濃度和菌落總數。4 組樣品于25 ℃放置，每6 h取樣測定色澤一次。用于酶學特性指標檢測的樣品分裝于10 mL離心管中，-80 ℃超低溫冰箱中凍藏，測定前先冷水浴融解。

1.3.4 指標測定

1.3.4.1 色澤的測定

色澤參照Gao Ge等的方法[8]，取15 mL樣品于樣品皿內，采用色差計測定。測定模式為反射測量，測定口徑為30 mm，測定亮度（L*）、紅度（a*）、黃度（b*）值。按公式（1）計算色差值（ΔE）。

式中：L0*、a0*、b0*為初始值；Lt*、at*、bt*為貨架期t時的測定值。

1.3.4.2 菌落總數的測定

菌落總數參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》的方法，培養溫度（36±1）℃，培養時間48 h。

1.3.4.3 總酚濃度的測定

總酚濃度采用福林-酚法[9]測定。取1 mL梨汁，加入4 mL蒸餾水，振蕩混勻。12 000×g、4 ℃離心15 min，取1 mL上清液，加1 mL福林-酚試劑、3 mL質量分數20%無水碳酸鈉。50 ℃保溫30 min，測定765 nm波長處吸光度。以鄰苯二酚為底物繪制標準曲線。

1.3.4.4 溶解氧質量濃度和pH值的測定

溶解氧質量濃度采用溶解氧儀測定。pH值采用pH計測定。

1.3.4.5 PPO最適反應pH值測定

參照Liu Fang等[10]的方法，配制0.05 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH 3.5、pH 4.0、pH 4.5、pH 5.0、pH 5.5）、0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5）、0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0、pH 8.5）。取3.5 mL梨汁，加3.5 mL緩沖液，振蕩混勻，12 000×g、4 ℃離心15 min，上清液即為所提取的酶液。采用相應pH值的緩沖液配制50 mmol/L鄰苯二酚溶液。3 mL反應體系中含1.9 mL緩沖液、1 mL 50 mmol/L鄰苯二酚溶液和0.1 mL酶液。測定4 min內A420nm變化，以每分鐘吸光度上升0.1作為一個酶活力單位（U）。PPO活力按公式（2）計算。

式中：A0為初始吸光度；A1為放置4 min后吸光度。

1.3.4.6 PPO最適反應溫度的測定

采用PPO最適反應pH值的緩沖液提取酶液。離心管中加入1.9 mL緩沖液、1 mL 50 mmol/L鄰苯二酚溶液，測定前先分別于5、15、25、35、45、55、65、75、85、95 ℃恒溫槽中放置10 min，然后加入0.1 mL酶液，立即計時再放置4 min，然后測定A420nm。以沸水浴5 min鈍化酶活力的酶液作為空白。PPO活力按公式（2）計算。

1.3.4.7 PPO熱穩定性的測定

采用PPO最適反應pH值的緩沖液提取酶液。然后將酶液置于45、55、65、75、85、95 ℃恒溫槽中，分別水浴10、20、30、40、50、60 min。水浴后用冰水降溫，PPO活力按公式（2）計算。

1.3.4.8 PPO Km的測定

采用PPO最適反應pH值的緩沖液提取酶液。分別配制濃度為1.8、1.5、1.2、0.9、0.6、0.3、0.15、0.075、0.037 5、0.018 75、0.009 375、0.004 687 5、0.002 343 75 mol/L的鄰苯二酚溶液，測定不同底物濃度下的PPO活力。3 mL反應體系中含1 mL鄰苯二酚溶液，因而底物濃度[S]為鄰苯二酚溶液濃度的1/3。根據不同的底物濃度[S]對應的反應速率V，求出兩者的倒數，參照Lineweaver-Burk作圖法，以1/V為縱坐標，1/[S]為橫坐標作圖。擬合線性方程：y＝ax+b，得出最大反應速率（Vmax）＝1/b，米氏常數Km＝a×Vmax＝a/b。

1.4 數據統計與分析

各指標平行測定3 次，結果以平均值±標準差表示。數據統計分析采用SPSS 18.0軟件，差異顯著性檢驗采用鄧肯氏多重比較法，差異顯著性水平為0.05。采用Origin軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 超高壓處理對鮮榨梨汁貨架期色澤的影響

如圖1所示，對照組梨汁褐變緩慢，貨架期24 h時果汁色澤變化仍不明顯，ΔE僅為0.56，小于人肉眼可識別的ΔE（1.5）。超高壓處理前后（鮮榨和0 h時）梨汁色澤的差異不明顯，但超高壓處理加速了貨架期褐變，表現為L*值快速下降，ΔE快速上升。貨架期6 h時超高壓處理組ΔE已達1.61，人肉眼可見明顯的褐變；12 h后色澤的變化趨于緩慢，但仍逐漸上升。Triton X-100因可將膜蛋白從細胞膜上解離下來，是目前常用的檢測結合態PPO的方法[10]。從圖1可知，Triton X-100處理后色澤的變化僅略高于對照組，遠小于超高壓處理組，可推測超高壓處理加速梨汁褐變與膜結合態的PPO關系不大。SDS是PPO激活劑之一[11]。從圖1可知，超高壓處理組色澤變化趨勢與SDS組相似，可推測超高壓處理激活了PPO，從而加速了褐變。同時，潛在酶活性是一種不同于膜結合態酶活性的新形式，游離態PPO和膜結合態PPO都可能存在潛在酶活性。

圖1 超高壓處理前后鮮榨梨汁貨架期色澤L*值（A）和ΔE（B）的變化Fig. 1 Changes in L* (A) and ΔE (B) of HPP treated and untreated pear juice during shelf life

2.2 超高壓處理對菌落總數、溶解氧質量濃度、總酚濃度和pH值的影響

表1 超高壓處理對鮮榨梨汁菌落總數、溶解氧質量濃度、總酚濃度和pH值的影響Table 1 Effect of HPP treatment on total bacterial count, dissolved oxygen conconcentration, total phenol content and pH of fresh pear juice

如表1所示，超高壓處理可以顯著降低菌落總數，使菌落總數由2 867 CFU/mL降至28 CFU/mL，殺菌效果顯著，達到99.0%。梨汁褐變主要是由PPO引起的酶促褐變。PPO是一類含銅的氧化還原酶，在氧氣存在下催化酚類物質形成醌類物質，繼而聚合形成褐色物質[12]。發生酶促褐變的三要素為：酚類底物、PPO和氧氣。如表1所示，超高壓處理后的溶解氧質量濃度與對照組差異不顯著（P＞0.05），總酚濃度顯著小于對照組（P＜0.05）。由此可知，超高壓加速梨汁褐變與溶解氧和酚類底物無關。因此，加速褐變的原因只能與PPO有關。而超高壓處理對梨汁pH值無顯著影響，可排除pH值對PPO活力的影響。

2.3 PPO最適反應pH值分析

如圖2所示，超高壓處理后PPO最適反應pH值有兩個，分別為pH 5.0和pH 7.0，分別記為PPO1和PPO2，但處理前最適pH值只有一個，為pH 5.0，pH 7.0處的峰不明顯。超高壓處理前PPO1活力為6.5 U/mL，處理后為14.1 U/mL，上升了1.17 倍。超高壓處理前PPO2活力為2.6 U/mL，處理后為25.5 U/mL，上升了8.8 倍。由此可見，超高壓處理使低活力甚至無活力的PPO表現出高催化活性，即產生了激活效應。

圖2 pH值對超高壓處理前后鮮榨梨汁PPO活力的影響Fig. 2 Effect of pH on PPO activity of HPP treated and untreated pear juice

2.4 PPO最適反應溫度分析

圖3 溫度對超高壓處理前后鮮榨梨汁PPO1（A）和PPO2（B）活力的影響Fig. 3 Effect of temperature on PPO1 (A) and PPO2 (B) activity of HPP treated and untreated pear juice

如圖3A所示，超高壓處理前后PPO1活力都表現為隨溫度升高先上升后下降的變化趨勢，超高壓處理前PPO1最適溫度35 ℃，處理后最適溫度為25 ℃。如圖3B所示，超高壓處理前后PPO2活力均表現為隨溫度升高而下降的趨勢，其在5～25 ℃緩慢下降，25 ℃以后快速下降。最適反應溫度為5 ℃，意味著超高壓處理后的梨汁即使冷藏也極易發生褐變。

2.5 PPO熱穩定性分析

如圖4A所示，對照組45、55 ℃加熱時PPO1活力變化不大，65 ℃加熱時其活力緩慢上升，75、85 ℃加熱時其活力先上升后下降，95 ℃加熱時其活力快速下降。其中，75 ℃加熱30 min時PPO1活力最高，為14.25 U/mL，與超高壓處理后的PPO1活力相近（圖2）。由此可見，65、75、85 ℃加熱處理也具有PPO激活效應。但隨著溫度提高或者加熱時間延長，PPO1活力開始下降，表現為鈍化酶活力效應。因此可知，加熱對鮮榨梨汁PPO1先激活后鈍化，而對于已被超高壓激活的PPO1，加熱只表現出鈍化酶活力效應（圖4C）。Yemenicioglu等[13]在蘋果中也發現了這一現象，他們采用3 個溫度（68、73、78 ℃）加熱處理PPO，發現其活力先上升后下降，認為蘋果PPO存在潛在酶活力。Terefe等[14]研究表明，60～76 ℃熱處理會導致藍莓PPO活力上升。超高壓處理前后45～95 ℃加熱對PPO2只表現出鈍化酶活力效應（圖4B、D）；更低的溫度（5～35 ℃）處理只是使其活力下降更慢或者不變，未見PPO2活力上升現象（數據未列出）。但不排除一定溫度下長時間處理激活PPO2的可能。

圖4 超高壓處理前后鮮榨梨汁PPO1和PPO2的熱穩定性Fig. 4 Thermal stability of PPO1 and PPO2 in HPP treated and untreated pear juice

2.6 PPO Km分析

圖5 超高壓處理對PPO酶促反應米氏方程曲線的影響Fig. 5 Effect of HPP treatment on Michaelis-Menten equation curve for PPO in fresh pear juice

如圖5所示，PPO1和PPO2超高壓處理前后的米氏方程曲線比較相似。隨底物濃度的增加，超高壓處理后的PPO酶促反應米氏方程曲線上升比超高壓處理前更快。而且超高壓處理后的米氏方程曲線更早出現平臺效應。

表2 超高壓處理對PPO酶促反應動力學參數的影響Table 2 Effect of HPP treatment on kinetic parameters of PPO in fresh pear juice

如圖5和表2所示，計算得出超高壓處理前PPO1的Vmax和Km分別為3.058 U和0.425 mol/L，PPO2的Vmax和Km分別為2.874 U和0.351 mol/L；超高壓處理后PPO1的Vmax和Km分別為1.938 U和0.021 mol/L，PPO2的Vmax和Km分別為2.273 U和0.016 mol/L。PPO1 Vmax由3.058 U下降至1.938 U，下降了36.7%；PPO2 Vmax由2.874 U下降至2.273 U，下降了20.9%。

超高壓處理后Vmax和Km都下降。由米氏方程V＝Vmax[S]/（Km+[S]）可知，Vmax下降導致V下降，Km下降導致V上升。PPO激活效應主要是由于Km的下降，即酶和底物之間親和力1/Km的上升。PPO1與底物的親和力從2.353 L/mol上升至46.909 L/mol，上升了18.9 倍；PPO2與底物的親和力從2.852 L/mol上升至62.857 L/mol，上升了21.0 倍。由表1可知，鮮榨梨汁中總酚濃度約為0.90 mmol/L，代入米氏方程可知，超高壓處理前后PPO1酶促反應速率分別為0.006 46 U和0.078 50 U，PPO2酶促反應速率分別為0.007 36 U和0.121 69 U，分別上升了12.2 倍和16.5 倍。超高壓處理后Vmax對酶促反應速率的影響超過Km的影響，將會導致V下降，即產生鈍化效應。

3 討 論

3.1 超高壓處理的激活效應

超高壓處理（500 MPa、5 min）激活潛在PPO活力，加速鮮榨梨汁褐變。這一激活效應早有報道。曾慶梅等[7]研究表明，處理溫度50 ℃、保壓時間10 min、pH值為5的條件下，200～300 MPa處理梨汁時PPO被激活且活力最高，相對活力分別為115.3%和111.4%。蘇光明等[15]研究表明，較低壓力（100～300 MPa）的超高壓處理對醬曲PPO有激活作用，200 MPa處理10 min能最大限度地激活醬曲PPO，此時其相對活力為135%。趙光遠等[16]研究表明，400 MPa處理對PPO有激活作用，VC在500 MPa以下對梨汁中的PPO有激活作用，400 MPa不加VC和加VC后PPO相對活力分別為105.6%和119.7%。劉軍偉等[17]研究表明，在溫度30 ℃、保壓時間10 min的條件下，壓力在100～600 MPa范圍內，500 MPa時紫薯PPO的活力最高，與未經超高壓處理PPO活力之比為1.066。本研究結果表明，超高壓處理后PPO1活力上升了1.17 倍，PPO2活力上升了8.8 倍，遠超過以上報道，與Asaka等[18]的研究結果較一致，他們研究發現600 MPa、10 min超高壓處理拉法蘭西梨前后PPO活力分別為1.62、22.40 U/g，活力上升了12.8 倍。Terefe等[14]研究也發現500 MPa、30 ℃超高壓處理藍莓可激活PPO，其活力最大可上升6.1 倍。

3.2 超高壓處理的鈍化效應

超高壓處理還具有鈍化PPO的效應。如曾慶梅等[7]研究表明，處理溫度50 ℃、保壓時間為10 min，500 MPa處理時PPO的活力下降到75.3%。趙光遠等[16]研究表明，500 MPa、60 ℃或750 MPa、50 ℃以上的處理條件可使鮮榨梨汁中的PPO失去60%以上的活力。劉軍偉等[17]研究表明，600 MPa、65 ℃條件下處理35 min后，PPO活力最弱，抑制效果最佳。袁根良等[19]研究表明，壓力480 MPa、溫度55 ℃、保壓時間10 min，在此條件下，香蕉果肉PPO活力殘存率為0.90%。由于超高壓處理技術自身存在的一些缺陷，實踐中單一使用超高壓難以使酶完全鈍化，還需要采用更高的壓力[20]、循環增壓[21]、協同中溫或者防褐變劑等技術。

3.3 PPO激活機制

PPO激活效應的內在原因是PPO存在潛在酶活性。潛在酶活性具有兩個重要的特征：1）以潛在形式存在，本身活性較弱甚至無活性；2）一定條件下可被激活，激活后表現出高催化活性?，F有的研究表明，很多果蔬中存在著潛在酶活性，如杏[22]、枇杷[23]、桃[24]、甜菜根[25]、蘑菇[26]等。本研究發現超高壓處理后梨汁PPO最適反應pH值有兩個，分別為pH 5.0和pH 7.0，即以PPO1和PPO2兩種方式存在潛在酶活力。超高壓通過影響蛋白質的分子體積、非共價鍵等，引起蛋白質分子結構的變化，進而改變其活力[27]。劉平等[28]研究認為高壓處理改變疏水氨基酸的空間位置與酶活力中心的構象有關，高壓處理后疏水氨基酸的暴露程度越小，酶活力越高。本實驗證實超高壓處理更有利于PPO分子與酚類底物接觸，使PPO與底物之間的親和力更高，從而提高了酶促反應速率。超高壓是激活PPO潛在酶活性的外在原因之一，除本實驗證實的潛在酶活性可被SDS處理、熱處理激活外，其還可被Cu2+、脲、胍鹽和限制性蛋白酶解[18]等方式激活。

除了PPO，還有過氧化物酶、果膠甲酯酶、脂肪酶、β-葡萄糖苷酶等25 種酶可被超高壓激活[29]。這些與果蔬生理代謝密切相關的酶都可能存著潛在酶活形式。不同于化學和生物因素，壓力和溫度屬于純物理變量，意味著環境因素可直接作用于果蔬體內的酶，進而改變果蔬生理代謝途徑。因此，進一步研究潛在酶活性及其作用具有重要的理論價值和應用意義。

綜上，超高壓處理鮮榨梨汁存在激活和鈍化兩種效應。激活效應的內在原因是PPO存在潛在酶活性形式，其本身活性較弱甚至無活性，超高壓處理是激活PPO潛在酶活性的外在原因之一，SDS處理、熱處理等也可激活PPO潛在酶活性。超高壓處理降低PPO的Km，提高其與底物之間的親和力，從而提高酶促反應速率，加速鮮榨梨汁褐變。超高壓處理同時會降低Vmax，Vmax對酶促反應速率的影響如超過Km的影響，將會表現出鈍化效應。