巴馬特色飲食模式對D-半乳糖致衰老小鼠運動能力和抗焦慮水平的影響

蘭海靜，楊伯寧，黃聯莉，孫 薈，宋 奇，黃燕婷，何潛祖，李 萌，李全陽,*

（1.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530004；2.廣西醫科大學基礎醫學院，廣西 南寧 530021；3.廣西普生三鳳乳業有限公司，廣西 南寧 530226；4.廣西大學醫院，廣西 南寧 530004）

《“健康中國2030”規劃綱要》[1]把人們對健康食品的重視程度提升到一個新高度，為此我們試圖采用“問計于百歲老人求健康飲食”的策略，探索新型的健康飲食模式。日常飲食習慣在健康衰老中被認為是最重要的影響因素[2-3]，對大腦認知功能也有很大的影響[4-5]。地中海飲食被認為是一種被廣泛認可的健康飲食模式，對多種疾病具有預防、治療作用[6]，如心血管疾病和其他與年齡相關的疾病[2,7]；也可降低總死亡率及癌癥風險[8]，并改善認知功能[4,9]。其飲食營養成分特點是高纖維素、高蛋白質、低脂肪和低熱量[8]。除此之外，沖繩的長壽優勢被認為與健康的生活方式有關，沖繩傳統飲食中主食為紅薯，這可能有助于減少與年齡相關的慢性疾病，如癌癥和心血管疾病[2,10]。

本團隊的前期研究已對巴馬長壽地區老人的營養素攝入量和飲食結構進行了調查分析，“世界長壽之鄉”巴馬長壽人群日常膳食中碳水化合物比例、維生素攝入量偏高，且具有低能量、低脂肪、低蛋白、低膽固醇的特征，有利于人類健康長壽[11]。王芳的研究表明廣西巴馬長壽地區是以粥類、粗雜糧類等食物為主的膳食纖維多糖飲食模式[12]。宋奇等[13]研究的5 種巴馬長壽飲食模式中復合飲食對衰老小鼠的抗氧化應激效果最佳，而元素組的抗氧化應激效果并不明顯，表明巴馬長壽飲食模式具有較顯著的抗衰老作用和良好的開發潛力。單一食材不足以評估飲食對健康長壽的影響，組合型食物能夠更大限度地發揮膳食抗氧化劑的作用[14]。

在現有文獻中，多數研究都以預防與年齡有關的慢性疾病為出發點，鮮有從借鑒長壽地區飲食結構的角度切入，構建健康長壽飲食模式再進行研究驗證的報道[7]；而且因各地的食材和氣候差別很大，國外的飲食模式很難被中國普通人群所接受，從而有必要探索適合中國普通居民健康長壽的新型飲食模式。目前鮮有飲食模式對衰老小鼠的運動能力和抗焦慮水平影響效果的報道，以及改善衰老動物運動協調能力及抗焦慮能力對飲食模式效果的研究。為此，本研究總結巴馬長壽老人的飲食特點及特色益生菌，構建巴馬特色飲食模式，利用動物模型進行驗證，進一步從D-半乳糖致衰老小鼠運動能力和抗焦慮方面來探索巴馬特色飲食模式對衰老小鼠的抗衰老效果，以期為適合中國普通居民健康長壽新型飲食模式的構建提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

6 周齡SPF級昆明小鼠，雌雄各半，體質量（25±2）g，購自廣西醫科大學實驗動物中心（生產許可證號：SCXK（桂）2014-002），飼養溫度控制在（24±2）℃，相對濕度（60±10）%，12 h晝夜交替，每天給予5 g飼料[15-16]，自由飲水。

白藜蘆醇、抗壞血酸鈉、大豆異黃酮、低聚木糖、D-半乳糖 上海源葉生物技術有限公司；基礎飼料（符合GB 13078—2017《飼料衛生標準》和GB 14924.3—2010《實驗動物 配合飼料營養成分》要求） 北京科奧協力飼料有限公司；低聚果糖 量子高科（中國）生物股份有限公司；異麥芽低聚糖 山東天久生物技術有限公司；VE粉末、VA醋酸酯干粉末 新昌新和成維生素有限公司；LT-P132發酵乳桿菌、LT-L614干酪乳桿菌（均分離自廣西巴馬百歲老人糞便） 廣西大學輕工與食品工程學院實驗室；MRS培養基按GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》方法配制，固態培養基中添加質量分數1.5%瓊脂。

1.2 儀器與設備

超微粉碎機 浙江省溫嶺市創力藥材機械廠；曠場測試系統 西班牙Panlab公司；立式高壓滅菌鍋 上海三申醫療器械有限公司；電熱恒溫培養箱 上海新苗醫療器械有限公司；超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；KQ320DB型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；WGL-125B電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠飼料的制備

因巴馬特色飲食模式以膳食纖維多糖為主，具有高膳食纖維、高VA、低能量、低脂肪、低蛋白、低膽固醇攝入的特征，同時微量元素鐵、錳、鈷、硒對健康長壽現象的形成具有重要而積極的影響[11-12]。宋奇等的研究結果表明5 種巴馬長壽飲食模式中復合飲食對衰老小鼠的抗氧化應激效果最佳[13]。因此，本研究將小鼠基礎飼料打粉，以此為基礎設計巴馬特色飼料。依據宋奇等[13]的研究結果，結合GB 14924.3—2010、中國居民膳食營養素推薦攝入量、保健食品檢驗與評價技術規范（2003年版）、文獻[11]中巴馬百歲組營養素攝入量，并參考齊廣海[17]、侯放亮[18]等的方法，配制巴馬特色飼料II、III、IV，并以巴馬特色益生菌發酵乳桿菌LT-P132和干酪乳桿菌LT-L614體積比1∶1混合灌胃，加以基礎飼料喂食作為巴馬特色飲食模式I（模式I）。巴馬特色飲食模式II（模式II）飼料中VA、VE及微量元素鐵、錳、硒的添加量依據GB 14924.3—2010設計；硒、鈷添加量參考宋奇等[13]實驗中元素組、復合組設計；大豆異黃酮、VC及白藜蘆醇添加量參考文獻[19-21]設計；膳食纖維添加量參考文獻[22-24]設計。巴馬特色飲食模式III（模式III）飼料中維生素類及微量元素添加量依據中國居民膳食營養素推薦攝入量10 倍和保健食品檢驗與評價技術規范（2003年版）設計；大豆異黃酮及白藜蘆醇添加量參考文獻[19,25]設計；膳食纖維添加量參考文獻[26-28]設計。巴馬特色飲食模式IV（模式IV）飼料中膳食纖維添加量參考文獻[28-30]設計，維生素類及微量元素類添加量參考巴馬百歲老人攝入量[31]，白藜蘆醇及大豆異黃酮添加量參考文獻[19,32]設計。

1.3.2 動物分組及處理

SPF級昆明小鼠適應性喂養1 周后，每組10 只，雌雄各半，隨機分成6 組：年輕對照組、衰老模型組、巴馬特色飲食模式I、II、III、IV組。除年輕對照組注射等體積生理鹽水外，其余5 組每日上午頸背部皮下注射100 g/L D-半乳糖溶液0.2 mL/20 g mb建立衰老模型。從造模第9周開始，除年輕對照組外，其他組均繼續注射D-半乳糖溶液。巴馬特色飲食模式II、III、IV組每天給予相應巴馬特色飼料飼養，巴馬特色飲食模式I組給予基礎飼料飼養，各巴馬特色飲食組均按0.1 mL/10 g mb分別灌胃濃度為109CFU/mL的干酪乳桿菌LT-L614、發酵乳桿菌LT-P132（體積比1∶1），其余組繼續以基礎飼料飼喂，灌胃等量生理鹽水。于實驗第18周開展運動能力和抗焦慮測試，整個飼養過程中無小鼠死亡，每周稱體質量一次。

1.3.3 行為學實驗

曠場實驗參照文獻[33-36]進行。緊繩實驗參照文獻[37-39]進行。

1.4 數據統計與分析

實驗數據采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，所有結果表示為 ±s。如果數據呈正態分布，則進行組間多重比較，采用單因素方差分析和Duncan’s檢驗；如果數據呈非正態分布，則進行組間Kruskal-Wallis檢驗。顯著性水平定為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 巴馬特色飲食模式對D-半乳糖致衰老小鼠體質量的影響

圖1 巴馬特色飲食模式對D-半乳糖致衰老小鼠體質量的影響Fig. 1 Effect of Bama characteristic dietary patterns on body mass of D-galactose-induced aging mice

體質量的改變是衰老的生理指標之一[40]。本研究持續追蹤了整個實驗期間小鼠的體質量變化，由圖1可知，各組小鼠的初始體質量沒有明顯差異，與年輕對照組相比，衰老模型組小鼠體質量增加緩慢，可能是由于隨著D-半乳糖處理時間的延長，小鼠衰老程度不斷加重而造成的。在第9周，飼喂巴馬特色飼料及灌胃益生菌后，各組小鼠體質量在整個飼養過程中沒有顯著性差異（P＞0.05），整體的變化趨勢為：在第10周時各組小鼠體質量有下降趨勢；在第11周時各小組小鼠體質量開始緩慢增加，直至第16周時達最高點。Spindler等[41]的研究中未觀察到營養品組合對小鼠體質量增長具有顯著性差異。本研究中巴馬特色飲食模式也均未對D-半乳糖致衰老小鼠體質量產生影響，表明巴馬特色飲食模式對D-半乳糖致衰老小鼠的生長發育基本沒有影響。

2.2 巴馬特色飲食模式對D-半乳糖致衰老小鼠曠場實驗的影響

圖2 巴馬特色飲食模式對曠場實驗中各組小鼠后肢直立數（A）、穿越方格數（B）、總運動距離（C）及平均速率（D）的影響Fig. 2 Effect of Bama characteristic dietary patterns on the number of hind limb stand (A), the number of squares crossed (B), total movement distance (C) and average speed (D) of each group

曠場實驗是評估小鼠對新環境的自發探索行為和感覺運動能力時使用比較廣泛的一種行為學實驗[35,42]，跨越方格數和后肢直立數可以表征小鼠的活動能力[36]。D-半乳糖可以損傷小鼠自發探索能力[43-44]，且經過D-半乳糖處理的小鼠在一系列行為測試中顯示出與衰老有關的缺陷[43]。由圖2A可知，與年輕對照組相比，衰老模型組小鼠后肢直立數顯著減少至（9.40±4.43）次（P＜0.05），表明經D-半乳糖處理的小鼠運動探究能力顯著衰退。模式I、II、III、IV組小鼠的后肢直立數與年輕對照組無顯著性差異（P＞0.05）；與衰老模型組比，模式I、II、III、IV組小鼠后肢直立數分別提高至（18.20±7.38）、（21.80±8.95）、（19.70±11.28）、（18.30±8.92）次，表明巴馬特色飲食模式能緩解或修復D-半乳糖致衰老因子所造成的小鼠活動能力損傷，提高衰老小鼠的自主活動能力及適應能力，降低其焦慮水平。與模式I組相比，模式II組小鼠后肢直立數提高幅度最大，提高了19.78%，表明巴馬特色飲食模式II較模式I對改善致衰老小鼠運動探究能力的作用效果更佳。由圖2B、C可知，與年輕對照組相比，衰老模型組小鼠穿越方格數、總運動距離分別下降了14.10%和13.62%（P＞0.05），顯示D-半乳糖能使小鼠在一定程度上產生運動障礙。模式II組較衰老模型組、模式I組小鼠穿越方格數分別增加19.71%、13.89%（P＞0.05），總運動距離分別提高16.92%、9.76%（P＞0.05）。從圖2D可以看出，模式II組小鼠的平均速率大于衰老模型組及模式I組小鼠。表明巴馬特色飲食模式II相對于模式I而言對D-半乳糖致衰老小鼠運動探究能力具有更好的改善作用，增加了D-半乳糖致衰老小鼠對新環境的探索動力。

為了更具體地展現小鼠在曠場中的運動情況，采用小鼠累積活動量三維圖來表征小鼠在曠場中的運動情況（圖3）。

圖3 各組小鼠曠場實驗典型運動情況Fig. 3 Typical movement maps of mice from each group in open field test

由圖3可知，年輕對照組小鼠在曠場中活動范圍廣泛，多趨向于在曠場中心活動。衰老模型組小鼠幾乎不到曠場中心活動，活動范圍較窄，且多趨向于曠場周邊。模式I組小鼠多于曠場周邊運動，其運動量大于衰老模型組。模式II、III、IV組小鼠活動范圍較廣，運動量增加，其中模式II、III組小鼠較年輕對照組、衰老模型組和模式I組小鼠表現更佳。

曠場實驗還可以用來評估小鼠情緒反應[33]及焦慮性[34]。小鼠在曠場中央區域活動時間越短，表明其焦慮水平越高；后肢直立次數越多，表明其焦慮性越低[45]。衰老可顯著影響小鼠情緒[46]。從圖4A中可以看出，年輕對照組小鼠在曠場中總運動時間為（277.34±11.34）s。與年輕對照組相比，衰老模型組小鼠總運動時間顯著縮短至（260.21±17.65）s，表明D-半乳糖損害了衰老小鼠的運動探究能力。巴馬特色飲食模式I、II、III、IV組小鼠的總運動時間分別為（273.11±9.53）、（273.72±8.78）、（274.10±12.68）、（272.47±17.97）s，與年輕對照組相比沒有顯著性差異（P＞0.05），表明巴馬特色飲食模式均能使D-半乳糖致衰老小鼠的運動能力提高至正常水平。與衰老模型組相比，巴馬特色飲食模式I、II、III、IV組小鼠的總運動時間分別顯著延長了4.96%、5.19%、5.34%和4.71%（P＜0.05），表明巴馬特色飲食能改善由D-半乳糖所致的運動損傷。

圖4 各組小鼠總運動時間（A）及在曠場中央區域活動時間（B）Fig. 4 Effect of Bama characteristic dietary patterns on total movement time (A) and central activity time (B) of each group in open field test

由圖4B可知，年輕對照組小鼠曠場中央區域活動時間為（46.45±14.04）s。與年輕對照組小鼠相比，衰老模型組小鼠曠場中央區域活動時間顯著縮短了33.33%（P＜0.05）；模式I、II、IV組小鼠曠場中央區域活動時間較年輕對照組均無顯著性差異（P＞0.05），分別為（50.52±14.42）、（53.72±11.05）s及（49.08±8.38）s，表明模式I、II、IV均能對D-半乳糖致衰老小鼠的情緒有調節作用。與衰老模型組相比，模式I、II、III、IV組小鼠中央區域活動時間分別顯著延長了63.12%、73.46%、116.60%和58.48%（P＜0.05），表明巴馬特色飲食模式能降低D-半乳糖致衰老小鼠的焦慮水平，使其對新刺激的敏感性增加。與模式I組相比，模式III組小鼠中央區域活動時間顯著延長32.78%，表明巴馬特色飲食模式III對D-半乳糖致衰老小鼠焦慮性的抑制效果明顯優于模式I。與年輕對照組相比，模式III組小鼠曠場中央區域活動時間顯著延長了44.41%（P＜0.05），這種現象在目前研究中還鮮有報道，進一步表明巴馬特色飲食模式III能逆轉D-半乳糖致衰老小鼠的焦慮性，使其情緒更加穩定。

據報道，灌胃100 mg/kg紫甘薯色素能使注射質量分數5% D-半乳糖8 周致衰老小鼠跨越方格數提高至130 格[43]；灌胃高、中劑量的活性肽-N分別能使注射質量分數1% D-半乳糖致衰老小鼠后肢直立數提高83.85%（P＜0.05）、119.10%（P＜0.01）[47]。本研究通過注射18 周質量分數10% D-半乳糖使小鼠衰老，巴馬特色飲食模式II、III、IV組小鼠的后肢直立數分別提高131.91%（P＜0.05）、109.57%（P＜0.05）和94.68%（P＞0.05），表明巴馬特色飲食能明顯提高致衰老小鼠的活動能力。Tian Yan等[35]研究發現，灌胃400 mg/（kg·d）高分子質量柿子單寧能使D-半乳糖致衰老小鼠后肢直立數和跨越方格數分別增加至8 次和110 格，而本實驗中巴馬特色飲食模式II、III、IV組小鼠平均后肢直立數幾乎是其2 倍。模式II使D-半乳糖致衰老小鼠的運動距離增加16.92%（P＞0.05），曠場中央區域活動時間顯著延長73.46%（P＜0.05）；模式III使致衰老小鼠中央區域活動時間顯著延長116.60%（P＜0.05）。Zhang Yan等[48]研究發現，飼喂柚皮素后，注射150 mg/kg D-半乳糖8 周致衰老小鼠的運動距離顯著提高約11.54%，曠場中央區域活動時間顯著延長約57.14%。對比看來，本研究中的模式II、III對致衰老小鼠的抗焦慮性、自發探索行為及感覺運動能力的提高效果與相關報道結果相比具有一定的優勢。

2.3 巴馬特色飲食模式對D-半乳糖致衰老小鼠緊繩實驗的影響

緊繩實驗主要檢測小鼠神經肌肉協調與感覺運動能力[49]，它要求小鼠有較好的協調能力、較強的肌肉力量和較低的焦慮水平[37]。懸掛時間考察小鼠體力及平衡能力，懸掛時間的縮短及轉換分值的下降反映小鼠運動平衡能力的下降[37]。由圖5A可知，衰老模型組小鼠懸掛時間較年輕對照組縮短24.88%（P＞0.05），表明D-半乳糖致衰老小鼠的平衡運動能力減退。模式II、III、IV組小鼠懸掛時間相對于年輕對照組分別延長至（58.90±4.74）、（57.67±6.28）、（57.47±7.78）s（P＞0.05），表明巴馬特色飲食模式II、III、IV能提高致衰老小鼠的運動協調能力。與衰老模型組相比，巴馬特色飲食模式I～IV組小鼠懸掛時間分別延長20.45%（P＞0.05）、51.92%（P＜0.05）、48.75%（P＜0.05）和48.23%（P＜0.05）。與模式I組相比，模式II、III、IV組小鼠懸掛時間分別顯著延長26.12%、23.49%及23.06%（P＜0.05），表明巴馬特色飲食能顯著改善衰老小鼠肌肉力量、運動協調性和平衡能力，且效果優于益生菌飲食。

圖5 各組小鼠緊繩懸掛時間（A）、轉換分值（B）Fig. 5 Effect of Bama characteristic dietary patterns on suspension time (A) and conversion score (B) of each group in tight rope test

由圖5B可知，與年輕對照組相比，衰老模型組小鼠轉換分值顯著減少43.55%（P＜0.05），模式I組小鼠轉換分值下降15.43%（P＞0.05），而模式II、III、IV組分別提高43.66%（P＜0.05）、39.33%（P＜0.05）和16.02%（P＞0.05），表明巴馬特色飲食模式II、III能顯著逆轉D-半乳糖致衰老小鼠的運動失衡，提高其感覺運動能力，且效果明顯優于模式I。與衰老模型組小鼠相比，巴馬特色飲食模式I～IV組小鼠轉換分值分別顯著增加了49.81%、154.47%、146.79%和105.50%（P＜0.05）。表明巴馬特色飲食模式能顯著改善D-半乳糖致衰老小鼠肌肉力量、運動協調性和感覺運動能力，其中模式II、III效果更佳。

白藜蘆醇能顯著提高衰老小鼠神經肌肉協調與感覺運動能力，使得衰老小鼠的懸掛時間顯著延長42.86%，轉換分值顯著增加75%[49]。本研究中巴馬特色飲食模式II組小鼠能將懸掛時間顯著延長51.92%（P＜0.05），轉換分值顯著增加154.47%（P＜0.05），與相關報道相比具有一定的優勢。然而，在現有文獻中鮮有對飲食模式改善神經肌肉協調與感覺運動能力方面的研究。本研究發現D-半乳糖致衰老小鼠經巴馬特色飲食模式干預后，模式II、III、IV組小鼠懸掛時間及轉換分值均得到顯著延長和提高，此現象在目前飲食模式的相關研究中鮮有報道。

3 結 論

本研究以“問計于百歲老人求健康飲食”為出發點，以巴馬長壽老人飲食特征為借鑒，探索新型健康的飲食模式，設計了4 種巴馬特色飲食模式，并利用D-半乳糖致衰老小鼠模型進行驗證。研究發現，各巴馬特色飲食模式均對D-半乳糖致衰老小鼠的體質量變化沒有顯著影響（P＞0.05）。通過曠場實驗、緊繩實驗來探究巴馬特色飲食模式對衰老小鼠模型自發探索行為、神經肌肉協調性、感覺運動能力和抗焦慮水平的影響，發現在曠場實驗中巴馬飲食模式能提高衰老小鼠的后肢直立數和跨越方格數，增加衰老小鼠的運動距離和平均移動速率，顯著延長D-半乳糖致衰老小鼠的總運動時間及在曠場中央區域活動時間（P＜0.05），其中模式III組小鼠在曠場中心活動時間較年輕對照組顯著延長（P＜0.05），表明巴馬特色飲食模式III對改善D-半乳糖致衰老小鼠自發運動能力和抗焦慮水平的效果好于模式I、IV。緊繩實驗結果表明，巴馬特色飲食模式能夠顯著延長衰老小鼠懸掛時間（P＜0.05），顯著提高轉換分值（P＜0.05），巴馬特色飲食模式II、III、IV組小鼠懸掛時間均長于年輕對照組（P＞0.05），模式II、III組小鼠轉換分值較年輕對照組分別顯著提高43.66%和39.33%（P＜0.05），表明巴馬特色飲食對保護衰老小鼠的神經肌肉協調性和感覺運動能力具有良好的效果，這種現象在目前研究中還鮮見報道。綜上所述，巴馬特色飲食模式能改善D-半乳糖致衰老小鼠的運動能力和抗焦慮水平，且巴馬特色飲食模式II、III、IV的效果要優于模式I，尤其是巴馬特色飲食模式II、III值得深入探討，以期能夠服務于普通人群。