桑葉生物堿對高脂飲食誘導小鼠肝損傷的改善作用及機理

王祖文，楊忠敏，楊 敏，黃先智，丁曉雯,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，重慶 400716；2.西南大學科技處，重慶 400716）

肝損傷可由藥物副作用、過量飲酒、攝入環境中的某些有毒物質、長期高脂飲食等因素引起[1]，是危害人類身體健康最常見的疾病之一。隨著人們生活水平的提高，高脂食物在日常飲食中占比越來越高。研究表明，高脂飲食會導致非酒精性脂肪肝，造成由單純性脂肪肝轉變為非酒精性脂肪肝炎，進一步演變成肝硬化甚至是肝癌[2]。高脂飲食造成的肝損傷具體表現在機體內臟脂肪堆積、糖脂代謝異常、胰島素抵抗、肝臟脂肪變性、肝細胞膜受損、出現炎癥和氧化應激、細胞凋亡等方面[3]。

近年來大量研究證明中藥有治療肝損傷的作用，如葛根、苦參、柴胡等[4]，它們含有多糖、黃酮、生物堿等多種功能成分，具有維護實驗動物肝臟細胞膜完整，抑制血清谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平升高，清除機體自由基、增加抗氧化能力，降低肝損傷動物體內腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β的水平、減少炎癥反應，減緩肝細胞凋亡等作用[5]。桑葉為藥食同源，生物堿是桑葉的主要活性成分之一。研究表明，桑葉生物堿具有降糖[6]、降脂[7]、抑制病毒活性[8]、抗腫瘤細胞生長[9]、減輕腎損傷[10]等作用，但目前關于桑葉生物堿對肝損傷的保護作用鮮有報道。因此，本研究采用高脂飲食建立小鼠肝損傷模型，以桑葉生物堿為研究對象，初步探討桑葉生物堿改善高脂飲食小鼠肝損傷的作用與機理，為桑葉保護肝臟相關保健食品的開發提供理論依據，為桑葉產業發展提供新思路，為高脂飲食導致肝損傷的預防和治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料、動物與試劑

桑葉（品種為‘勝利大葉’）粉末由重慶畜牧科學院蠶研所提供。

清潔級雄性昆明小鼠200 只（4 周齡），體質量（20±2）g，由重慶中藥研究院提供，生產許可證號：SCXK（渝）2012-0006。

基礎飼料 重慶滕鑫比爾實驗動物有限公司；高脂飼料為實驗室自制，配方參照文獻[11]進行適當修改：基礎飼料78.9%（質量分數，下同）、豬油10%、蛋黃粉10%、膽固醇1%、膽酸鈉0.1%。

AST、ALT測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；蘇木精染液、伊紅染液 南昌雨露實驗器材有限公司；動物組織RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈反轉錄試劑盒 北京天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

EG1105H型石蠟切片機 德國Leica公司；包埋盒江蘇世泰實驗器材有限公司；DHP-9082型恒溫培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司；生物顯微鏡日本OLYMPUS株式會社；ALPAAI-4LSC型高速離心機德國Christ公司；DW-HL438型超低溫冰箱 合肥美菱股份有限公司；XW-80A型微型漩渦混合儀 上海精科實業有限公司；Synergy H1型酶標儀 美國基因有限公司；5880型冷凍離心機 德國Eppendorf公司；NanoDrop ND-2000C型微量紫外分光光度計、CFX96型實時定量反轉錄聚合酶鏈式反應（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀、T100型PCR儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葉生物堿制備

按料液比1∶30（m/V）稱取桑葉粉，60 ℃、600 W超聲處理60 min，重復提取2 次，合并濾液，減壓濃縮；將濃縮液以2.1 BV/h流速過D101大孔樹脂得到純化液；再將純化液以2.5 BV/h流速過732型陽離子樹脂吸附，先用蒸餾水洗至中性，再用2 BV 0.5 mol/L氨水洗脫得到氨水洗脫液；將氨水洗脫液以2.1 BV/h流速過AB-8大孔樹脂，洗脫液冷凍干燥得樣品[12-13]。采用硅鎢酸沉淀法[14]測得樣品中總生物堿質量分數為85.57%。

1.3.2 動物分組及飼養

本研究獲得西南大學實驗動物保護協會許可，小鼠按照西南大學實驗動物保護和使用規則飼養，室溫22～25 ℃，相對濕度40%～60%，12 h明暗交替（9∶00～21∶00），自由進食、飲水。200 只昆明小鼠適應性喂養7 d后，隨機分為正常對照組、高脂對照組和低、中、高劑量組（桑葉生物堿劑量分別為50、100、200 mg/kg）5 組，每組40 只。除正常對照組給予基礎飼料外，其余組均給予高脂飼料喂養。桑葉生物堿各劑量組灌胃0.1 mL/10 g不同劑量桑葉生物堿，正常對照組和高脂對照組給予等量生理鹽水，每日1 次，連續灌胃16 周。每次灌胃前稱體質量以調整給藥體積。

1.3.3 肝臟系數的測定及肝組織病理學觀察

分別于灌胃的第4、8、12、16周末處死各組小鼠各10 只。小鼠禁食不禁水16 h，眼球取血于含有肝素鈉的真空采血管中，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，收集上清液，于-80 ℃保存備用。采血完畢后，頸椎脫臼處死小鼠，快速取出肝臟，用冷生理鹽水漂洗除去表面血液，濾紙拭干，稱質量，按下式計算肝臟系數[11]。在肝臟同一位置切取小塊肝組織，用質量分數10%福爾馬林溶液固定48 h，石蠟包埋，切片（5 μm），蘇木精-伊紅染色，在顯微鏡下進行肝組織病理學觀察。

1.3.4 血漿AST、ALT活力測定

血漿AST、ALT活力的測定按照相應試劑盒說明書步驟進行。

1.3.5 肝組織TNF-α、IL-10、Bax、Bcl-2 mRNA表達的測定

按照動物組織RNA提取試劑盒說明書提取純化操作方法提取肝臟組織總RNA，對RNA進行純度測定。按反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄成cDNA第一鏈，再進行PCR擴增。取上述反轉錄產物1 μL作為反應模板，反應體系10 μL。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，如表1所示。qRT-PCR條件：95 ℃、4 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，共40 個循環。以β-actin作內參基因，分別測定肝組織TNF-α、IL-10、Bax、Bcl-2 mRNA的相對表達量，結果以2-ΔΔCt法計算。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 數據統計與分析

實驗結果均以平均值±標準差表示，采用SPSS 20.0軟件對結果進行單因素方差分析，P＜0.05為差異顯著。采用Origin 8.6軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 桑葉生物堿對肝臟系數的影響

在動物實驗中，臟器質量和臟器系數是藥物慢性實驗指定檢測項目，通過實驗動物的臟器質量、臟器系數可大體確定臟器損傷或病變的程度[15]。本研究測定了桑葉生物堿對高脂飲食小鼠肝臟系數的影響，結果如表2所示。

表2 桑葉生物堿對小鼠肝臟系數的影響Table 2 Effect of mulberry leaf alkaloids on liver index in mice

由表2可知，與正常對照組相比，喂飼4、8、12、16 周后，高脂對照組小鼠肝臟系數分別顯著增加了10.67%、11.24 %、12.38%、7.58%（P＜0.05），提示高脂飲食可能會導致小鼠的肝臟損傷。與高脂對照組相比，除低劑量組在灌胃4 周時肝臟系數未下降外，其余時間各劑量組小鼠的肝臟系數均顯著下降（P＜0.05），并于8 周末恢復到正常水平，與正常對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 桑葉生物堿對高脂飲食小鼠ALT、AST活力的影響

ALT、AST主要分布于肝細胞內，當肝細胞出現損傷或壞死時，肝細胞膜通透性增加，ALT、AST被釋放入血，引起血液中含量上升，因此血液中ALT、AST活力的升高反映了肝臟損傷程度[16-17]。本研究測定了各組小鼠血漿AST、ALT活力，以考察桑葉生物堿對高脂飲食小鼠肝損傷的影響。

2.2.1 桑葉生物堿對高脂飲食小鼠血漿AST活力的影響

表3 桑葉生物堿對小鼠血漿AST活力的影響Table 3 Effect of mulberry leaf alkaloids on plasma AST activity in mice

由表3可知，實驗期間正常對照組小鼠血漿AST活力基本保持穩定。與正常對照組比，高脂對照組小鼠血漿AST活力顯著升高（P＜0.05），且隨著喂飼高脂飼料時間的延長，AST活力呈現遞增趨勢，在第4、8、12、16周，小鼠血漿AST活力分別增加了48.02%、53.44%、71.16%、82.06%，說明持續攝入高脂飲食會不斷加重肝細胞損傷，破壞細胞膜，釋放出大量AST。與高脂對照組比，隨著桑葉生物堿灌胃劑量增加和灌胃時間延長，各劑量組的小鼠血漿AST活力均有所下降。灌胃至16 周末，低、中、高劑量組小鼠血漿AST活力分別下降了29.84%、42.02%、46.44%，中、高劑量組小鼠的AST活力恢復到正常水平，與正常對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。

2.2.2 桑葉生物堿對高脂飲食小鼠血漿ALT活力的影響

表4 桑葉生物堿對小鼠血漿ALT活力的影響Table 4 Effect of mulberry leaf alkaloids on plasma ALT activity in mice

由表4可知，實驗期間正常對照組小鼠血漿ALT活力基本保持穩定。與同時期的正常對照組比，第4、8、12、16周末，高脂對照組小鼠血漿ALT活力分別增長了83.33%、57.12%、62.85%、70.41%（P＜0.05）。與高脂對照組比，隨著桑葉生物堿灌胃劑量增加和時間延長，各劑量組小鼠血漿ALT活力均有所下降。從第12周末開始，中、高劑量桑葉生物堿灌胃的小鼠血漿ALT活力均恢復到正常水平，與正常對照組比差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 桑葉生物堿對高脂飲食小鼠肝組織病理學的影響

肝臟組織結構能夠直觀反映肝臟的損傷程度。為了研究桑葉生物堿對高脂飲食小鼠肝臟的影響，通過對各實驗組小鼠肝臟染色、鏡檢，考察灌胃桑葉生物堿粗提取液4、8、12、16 周后對小鼠肝臟組織結構的影響，結果如圖1所示。

圖1 各組小鼠肝組織病理切片圖（100×）Fig. 1 Histomorphological images of liver tissue in each group (100 ×)

由圖1可知，實驗期間正常對照組小鼠肝組織結構形態正常、質地均勻，肝細胞呈規則多邊形，大小相似，胞質極豐富，細胞核清晰易見。隨著高脂飼料喂飼時間的延長，高脂對照組小鼠肝組織胞漿內分布的脂滴逐漸增加，部分細胞核被脂滴擠壓至胞漿邊緣，周圍可見彌漫性肝細胞脂肪變性，大量肝細胞明顯腫脹。隨著低、中劑量桑葉生物堿灌胃時間的延長，肝細胞的形態與排布逐漸趨于正常，肝組織胞漿內脂滴、肝細胞紊亂有所改善；而整個實驗期間，當灌胃高劑量桑葉生物堿時，小鼠肝組織形態、大小基本恢復正常，脂肪的聚集現象不明顯，細胞核的大小均較正常，肝細胞呈多邊形，與正常對照組比無明顯差異。

2.4 桑葉生物堿對肝臟炎癥因子mRNA表達的影響

炎癥反應與一些細胞因子如TNF-α、IL-6、IL-10等密切相關。在肝臟損傷的過程中，炎癥體被激活是一種常見的病理生理過程[18]。TNF-α是一種由單核細胞和巨噬細胞產生的單核因子，具有促炎作用[19]。肝臟中許多細胞都能分泌IL-10，其具有消除炎癥的作用[20]。如果肝臟發生損傷，TNF-α mRNA表達量增加，而IL-10 mRNA表達量減少。因此，本研究著重考察肝臟組織中TNF-α、IL-10 mRNA表達情況，從而判斷高脂飲食誘導肝臟損傷的炎癥反應嚴重程度和桑葉生物堿是否具有抑制炎癥的作用。

2.4.1 桑葉生物堿對肝組織TNF-α mRNA表達的影響

圖2 桑葉生物堿對小鼠肝組織TNF-α mRNA表達的影響Fig. 2 Effect of mulberry leaf alkaloids on the mRNA expression of TNF-α in liver tissue of mice

由圖2可知，實驗期間正常對照組小鼠肝臟TNF-α mRNA表達水平基本保持穩定。與正常對照組比，高脂對照組小鼠肝臟TNF-α mRNA表達水平顯著上升（P＜0.05），在4、8、12、16 周末分別增加了233.33%、225.60%、222.03%、217.09%，說明高脂飲食引起炎癥反應，小鼠肝細胞中TNF-α mRNA表達水平增加，但與喂飼時間無明顯關系。與高脂對照組比，隨著桑葉生物堿灌胃時間的延長，各劑量組小鼠肝臟TNF-α mRNA表達量均呈現降低趨勢；在16 周末，灌胃低、中、高劑量桑葉生物堿小鼠肝臟TNF-α mRNA表達量分別下降了47.41%、48.90%、68.56%，高劑量組小鼠的TNF-α mRNA表達量恢復至正常水平，與正常對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。

2.4.2 桑葉生物堿對肝組織IL-10 mRNA表達的影響

圖3 桑葉生物堿對小鼠肝組織IL-10 mRNA表達的影響Fig. 3 Effect of mulberry leaf alkaloids on the mRNA expression of IL-10 in liver tissue of mice

由圖3可知，實驗期間正常對照組小鼠肝臟IL-10 mRNA表達量基本保持穩定。與正常對照組比，高脂對照組小鼠IL-10 mRNA表達量顯著降低（P＜0.05），隨著喂飼時間的延長，表達量呈現下降趨勢，4、8、12、16 周分別降低了26.49%、41.69%、42.34%、57.04%。與高脂對照組比，灌胃桑葉生物堿的各劑量組小鼠肝臟IL-10 mRNA表達量隨著時間延長逐漸上升；在16 周末，低、中、高劑量組小鼠肝臟IL-10 mRNA表達量分別提高了70.64%、137.12%、155.30%；且中、高劑量組IL-10 mRNA表達量恢復至正常水平，與正常對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。

2.5 桑葉生物堿對小鼠肝臟細胞凋亡因子表達的影響

肝損傷通常會引起肝細胞的凋亡，其中Bcl-2家族參與介導細胞的凋亡[21]，具有代表性的是促進細胞凋亡因子Bax和抑制細胞凋亡因子Bcl-2，其在細胞凋亡調控中起重要的作用。肝組織中Bcl-2水平升高和Bax水平降低表明細胞對凋亡的抵抗性增強，標志著藥物對肝臟有保護作用[22-23]。因此，本研究考察桑葉生物堿對高脂飲食小鼠細胞凋亡因子Bax和Bcl-2 mRNA表達量的影響。

2.5.1 桑葉生物堿對肝組織Bax mRNA表達的影響

圖4 桑葉生物堿對小鼠肝組織Bax mRNA表達的影響Fig. 4 Effect of mulberry leaf alkaloids on the mRNA expression of Bax in liver tissue of mice

由圖4可知，實驗期間正常對照組小鼠肝組織Bax mRNA表達量基本保持穩定。與正常對照組比，高脂對照組小鼠的肝組織Bax mRNA表達量顯著升高（P＜0.05），于4、8、12、16 周分別升高了216.00%、250.00%、217.39%、213.04%。與高脂對照組比，灌胃桑葉生物堿的各劑量組小鼠Bax mRNA表達量顯著下降（P＜0.05），且隨著喂飼時間延長逐漸下降；在16 周末，桑葉生物堿低、中、高劑量組小鼠肝臟Bax mRNA表達量分別下降了43.06%、51.39%、68.06%，高劑量組小鼠該指標恢復至正常水平，與正常對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。

2.5.2 桑葉生物堿對肝組織Bcl-2 mRNA表達的影響

圖5 桑葉生物堿對小鼠肝組織Bcl-2 mRNA表達的影響Fig. 5 Effect of mulberry leaf alkaloids on the mRNA expression of Bcl-2 in liver tissue of mice

由圖5可知，實驗期間正常對照組小鼠肝組織Bcl-2 mRNA表達量基本保持穩定。與正常對照組比，高脂對照組Bcl-2 mRNA表達量顯著下降（P＜0.05），于4、8、12、16 周分別下降了44.64%、44.44%、50.00%、38.46%。與高脂對照組比，灌胃桑葉生物堿中、高劑量組小鼠Bcl-2 mRNA表達量在4 周末顯著升高（P＜0.05）；而低劑量組小鼠Bcl-2 mRNA表達量在8 周末顯著升高（P＜0.05）；12 周末，灌胃桑葉生物堿的低、中、高劑量組小鼠肝臟Bcl-2 mRNA表達量分別上升了59.26%、77.78%、74.07%，均恢復至正常水平，與正常對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。

3 討 論

桑葉廣泛分布于全國各地，其作為中藥的歷史悠久。2015版《中華人民共和國藥典》中記載桑葉“甘、苦、寒，歸肺、肝經，具有疏散風熱、益肝通氣、清肝明目等功效”[24]，桑葉營養豐富、無毒副作用，可作為藥食兩用。現已有不少研究證明，作為桑葉中主要活力成分的生物堿具有降糖、降脂等功能[19]，但其保肝作用鮮有報道，本實驗以高脂飲食小鼠為考察對象，研究桑葉生物堿對高脂飲食引起肝功能異常的改善作用。當肝細胞受損時，ALT、AST釋放入血，濃度升高。研究發現，喂飼高脂飼料的同時灌胃桑葉生物堿，隨著灌胃劑量的增加和灌胃時間的延長，桑葉生物堿能有效降低小鼠臟器系數，降低血漿中ALT、AST活力，維持肝功能正常，與肝臟病理切片結果一致。

當長期處于高脂飲食狀態下，機體內脂肪含量的增多和脂肪細胞的分化，會產生一系列的細胞因子[26]。TNF-α是一種強有力的炎癥細胞因子，在許多炎性疾病和協調細胞因子級聯反應中發揮關鍵作用，因此TNF-α對于維護慢性炎癥至關重要[27-28]。而IL-10是由活化的免疫細胞產生的關鍵抗炎細胞因子，在控制和消除炎癥中起重要作用。本研究發現桑葉生物堿能下調高脂飲食小鼠的促炎因子TNF-α mRNA表達，上調抗炎因子IL-10 mRNA表達，減少炎癥反應。這可能與桑葉生物堿中的特征物質1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）有關。有研究表明DNJ可通過促進血脂血糖的轉運代謝來改善小鼠肝損傷[29-30]。此外，DNJ還能顯著降低ALT、AST水平，減輕肝組織大泡性脂肪變性，降低促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6水平[31]。

細胞因子和炎癥介質還可能引起肝細胞凋亡，進一步增加肝組織損傷[32-33]。Bcl-2家族蛋白是細胞凋亡、自吞噬等生命過程的重要調控因子，抗凋亡蛋白成員和促凋亡蛋白成員之間的協同作用共同決定細胞是否進入凋亡程序[34-35]，其中Bcl-2抗細胞凋亡的機制之一是拮抗促凋亡基因Bax。本研究發現灌胃桑葉生物堿可抑制高脂飲食小鼠肝細胞中促凋亡因子Bax mRNA表達，促進Bcl-2 mRNA表達，減少細胞非正常凋亡。

綜上認為，桑葉生物堿可改善高脂飲食誘導的小鼠肝損傷，其機制可能與降低炎癥反應和抗肝細胞凋亡有關。該研究結果有助于高脂飲食誘導肝損傷的預防和治療。