苦菜黃酮對高脂血癥小鼠血脂代謝及保肝作用

單科開，王鴻飛*，許 鳳*，羅 潔，李艷霞，韓愛茹，邵興鋒，韋瑩瑩

（寧波大學食品與藥學學院，浙江 寧波 315211）

高脂血癥是當今一種很常見的慢性疾病，其發病原因是由于機體脂類代謝失調而導致血液中一種或幾種脂質成分發生明顯異常，相關的物質大量積累，從而引發脂肪肝、糖尿病、動脈粥樣硬化、高血壓及心血管疾病等，極大地威脅著人們的生命健康[1-2]。當前，國內外降血脂的藥物主要有他汀類、貝特類、煙酸類等，雖然藥效顯著，但受到已發現和潛在的副作用以及昂貴價格的影響，使用情況難盡人意[3]，理想的治療高脂血癥的藥物仍然比較匱乏。近幾年，對天然降血脂生物活性物質的研究越來越受到世界各國的重視，人們開始從天然產物中分離提取一些功能成分，如柑橘黃酮[4]、龍葵多酚[5]、大豆低聚糖[6]等，研究其調節血脂的作用，并取得了一定的成效。

苦菜（Sonchus oleraceus L.）是一種含有多種生物活性物質的藥食同源植物，其活性物質包括黃酮類、氨基酸類、甾醇和苦素等[7]。其中黃酮類物質具有抗氧化、抗過敏、抗炎、抗菌、抗突變、抗腫瘤、保肝、保護心腦血管系統、抗病毒以及殺蟲等廣泛的生理活性[8]。研究發現，苦菜中黃酮類物質含量豐富[9]，但對苦菜黃酮（flavonoids from Sonchus oleraceus L.，FSOL）的降血脂和保肝功能報道不多。本實驗研究苦菜黃酮對高血脂小鼠的降血脂和保肝作用，以期為苦菜黃酮的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性ICR小鼠，SPF級，體質量（20±2）g，由浙江省實驗動物中心提供。動物生產許可證號：SCXK（浙）2014-0001，使用許可證號：SYXK（浙）2013-0191。

基礎飼料由浙江省實驗動物中心提供；高脂飼料由15%（質量分數，下同）豬油、3%膽固醇、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、81.3%基礎飼料組成。

干苦菜 安國藥源商貿有限公司；甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒 南京建成生物工程研究所；所有試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

WK-200B高速藥物粉碎機 山東青州市精誠機械有限公司；SB3200D超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；Cary50Scan紫外分光光度計 美國瓦里安技術有限公司；H1850-R臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；EGll50H包埋機、RM2245切片機 德國徠卡公司。

1.3 方法

1.3.1 FSOL的制備及測定

將購得的干苦菜經過粉碎機粉碎處理，過60 目篩，得到苦菜干粉。稱取一定量的苦菜干粉，以料液比1∶60加入體積分數50%乙醇溶液，超聲波提取，70 ℃水浴浸提160 min，進行離心（5 000 r/min、15 min）后將上清液進行抽濾，將濾液旋轉蒸發后用大孔樹脂AB-8進行分離純化[10]，之后再經過旋轉蒸發得到FSOL濃縮液。采用氯化鋁法[11]測定FSOL的質量濃度，得到FSOL的質量濃度為62.2 mg/mL，取一定體積的FSOL溶液，用去離子水稀釋至50 mg/mL，備用。

1.3.2 動物分組處理

取ICR小鼠60 只，隨機分成6 組，每組10 只，即正常對照組、高脂模型組、陽性對照組、FSOL低劑量組、FSOL中劑量組、FSOL高劑量組。小鼠經過適應性喂養1 周后，正常對照組飼喂基礎飼料，其他組均飼喂高脂飼料。每天分別給FSOL低、中、高劑量組小鼠灌胃50、100、200 mg/kg的FSOL，陽性對照組灌胃10 mg/kg的辛伐他汀，正常對照組和高脂模型組灌胃生理鹽水，灌胃量都為10 mL/kg，連續飼養5 周，實驗期間小鼠自由飲水和進食[12]。每周稱量并記錄各組小鼠體質量，便于調整灌胃劑量。末次灌胃后，小鼠禁食不禁水12 h，次日稱體質量，眼眶取血，靜置后在4 ℃條件下，以3 000 r/min離心10 min分離血清，將血清臨時保存在-20 ℃冰箱中[13]。頸椎脫臼處死小鼠，解剖取出肝臟，用預冷生理鹽水洗去表面血液，濾紙吸干，稱質量，切取一部分用于制備病理切片，剩下部分用錫箔紙包裹后存放于-80 ℃冰箱中備用[14]。

1.3.3 指標測定

血清指標測定：取出血清，經過解凍后，按照試劑盒說明書的方法測定血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C、MDA的濃度以及ALT、AST、SOD的活力，并按式（1）計算動脈粥樣硬化指數（arteriosclerosis index，AI）。

肝臟指標測定：切取一定質量的肝臟，在冰浴條件下用生理鹽水進行機械研磨，得到質量分數10%的肝組織勻漿，之后在4 ℃條件下，以2 500 r/min離心10 min，得到上清液[15]。按照試劑盒說明書的方法測定肝臟組織中TG、TC、MDA含量以及SOD活力。根據小鼠體質量和肝臟質量計算肝臟指數（（式）2）[16]。

式中：y為肝臟指數/%；m為肝臟質量/g；mb為小鼠體質量/g。

1.3.4 肝臟切片觀察

參照Reza等[17]的方法。肝臟組織樣品迅速浸泡在體積分數10%甲醛溶液中，脫水后嵌入石蠟內，切成5 μm厚的薄片，經蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后進行病理組織觀察。

1.4 數據統計與分析

數據以 ±s形式表示，采用SAS 8.1軟件中Two Sample t-test for Means對組間數據進行分析，P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 FSOL對小鼠體質量的影響

表1 FSOL對小鼠體質量的影響（x ±s，n＝10）Table 1 Effect of FSOL on body mass of mice (x s, n= 10)

表1 FSOL對小鼠體質量的影響（x ±s，n＝10）Table 1 Effect of FSOL on body mass of mice (x s, n= 10)

注：與正常對照組比較，*.差異顯著（P＜0.05），**.差異極顯著（P＜0.01）；與高脂模型組比較，#.差異顯著（P＜0.05），##.差異極顯著（P＜0.01），下同。

組別 體質量/g 增質量/g第0周 第1周 第2周 第3周 第4周 第5周正常對照組 20.21±2.14 22.09±2.01 23.81±2.18#25.40±2.66##26.84±3.01##28.36±2.85## 8.15±0.71##高脂模型組 20.96±2.1123.53±2.2326.35±2.30*29.51±2.18**32.05±2.98**35.00±3.60**14.04±1.49**陽性對照組 21.36±2.1323.47±2.02 25.34±2.12 27.12±2.52#28.68±2.69#30.58±3.11## 9.22±0.98*##FSOL低劑量組 20.64±1.6523.41±1.8526.27±2.06*28.88±2.82*31.54±3.05**33.93±3.04**13.29±1.39**FSOL中劑量組 21.62±2.5624.16±1.89*26.64±2.24*28.95±2.58**31.22±2.99**33.26±3.64**11.64±1.08**##FSOL高劑量組 20.81±1.9323.17±1.95 25.40±1.97 27.42±2.03#29.25±2.27#30.87±2.87#10.06±0.94**##

根據表1可知，經過5 周連續喂養，各組小鼠的體質量都有不同程度的增加。與正常對照組相比，高脂模型組體質量增加最多，說明飼喂高脂飼料能增加小鼠體質量。與高脂模型組相比，同是飼喂高脂飼料的條件下，陽性對照組和FSOL中、高劑量組體質量的增加量具有極顯著差異（P＜0.01），FSOL低劑量組無顯著差異（P＞0.05），說明FSOL劑量越高，小鼠體質量增加得越少，即FSOL對高脂血癥小鼠體質量的增加有一定的控制效果。

2.2 FSOL對小鼠血脂水平的影響

表2 FSOL對小鼠血脂水平的影響（x ±s，n＝10）Table 2 Effect of FSOL on blood lipid levels of mice (x s, n= 10)

表2 FSOL對小鼠血脂水平的影響（x ±s，n＝10）Table 2 Effect of FSOL on blood lipid levels of mice (x s, n= 10)

組別 TC濃度/（mmol/L）TG濃度/（mmol/L）HDL-C濃度/（mmol/L）LDL-C濃度/（mmol/L） AI正常對照組 3.47±0.37## 0.57±0.05## 3.32±0.35## 0.53±0.06## 0.05±0.01##高脂模型組 5.46±0.64** 1.84±0.15** 2.77±0.22** 1.59±0.20** 0.97±0.12**陽性對照組 3.62±0.35## 0.66±0.05**## 3.11±0.31# 0.74±0.06**## 0.16±0.02**##FSOL低劑量組 4.53±0.51**## 1.14±0.09**## 2.92±0.35* 1.27±0.14**## 0.55±0.07**##FSOL中劑量組 4.20±0.37**## 1.06±0.08**## 3.04±0.36 0.96±0.10**## 0.38±0.04**##FSOL高劑量組 3.71±0.30## 0.79±0.06**## 3.16±0.34## 0.88±0.10**## 0.17±0.02**##

高水平TC、TG、LDL-C和低水平HDL-C是動脈粥樣硬化的重要指標，醫學上常用AI表示動脈粥樣硬化的危險性[18]。由表2可知，飼喂5 周高脂飼料后，高脂模型組血清中TC、TG、LDL-C水平和AI極顯著高于正常對照組（P＜0.01），HDL-C水平極顯著低于正常對照組（P＜0.01）。與高脂模型組相比，陽性藥物及低、中、高劑量的FSOL均能極顯著降低高脂血癥小鼠TC、TG、LDL-C的含量和AI（P＜0.01），不同的FSOL劑量組中，高劑量FSOL能極顯著提高HDL-C含量（P＜0.01），但低、中劑量FSOL對此無顯著影響（P＞0.05）。結果表明，在一定劑量范圍內，高劑量的FSOL對小鼠實驗性高脂血癥和抗動脈粥樣硬化有預防作用，能降低發生病癥的風險。

2.3 FSOL對小鼠血清中ALT、AST活力的影響

表3 FSOL對小鼠血清中ALT、AST活力的影響（x ±s，n＝10）Table 3 Effect of FSOL on serum ALT and AST activities in mice ( s, n= 10)

表3 FSOL對小鼠血清中ALT、AST活力的影響（x ±s，n＝10）Table 3 Effect of FSOL on serum ALT and AST activities in mice ( s, n= 10)

組別 ALT活力/（U/L） AST活力/（U/L）正常對照組 13.57±1.44## 11.03±1.41##高脂模型組 32.65±3.86** 19.23±2.34**陽性對照組 18.65±1.66**## 16.13±1.71**##FSOL低劑量組 28.76±3.00**# 17.82±1.66**FSOL中劑量組 24.64±1.99**## 14.83±1.57**##FSOL高劑量組 23.83±2.12**## 12.96±1.27**##

ALT、AST的活力能反映肝臟的受損情況，血清中較高的ALT和AST水平說明肝臟有一定程度的損傷。根據表3可知，高脂模型組血清中ALT、AST活力極顯著高于正常對照組（P＜0.01）。與高脂模型組相比，陽性藥物及中、高劑量的FSOL能極顯著降低ALT、AST活力（P＜0.01），低劑量的FSOL能顯著降低ALT活力（P＜0.05），但對AST活力無顯著影響（P＞0.05）。結果表明，FSOL對小鼠肝臟具有一定的保護作用。

2.4 FSOL對小鼠血清和肝臟MDA和SOD水平的影響

表4 FSOL對小鼠血清和肝臟MDA和SOD水平的影響（x ±s，n＝10）Table 4 Effect of FSOL on MDA concentration and SOD activity in serum and liver of mice (x s, n= 10)

表4 FSOL對小鼠血清和肝臟MDA和SOD水平的影響（x ±s，n＝10）Table 4 Effect of FSOL on MDA concentration and SOD activity in serum and liver of mice (x s, n= 10)

血清 肝臟MDA濃度/（nmol/mL）SOD含量/（U/mg）正常對照組 7.31±0.68## 170.58±13.79 1.31±0.14## 279.40±30.06##高脂模型組 10.26±1.10** 158.35±17.04 4.15±0.51** 181.44±22.06**陽性對照組 7.86±0.82## 183.47±21.34## 1.89±0.20**##231.26±25.82**##FSOL低劑量組 9.24±0.99**# 171.33±17.06 3.63±0.32**#216.53±20.13**##FSOL中劑量組 8.78±0.79**## 180.56±20.16# 2.86±0.27**##228.88±22.35**##FSOL高劑量組 8.45±0.79**##192.15±17.87**## 2.16±0.23**## 259.85±27.50##組別SOD活力/（U/mL）MDA含量/（nmol/mg）

血清和肝臟中MDA水平和SOD活力可以反映出機體的抗氧化能力和肝臟的損傷情況，高水平的MDA和低水平的SOD表明機體脂質過氧化嚴重以及肝臟有一定程度損傷。根據表4可知，高脂模型組血清和肝臟中MDA濃度極顯著高于正常對照組（P＜0.01），肝臟中SOD活力極顯著低于正常對照組（P＜0.01）。與高脂模型組相比，陽性藥物及高劑量的FSOL能極顯著降低血清和肝臟中MDA水平，提高血清和肝臟中SOD活力（P＜0.01）；低劑量的FSOL能顯著降低血清和肝臟中MDA水平（P＜0.05），極顯著提高肝臟中SOD活力（P＜0.01），但對血清中SOD活力無顯著影響（P＞0.05）；中劑量的FSOL能極顯著降低血清和肝臟中MDA含量，提高肝臟中SOD活力（P＜0.01），顯著提高血清中SOD活力（P＜0.05）。說明一定劑量的FSOL能降低高脂血癥小鼠機體的過氧化，對肝臟的損傷有一定的保護作用。

2.5 FSOL對小鼠肝臟中TC、TG含量及肝臟指數的影響

表5 FSOL對小鼠肝臟中TC、TG含量及肝臟指數的影響（x ±s，n＝10）Table 5 Effect of FSOL on liver TC and TG levels and liver index of mice (x s, n= 10)

表5 FSOL對小鼠肝臟中TC、TG含量及肝臟指數的影響（x ±s，n＝10）Table 5 Effect of FSOL on liver TC and TG levels and liver index of mice (x s, n= 10)

組別 TC含量/（mmol/g）TG含量/（mmol/g） 肝臟指數/%正常對照組 0.21±0.02## 0.74±0.08## 3.68±0.34##高脂模型組 0.49±0.05** 0.96±0.09** 4.77±0.51**陽性對照組 0.27±0.03**## 0.81±0.08## 3.81±0.34##FSOL低劑量組 0.42±0.03**## 0.91±0.08** 4.53±0.49**FSOL中劑量組 0.37±0.03**## 0.87±0.09**# 4.12±0.38*##FSOL高劑量組 0.34±0.03**## 0.83±0.09*## 3.96±0.37##

由表5可知，高脂模型組肝臟中TC、TG含量和肝臟指數極顯著高于正常對照組（P＜0.01）。與高脂模型組相比，陽性藥物及高劑量的FSOL能極顯著降低肝臟中TC、TG含量和肝臟指數（P＜0.01）；低劑量的FSOL能極顯著降低肝臟中TC含量（P＜0.01），但對肝臟中TG含量和肝臟指數無顯著影響（P＞0.05）；中劑量的FSOL能極顯著降低肝臟中TC含量和肝臟指數（P＜0.01），顯著降低肝臟中TG含量（P＜0.05）。結果表明，FSOL能降低高脂血癥小鼠肝臟中TC、TG含量，并且降低肝臟指數，對肝臟有一定的保護作用。

2.6 FSOL對小鼠肝臟組織病理變化的影響

圖1 小鼠肝組織HE染色（400×）Fig. 1 Hematoxylin-eosin staining of liver tissues from mice (400 ×)

如圖1所示，正常對照組小鼠肝組織中肝小葉結構清晰完整，肝細胞排列緊密且形態正常，胞漿內未出現脂肪空泡、脂肪變性和脂肪壞死等現象。高脂模型組中肝小葉結構不清晰，肝細胞體積變大且部分壞死，中央靜脈附近的肝細胞排列紊亂，形態不完整，胞質內充滿大量脂肪空泡，呈現非酒精性脂肪性肝病的組織病理學現象[19]。與高脂模型組相比，陽性對照組及FSOL低、中、高劑量組對肝細胞的脂肪變性出現不同程度的改善，胞漿內的脂肪空泡都有減少，肝細胞排列整齊，其中FSOL高劑量組改善效果最明顯，肝小葉結構完整，部分切片與正常對照組相似。

3 討 論

本研究通過飼喂高脂飼料建立高脂血癥小鼠模型，根據分組灌胃陽性藥物及不同劑量的FSOL，5 周后測定小鼠理化指標，并且觀察小鼠肝組織切片確定肝臟受損情況。通過正常對照組和高脂模型組比較，發現在小鼠血清及肝臟中TC、TG等多個指標水平具有極顯著差異，說明高脂血癥小鼠模型建立成功，進一步通過對高脂血癥小鼠灌胃不同劑量的FSOL，研究FSOL對高脂血癥小鼠降血脂的能力。

TC、TG、HDL-C、LDL-C的水平是檢驗高脂血癥的重要指標[20]，其中血清中TC水平的升高是動脈粥樣硬化的危險因素之一[21]。LDL-C的功能是將膽固醇運輸到組織中，充當輸送的載體，但在運輸過程中容易導致膽固醇積累在動脈管壁上，造成動脈粥樣硬化，是動脈粥樣硬化的重要致病因素，其含量與動脈粥樣硬化呈明顯的正相關，而HDL-C是一種抗動脈粥樣硬化的脂蛋白，它能夠將組織或者動脈壁上的膽固醇分離下來，然后運輸到肝臟中將膽固醇分解，最后通過膽汁排出。另外，單一的高TG血癥雖然不是引發心血管疾病的獨立危險因素，但是同時出現血清中TC水平升高或者HDL-C水平降低的情況時，高水平的TG是引發心血管疾病的因素之一[22]。醫學研究表明，血清中TC、TG、LDL-C水平的升高和HDL-C水平的降低更容易誘發動脈粥樣硬化和心腦血管疾病[23]。通過對實驗數據分析得出，高劑量的FSOL能顯著降低血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平，同時也降低肝臟組織中TC、TG水平，與高脂模型組相比，FSOL高劑量組中HDL-C水平比陽性對照組高，說明FSOL的作用可能是通過提高HDL-C的含量，從而使TC、TG、LDL-C的含量降低，達到降低血脂的目的。

肝臟通過調節碳水化合物、脂肪和蛋白質的合成及分解，維持著一個較為穩定的內環境[24]。肝臟損傷與其代謝異常密切相關，其中脂質代謝紊亂是肝臟損傷的一個重要因素。肝臟指數能反映肝臟的損傷程度[25]，此外，在醫學上檢測肝組織中ALT、AST是反映肝功能的主要指標。研究表明，在肝臟組織中，ALT主要分布于肝細胞漿的可溶性部分，AST主要分布于肝細胞漿的可溶性部分及線粒體中。當肝細胞受到損傷時，胞內的大部分ALT、AST被釋放到血液中，造成血液中ALT、AST水平升高[26]，通過測定高脂血癥小鼠血清中ALT、AST水平分析FSOL對高脂血癥小鼠的肝臟是否有保護作用。根據數據分析得出，與高脂模型組比較，陽性藥物及中、高劑量的FSOL能極顯著降低ALT、AST水平（P＜0.01），低劑量的FSOL能顯著降低ALT水平（P＜0.05），但對AST水平無顯著影響（P＞0.05），可能的原因是低劑量的FSOL對高脂血癥小鼠肝臟的保護作用較小，使血清中AST水平降低不明顯。與正常對照組比較，陽性對照組ALT、AST水平存在極顯著差異（P＜0.01），可能原因是陽性藥物濃度較高，導致肝臟代謝壓力增大，使肝臟造成一定程度損傷[27]。通過肝臟組織切片觀察，FSOL低、中、高劑量表現出劑量-效應關系，FSOL高劑量作用效果最明顯，中劑量次之，低劑量存在一定程度的脂肪變性，說明在一定范圍內，高劑量的FSOL對肝臟具有保護作用。

在食用高脂食物過程中會造成機體血脂異常，血脂異常會導致機體抗氧化能力下降，氧自由基生成量增加，脂質過氧化作用增強[28]。SOD是機體細胞主要的抗氧化酶之一，它能催化超氧陰離子自由基發生歧化反應，阻斷自由基的毒性作用，是維持生物體自由基產生和過氧化物清除能力平衡的重要物質[29]，檢測機體中SOD水平可以反映機體組織的抗氧化能力。MDA是脂質過氧化反應鏈終止階段產生的小分子產物，對細胞膜有嚴重的破壞作用，機體中MDA的水平可以間接反映機體組織細胞的過氧化程度[30]。通過數據分析得到，高脂模型組肝臟中MDA含量明顯高于正常對照組，SOD活力極顯著低于正常對照組（P＜0.01），表明高脂血癥小鼠體內發生了明顯的脂質過氧化反應，肝臟的抗氧化能力降低[31]。與高脂模型組比較，高劑量的FSOL能極顯著降低MDA含量及提高SOD活力（P＜0.01），表明FSOL能降低高脂血癥小鼠脂質過氧化和提高機體抗氧化能力，減弱自由基在高脂血癥的發生和發展過程中所起的作用，發揮防治動脈硬化等心血管疾病的能力。

綜上所述，FSOL能降低因高脂血癥引發的小鼠的血脂水平升高，同時還能改善小鼠的肝臟損傷，降低高脂血癥小鼠體內脂質過氧化產物的含量，提高機體的抗氧化能力，這對于預防高脂血癥的發生有重要的作用，另外也為FSOL的開發提供了理論依據。