抗菌肽Jelleine-I對采后柑橘果實綠霉病的控制作用

李心丹，王文軍，鄧麗莉,2，姚世響,2，曾凱芳,2,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.西南大學食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

柑橘屬蕓香科（Rutaceae）柑橘亞科（Aurantioideac）柑橘屬（Citrus）柑橘亞族（Citrinae）果樹，主要集中分布在中國、美國等地區[1]。因柑橘果實柔嫩多汁，富含豐富的糖類、酸類、VC以及礦質元素和多種苷類物質，營養價值高，而深受消費者喜愛[2-3]。我國柑橘以鮮銷為主，在旺季時需大量貯藏，而采摘后的柑橘果實在貯藏過程中易受病原菌侵染而發生大量腐爛現象，造成巨大的經濟損失[4]。其中由指狀青霉（Penicillium digitatum）引起的綠霉病是柑橘貯藏期主要病害之一[5]。在現有柑橘類果實侵染性病害防治方法中，化學殺菌劑的使用是最普遍也是最有效的，如苯并咪唑類殺菌劑的代表品種多菌靈以及咪唑類殺菌劑的代表品種咪鮮胺[6]。但化學殺菌劑的長期使用使環境及人體健康受到了潛在的威脅，且使病原微生物對其產生抗性，因而化學殺菌劑的使用逐漸受到限制[7]。研究者們開始致力于尋找對人體健康無害的方式和物質來代替或減少化學殺菌劑的大劑量使用。

抗菌肽是由基因編碼、核糖體合成的能夠抵御外界病原菌的多肽，廣泛存在于各種生物體內，具有廣譜抑菌性[8-9]?？咕目赏ㄟ^與病原微生物的細胞膜、細胞壁或胞內靶點物質作用加速病原菌死亡[10-11]?？咕淖饔脵C制的特殊性使病原菌不易對其產生抗性。近年來，抗菌肽的高效抑菌性使其在醫藥業、農業、食品工業及畜牧業受到越來越多的關注[12-13]。在果蔬采后病害控制方面，研究者通過直接提取、化學合成以及利用微生物表達等方式獲取抗菌肽，利用抗菌肽對病原菌的抑制作用控制果蔬采后病害的發生[14-19]。其中，陽離子短鏈抗菌肽由于較低的合成成本及優良的抗菌性能備受研究者關注?？咕腏elleine-I（PFKLSLHL-NH2）是一種從蜜蜂（Apis mellifera）的蜂王漿中分離得到的陽離子短鏈抗菌肽，對細菌和酵母具有獨特的抑菌活性[20-22]。但有關抗菌肽Jelleine-I控制果蔬采后病害的研究報道尚少，也鮮見將抗菌肽Jelleine-I應用于柑橘果實采后病害控制的相關研究報道。本研究旨在探究抗菌肽Jelleine-I對引起柑橘果實綠霉病的病原菌P. digitatum生長的影響及可能的作用機理，并評價抗菌肽Jelleine-I對柑橘果實采后綠霉病的控制效果，從而拓寬抗菌肽Jelleine-I的應用范圍，為控制柑橘果實采后病害提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

使用固相合成方法于南京金斯瑞公司合成純度大于90%的抗菌肽Jelleine-I，貯藏于-40 ℃冰箱中，使用前先用無菌水配成1 mmol/L的母液，然后稀釋至所需濃度。

指狀青霉（P. digitatum）分離于發病豐臍果實，并通過分子生物學方法鑒定。用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）于25 ℃培養病原菌，7 d后收集孢子并用無菌水調至所需濃度[23]。

實驗所用柑橘品種為豐臍（Citrus Sinensic (L.)Osbeck），11月下旬采摘于重慶市北碚區馮家槽果園。果實（可溶性固形物質量分數為10.1%，可滴定酸質量分數為0.96%）采收后立即運回實驗室，挑選成熟度一致、大小均一、無機械傷、無病蟲害的健康果實作為實驗材料。

SYTOX Green（SG）熒光染色試劑 美國Invitrogen公司；Calcofluor White（CFW）熒光染色試劑美國Sigma Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

BXM30R立式高壓滅菌鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇凈集團安泰有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司；B203生物顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限公司；SYNERGYH1MG全自動酶標儀 美國BioTek公司；TS100熒光顯微鏡 北京長恒榮創科技有限公司；AvantiTMJ-30I高速冷凍離心機 美國Beckman公司；DDS-307A電導率儀 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗菌肽Jelleine-I對P. digitatum的離體抑菌作用

實驗參照Jia Fengjing等[21]的方法并進行一定的修改。用無菌的96 孔微量板進行實驗，將180 μL 1×104CFU/mL P. digitatum孢子懸浮液（含體積分數5%馬鈴薯葡萄糖液體培養基（potato dextrose broth，PDB））、20 μL抗菌肽Jelleine-I，混合后立即加入96 孔板中，抗菌肽Jelleine-I的終濃度分別為3.12、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L。設無菌水為對照，置于25 ℃恒溫培養箱中培養，48 h時用酶標儀測定其OD600nm。以48 h時依舊能完全抑制病原菌生長的最低濃度作為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。并從未見菌絲生長的孔中吸取50 μL液體涂布在PDA培養基上，于25 ℃繼續培養48 h，以無任何菌落形成的最低濃度為最低殺菌濃度（minimum fungicidal concentration，MFC）。

1.3.2 同孔損傷接種抗菌肽Jelleine-I對柑橘果實綠霉病的控制效果

實驗參照Zhou Yahan等[24]的方法并進行一定的修改。柑橘果實隨機分組，每組15 個果實，以體積分數2%的次氯酸鈉溶液浸泡2 min后用自來水清洗以除去表面殘留污物，果實表面赤道部位用體積分數75%乙醇溶液擦拭消毒后，用滅菌打孔器在果實赤道部位等距打2 個孔（深3 mm、直徑4 mm）。每孔接種10 μL新鮮孢子懸浮液（1×104CFU/mL），4 h后，每孔接種10 μL抗菌肽溶液（12.5、100 μmol/L）或無菌水（對照組）。待液體完全吸收后，用聚乙烯薄膜袋（170 mm×140 mm）將果實單果包裝，置于25 ℃、相對濕度90%～95%的環境中貯藏，每天統計發病率并測量病斑直徑。

1.3.3 抗菌肽Jelleine-I對P. digitatum菌絲體細胞膜透性影響的測定

實驗參考Puig等[25]的方法并進行一定的調整。用體積分數5% PDB配制1×104CFU/mL的病原菌孢子懸浮液，取90 μL加入到無菌的1.5 mL離心管中，25 ℃下培養24 h。然后，加入10 μL抗菌肽溶液，使抗菌肽Jelleine-I終濃度達到0、6.25、12.5、100 μmol/L，無菌水為對照，繼續培養2 h。培養完成后，加入4 μmol/L的SG貯備溶液，使其終濃度達到0.2 μmol/L，樣品在暗環境下培養5 min；然后加入1 g/L CFW，使其終質量濃度達到50 μg/mL，樣品繼續在暗環境下培養5 min。最后，用純水洗凈菌絲，重懸于體積分數20%甘油溶液，制片并在熒光顯微鏡下觀察。SG的熒光檢測（激發波長設置為450～490 nm，發射波長為515～565 nm）選擇FITC濾光片。CFW的熒光檢測（激發波長為395 nm，發射波長為440 nm）選擇DAPI濾光片。

1.3.4 抗菌肽Jelleine-I對P. digitatum胞外電導率影響的測定

采用微型電導儀測定抗菌肽Jelleine-I對指狀青霉胞外電導率的影響。實驗參考Zhou Haien等[26]的方法并進行一定的修改。100 μL含有1×105CFU/mL病原菌孢子加入到20 mL PDB培養基中，25 ℃、160 r/min振蕩培養48 h。4 000×g離心15 min，水洗3 次，收集菌絲體，重新懸浮于無菌水中。然后加入抗菌肽Jelleine-I溶液，使其終濃度分別為0、6.25、12.5、100 μmol/L。在處理0、0.5、1、2、3、6 h和9 h時測定胞外電導率，無菌水為對照。

1.3.5 抗菌肽Jelleine-I對P. digitatum菌絲體細胞成分釋放的影響

采用全波長酶標儀測定抗菌肽Jelleine-I對指狀青霉菌絲體胞內核酸物質釋放的影響。實驗參照Paul等[27]的方法并進行一定的修改。100 μL含有1×105CFU/mL病原菌孢子加入到20 mL PDB培養基中，25 ℃、160 r/min振蕩培養48 h。然后4 000×g離心15 min，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.0）清洗3 次，收集菌絲體，重新懸浮于PBS（pH 7.0）中。然后加入抗菌肽Jelleine-I溶液，使其終濃度分別為0、6.25、12.5、100 μmol/L。在處理0、0.5、1、2、3、6、9 h時離心取上清液測定260 nm波長處的OD值，無菌水為對照。

1.3.6 抗菌肽Jelleine-I溶血性測試

實驗參照Mu?oz等[28]的方法并進行一定的修改。將從醫院獲得的健康成人新鮮血液放入含有肝素鈉的離心管中混勻，1 000×g離心5 min，棄上清液，用0.1 mol/L PBS沖洗3 次，然后重懸于4 倍體積的PBS中即得到紅細胞懸浮液。取10 μL濃度分別為12.5、25、50、100 μmol/L的抗菌肽Jelleine-I溶液與90 μL紅細胞懸浮液混合后于37 ℃培養1 h，以0.1 mol/L PBS為陰性對照，體積分數0.1% Triton X-100為陽性對照，然后1 000×g離心5 min。轉移上清液至無菌的96 孔微量板，用酶標儀測定OD540nm。按照下式計算溶血率。

式中：OD樣、OD陰、OD陽分別表示樣品、陰性對照、陽性對照組的OD540nm。

1.4 數據統計與分析

所有實驗重復3 次。所有數據用Excel 2013軟件處理，運用Graph Pad Prism 5軟件對實驗數據進行分析并作圖；用SPSS 21.0軟件對數據進行方差分析，利用Duncan’s多重比較對差異顯著性進行分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 抗菌肽Jelleine-I對P. digitatum的離體抑菌作用

圖1 抗菌肽Jelleine-I對P. digitatum的離體抑菌作用Fig. 1 Antifungal activity of peptide Jelleine-I against P. digitatum in vitro

由圖1A可知，當抗菌肽Jelleine-I濃度高于3.12 μmol/L時，能抑制P. digitatum的生長，且濃度越高抑制作用越強。當抗菌肽Jelleine-I濃度為6.25 μmol/L時，P. digitatum的生長受到完全抑制，因此，抗菌肽Jelleine-I的MIC為6.25 μmol/L。由圖1B、C可知，抗菌肽Jelleine-I濃度越大，對P. digitatum孢子的致死作用越顯著，當抗菌肽Jelleine-I濃度達到12.5 μmol/L時，P. digitatum孢子幾乎不會存活，因此，抗菌肽Jelleine-I的MFC為12.5 μmol/L。

2.2 抗菌肽Jelleine-I對柑橘果實綠霉病的控制效果

圖2 抗菌肽Jelleine-I對柑橘采后綠霉病發病率和病斑直徑的影響Fig. 2 Effect ofJelleine-I on green mold incidence and lesion diameter of citrus fruit

如圖2所示，經同孔損傷接種P. digitatum的柑橘果實，在接種后的4～6 d內，抗菌肽Jelleine-I處理組的發病率顯著低于對照組（P＜0.05）。且在接種后的3～6 d內，抗菌肽Jelleine-I處理組的病斑直徑也顯著低于對照組（P＜0.05）。兩個不同濃度（100、12.5 μmol/L）的抗菌肽Jelleine-I處理組之間在接種后3～6 d內發病率和病斑直徑均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 抗菌肽Jelleine-I對P. digitatum菌絲體細胞膜的影響

圖3 抗菌肽Jelleine-I對P. digitatum菌絲體細胞膜的影響Fig. 3 Effect of Jelleine-I on membrane permeability of P. digitatum

如圖3所示，實驗利用熒光顯微鏡觀察抗菌肽Jelleine-I處理對P. digitatum的菌絲細胞膜通透性的影響。當細胞膜破壞后，SG熒光染色劑可以進入細胞內與核酸物質結合，并且呈現出大于未結合核酸物質時500 倍強度的綠色熒光。但當細胞膜通透性正常時，其不會進入細胞內。CFW染色劑可與真菌細胞壁成分幾丁質、纖維素特異性結合，故由于細胞壁結構變化導致的幾丁質異常積累可被觀察到。實驗結果表明，對照組P. digitatum的菌絲經SG和CFW染色后，不會出現明顯的綠色SG熒光，且藍色CFW熒光在細胞間明顯較強，表明幾丁質在細胞間積累正常。但是隨著抗菌肽Jelleine-I處理濃度的增大，綠色SG熒光強度變得越來越強。經過6.25、12.5 μmol/L的抗菌肽Jelleine-I處理后，菌絲上出現較少量不連續的綠色SG熒光，藍色CFW熒光貫穿整個菌絲，但在細胞間的藍色CFW熒光減少。當抗菌肽Jelleine-I濃度為100 μmol/L時，菌絲上出現大面積連續的綠色SG熒光，以及貫穿整個菌絲的藍色CFW熒光，但未出現細胞間的藍色CFW熒光。

2.4 抗菌肽Jelleine-I對P. digitatum菌絲體胞外電導率的影響

如圖4所示，隨著處理時間的延長，對照組和3 個不同濃度抗菌肽Jelleine-I處理組的P. digitatum菌絲體胞外電導率都逐漸增大。3 個不同濃度抗菌肽Jelleine-I處理組的胞外電導率值均顯著高于對照組（P＜0.05）。且在處理時間內，100 μmol/L的電導率顯著高于6.25 μmol/L處理組和12.5 μmol/L處理組（P＜0.05），但6.25 μmol/L處理組和12.5 μmol/L處理組之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。在處理9 h后，各組胞外電導率達到最大，對照組和6.25、12.5、100 μmol/L 抗菌肽Jelleine-I處理組胞外電導率分別為94.8、174.25、158.3、329.67 μS/cm。

圖4 抗菌肽Jelleine-I對P. digitatum菌絲體胞外電導率的影響Fig. 4 Effect of Jelleine-I treatment on extracellular conductivity of P. digitatum

2.5 抗菌肽Jelleine-I對P. digitatum菌絲體細胞成分釋放的影響

圖5 抗菌肽Jelleine-I對P. digitatum菌絲體細胞成分釋放的影響Fig. 5 Effect of Jelleine-I treatment on release of intracellular constituents from P. digitatum

P. digitatum菌絲體細胞外OD260nm能表征細胞內核酸物質的泄漏程度。如圖5所示，隨著處理時間的延長，抗菌肽Jelleine-I處理組的P. digitatum菌絲體胞外OD260nm明顯增加，且顯著高于相同處理時間的對照組（P＜0.05）。處理0.5 h時，100 μmol/L抗菌肽 Jelleine-I處理組的OD260nm為0.21，顯著高于12.5 μmol/L處理組（0.13）和6.25 μmol/L處理組（0.11）（P＜0.05）。在處理前2 h內，6.25 μmol/L處理組和12.5 μmol/L處理組之間無顯著性差異（P＞0.05），在2～9 h內，兩處理組間出現顯著性差異（P＜0.05）。

2.6 抗菌肽Jelleine-I溶血性檢測結果

本實驗中，以0.1 mol/L PBS作為陰性對照，其不會導致溶血現象；以0.1% Triton X-100作為陽性對照，其有極強的溶血性。如圖6所示，各實驗濃度抗菌肽Jelleine-I組的溶血率顯著低于0.1% Triton X-100（P＜0.05），各濃度抗菌肽Jelleine-I組之間無顯著性差異（P＞0.05）。當抗菌肽Jelleine-I濃度為12.5、25、50 μmol/L和100 μmol/L時，溶血率分別為0.33%、1.33%、3.34%和2.34%。

圖6 抗菌肽Jelleine-I的溶血性Fig. 6 Hemolytic activity of peptide Jelleine-I

3 討 論

前人研究認為，Jelleine-I對白色念珠菌（Candida albicans）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等微生物生長有抑菌作用[21-22]。本實驗研究了在離體條件下抗菌肽Jelleine-I對P. digitatum生長的抑制情況，結果發現，抗菌肽Jelleine-I能顯著抑制P. digitatum菌絲的生長，且對P. digitatum孢子有致死作用，其MIC和MFC分別為6.25、12.5 μmol/L。P. digitatum孢子易通過環境傳播，侵染柑橘果實，導致其發病[29]。在體內條件下，研究了濃度為12.5、100 μmol/L的抗菌肽Jelleine-I對P. digitatum接種柑橘果實采后綠霉病發生的控制效果，結果發現Jelleine-I能有效控制柑橘果實采后綠霉病的發生，這與其在離體條件下兩個濃度均能夠將孢子完全殺死存在一致性。但12.5、100 μmol/L 抗菌肽Jelleine-I組之間差異不顯著。

前人研究表明，抗菌肽作用于病原菌細胞時，先于細胞表面聚集，進而破壞細胞膜、壁，或者直接進入細胞內與胞內靶點物質相互作用，從而影響病原菌細胞正常生長繁殖，最終殺死病原菌[12,30-32]。本實驗通過熒光顯微鏡觀察，發現抗菌肽Jelleine-I能增加P. digitatum菌絲體細胞膜通透性，同時破壞P. digitatum細胞間隔膜，使SG進入P. digitatum細胞內，發出強烈綠色熒光，影響CFW染料在細胞間的積累，減少細胞間的藍色CFW熒光，此結果與大多數抗菌肽作用相似，如PAF56[23]、BP21[33]、Thanatin、Ponericin W1、Mastoparan-S[34]。細胞膜在維持細胞正常生命活動方面起著重要的作用[35]，當細胞膜損壞時可能會增加細胞膜通透性，引起細胞內一些離子和小分子物質泄漏[26,36-38]，最終抑制微生物的生長。為評定細胞膜及細胞質的不可逆損傷，本實驗測定了Jelleine-I處理后P. digitatum菌絲體的胞外電導率和胞內核酸物質泄漏量。結果發現，經過Jelleine-I處理的P. digitatum菌絲體的胞外電導率和胞內核酸物質泄漏量顯著增加，且100 μmol/L Jelleine-I的影響更加顯著。這也再次證明抗菌肽Jelleine-I能改變柑橘果實綠霉病病原菌P. digitatum菌絲體細胞膜的通透性，引起細胞的不可逆損傷。抗菌肽對正常哺乳動物紅細胞的溶解性是阻礙抗菌肽應用的主要障礙之一，但抗菌肽Jelleine-I具有特異性細胞溶解活性，對人血紅細胞幾乎不存在溶解性，具有潛在的應用價值。這與Fontana等[20]的研究結果一致。

4 結 論

抗菌肽Jelleine-I能通過增加P. digitatum細胞膜通透性，引起胞內物質泄漏，從而表現出對P. digitatum生長的抑制作用和致死作用；此外，抗菌肽Jelleine-I能有效控制柑橘果實綠霉病的發生。進一步研究發現，抗菌肽Jelleine-I對人血紅細胞有一定的特異性選擇作用。因此認為，抗菌肽Jelleine-I在控制柑橘果實采后綠霉病病害方面具有極大的開發應用價值。