兔皮明膠/迷迭香酸復合膜在豬肉冷藏保鮮中的應用效果

李 媛，張曉潔，馬 良，郭 婷，余 永，戴宏杰，周鴻媛，張宇昊,2,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.西南大學生物學研究中心，重慶 400715）

冷鮮肉是嚴格按照獸醫檢疫制度執行，對屠宰后的畜胴體進行冷卻處理，使其溫度（以后腿肉中心點為測量點）在24 h之內降至0～4 ℃，并一直保持在該溫度范圍內進行后續加工、運輸及銷售的生鮮肉[1]。國內冷鮮肉從生產商經冷鏈運輸至代理商、零售商進行銷售，銷售地點主要為超市和農貿市場等。冷鮮肉的包裝方式主要為真空包裝和氣調包裝兩種[2]，但目前市場上大多只是簡單的塑料薄膜包裹后或直接沒有任何包裝便置于低溫冷藏柜，導致冷鮮肉腐敗加速，貨架期縮短，無法充分滿足日常的銷售和食用。

塑料制品聚乙烯（polyethylene，PE）、聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）等是冷鮮肉包裝的常用材料，具有阻氣性良好、成本低等優點，但由于氧氣的隔絕，肉色并非鮮紅色，大大降低了消費者的接受度。近年來，活性包裝因其可以保持冷鮮肉貯藏過程中的品質、延長貨架期而成為研究熱點[3]。明膠可以直接作為涂膜劑或制成膜材料用在食品表面以防止腐敗變質，延長貨架期[4]。由明膠制成的膜具有良好的熱封性和較高的阻氣、阻油性，物化性質易于調節，可作為活性包裝膜廣泛應用于食品包裝[5]。然而，目前單一明膠膜還存在如質脆、力學性能差、易溶于水等顯著缺點[6]，無法很好地滿足實際應用的要求；因此，大量實驗研究將明膠與其他物質復合后制成復合明膠膜，極大地增強了膜性能并擴展了明膠的應用范圍[7]。Kaewprachu等[8]用含有兒茶素-溶菌酶的明膠膜和PVC分別對豬肉進行4 ℃冷藏保鮮，結果發現，含有兒茶素-溶菌酶的明膠膜包裹的豬肉具有更低的菌落總數和硫代巴比妥酸反應產物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值，并且質量損失較少。Nowzari等[9]研究了明膠/殼聚糖復合膜對冷藏虹鱒魚品質的影響，結果表明，貯藏至16 d時，對照組（未進行任何處理）的揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量已接近臨界值25 mg/100 g，而明膠/殼聚糖復合膜處理組的TVB-N含量在20 mg/100 g左右，說明明膠/殼聚糖膜的應用可以延長虹鱒魚的貨架期。兔皮明膠作為哺乳動物源明膠，其凝膠特性要優于水產明膠，是較好的明膠來源；目前對于兔皮明膠的研究主要集中在其提取、性質測定以及明膠膜的制備。于瑋等[10]用稀鹽酸短時處理提取兔皮明膠，發現兔皮明膠具有良好的凝膠特性和較高的亞氨基酸含量，相對水產明膠而言是替代哺乳動物較好的明膠來源。楊暉[11]以兔皮明膠為原料，通過分析明膠添加量和甘油濃度對明膠膜結構和性能的影響，制備兔皮明膠膜，并與豬皮明膠膜作對比，發現兔皮明膠可以代替傳統哺乳動物明膠用于生物降解膜的制備。但是，對兔皮明膠的應用研究還不夠廣泛，尤其是活性明膠膜領域的研究鮮有報道，有待進一步研究。

迷迭香酸（rosmarinic acid，RosA）是一種天然的水溶性酚類物質，具有很多生物活性，如抗氧化[12]、抑菌[13]、抗炎[14]、抗過敏[15]等，目前，RosA在食品上的應用研究主要集中于將其直接加入肉類制品和油脂中以延緩脂肪氧化和酸敗。高輝等[16]將RosA加入火腿腸中，常溫下測定過氧化值（peroxide value，POV）和TBARS值，結果發現，含有RosA的處理組與對照組（未進行任何處理）相比具有更低的POV和TBARS值，這說明RosA可以較好地延緩火腿腸的脂質過氧化。謝芳芳[17]將不同質量濃度的RosA與合成抗氧化劑二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）加入菜籽油中作對比，結果發現，0.4 g/L的RosA比0.2 g/L BHT具有更好的抗氧化效果。此外，也有實驗將迷迭香提取物加入金槍魚皮明膠中制備活性明膠膜，發現迷迭香提取物可以提高明膠膜的水阻隔性和抗氧化活性[18-19]。但是對于添加RosA的明膠膜在肉類保鮮中的應用鮮見報道。

本實驗采用不同質量濃度（0、0.3、0.5、0.8 g/L）RosA制備兔皮明膠/RosA復合膜，通過測定pH值、菌落總數、TVB-N含量、TBARS值、硬度和色差等指標，探究兔皮明膠/RosA復合膜、PE/兔皮明膠/RosA復合包裝膜對新鮮豬肉冷藏保鮮效果的影響，以期為后續明膠/RosA復合膜在冷鮮肉貯藏中的應用提供理論依據，并為制備一種天然抗氧化的活性包裝材料提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

兔皮購于重慶阿興記食品有限公司，原料獲取后洗凈凍藏于-20 ℃冰箱中備用；豬前腿肉購于重慶市北碚區永輝超市。

二甲基硅油、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、硅藻土、可溶性淀粉 成都市科龍化工試劑廠；甘油（純度＞99%）、酚酞 生工生物工程（上海）有限公司；RosA（純度97%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；平板計數瓊脂（plate count agar，PCA） 杭州微生物試劑有限公司；2-硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA） 上海科豐實業有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

JA3003B型電子天平 上海精天電子儀器有限公司；CJ-78-1型磁力攪拌器 上海將任實驗設備有限公司；PE20型實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DGG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；HH-4J型磁力攪拌恒溫水浴 江蘇金壇白塔新寶儀器廠；TA.XT2i物性測定儀 英國Stable Micro Systems公司；Ultra Scan PRO色差儀 美國Hunter Lab公司；SW-OJ-IFD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；Heraeus Multifuge X3R型離心機 美國賽默飛世爾科技公司；UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；YLD-2000型恒溫培養箱 上海亞泰儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 兔皮明膠的制備

兔皮明膠的提取主要參照楊暉等[20]的方法，工藝如下：新鮮兔皮→除去皮下脂肪→脫毛→清洗、剪切→除雜蛋白→清洗→稀酸（質量分數1%鹽酸）處理→提膠→過濾（用1.6 μm孔徑的濾膜真空過濾）→熱風干燥→成品明膠。

1.3.2 兔皮明膠/RosA復合膜的制備

稱取4 g明膠溶于蒸餾水，以明膠的質量加入25%的甘油（增塑劑），室溫下溶脹2 h。然后60 ℃水浴加熱，將RosA溶于蒸餾水并加入到明膠溶液中，使明膠最終質量濃度為0.4 g/L，RosA最終質量濃度依次為0、0.3、0.5、0.8 g/L，攪拌使明膠與RosA形成均勻的液體。40 kHz、40 W超聲處理10 min制得成膜液，取30 mL均勻地鋪在130 mm×130 mm的塑料培養皿中，并在（45±1）℃的烘箱中干燥24 h，后將膜揭下并置于含有變色硅膠的干燥盤中干燥48 h，待測。

1.3.3 豬肉樣品的制備

將超市購買的新鮮豬前腿肉分割成50 g左右的肉塊，分別用兔皮明膠膜、兔皮明膠/RosA復合膜、PE包裝袋、PE/兔皮明膠/RosA復合膜（明膠/RosA復合膜作為內膜包裹在豬肉表面，外層再用PE包裝袋真空塑封）包裝，未進行任何包裝的樣品作為對照組。樣品在4 ℃冰箱中冷藏12 d，每隔2 d抽取樣品并進行指標測定。

1.3.4 pH值的測定

參考GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》中肉及肉制品pH值的測定方法。取10 g豬肉樣品，加入100 mL 0.1 mol/L氯化鉀溶液，均質后測其pH值。

1.3.5 菌落總數的測定

菌落總數根據GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 菌落總數測定》進行測定。取5 g豬肉樣品，切碎（工具消毒），加入45 mL滅菌生理鹽水均質2 min，然后10 倍遞增進行梯度（10-1～10-6）稀釋，選擇適宜濃度的稀釋液注入PCA平板，于（36±1）℃下培養（48±2）h，每個稀釋度做3 個平行。

1.3.6 TVB-N含量的測定

TVB-N含量的測定采用GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》中的半微量定氮法。

1.3.7 TBARS值的測定

TBARS值的測定參照王超[21]的方法，取5 g豬肉樣品，加入25 mL、體積分數20%的三氯乙酸溶液，再加入20 mL蒸餾水均質1 min，靜置1 h后3 000×g離心10 min，過濾并用蒸餾水定容至50 mL。取2 mL濾液加入2 mL 0.02 mol/L TBA溶液在沸水浴反應20 min后用流動水冷卻5 min，于532 nm波長處測定吸光度。1 mL體積分數20%三氯乙酸溶液、1 mL蒸餾水、2 mL 0.02 mol/L TBA溶液混合作為空白組。

1.3.8 質構分析

采用質構剖面（texture profile analysis，TPA）法進行質構分析，參數設置：探頭型號TA5，測試前速率2 mm/s，測試速率1 mm/s，返回速率1 mm/s，測試距離4 mm，觸發力5 g，間隔時間5 s。室溫測量，主要分析硬度的變化。

1.3.9 色差的測定

使用Ultra Scan PRO色差儀對新鮮豬肉的L*（亮度）和a*（紅綠）值進行測定，以白板作為色差測定的參比。

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 17.0軟件進行數據處理，數據以平均值±標準差表示，采用方差分析法進行顯著性分析，利用Origin 8.6軟件作圖，每次實驗設置3 個平行。

2 結果與分析

2.1 不同膜處理對豬肉冷藏過程中pH值的影響

圖1 豬肉在冷藏過程中pH值的變化Fig. 1 Changes in pH of pork during refrigerated storage

圖1 為不同包裝方式下豬肉冷藏過程中pH值的變化，所有處理組的pH值均先下降后上升。貯藏的前2 d，pH值降低，這是新鮮豬肉在成熟過程中的糖酵解作用使得乳酸在肌肉中積累導致，此后，在內源蛋白酶和微生物作用下，蛋白質發生降解導致pH值逐漸上升[22]。與對照組、明膠膜和PE包裝袋組相比，含有RosA復合膜包裝的豬肉pH值上升速度都相對緩慢，且pH值隨著RosA質量濃度的增加而降低，這可能是因為RosA具有抑菌作用，可以延緩微生物的生長，進而抑制了樣品pH值的升高，質量濃度越高，抑菌效果越強。李榮貴等[23]研究發現，RosA對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等都具有明顯的抑菌效果。Lara等[24]研究表明，含有RosA的檸檬香蜂草提取物可以降低豬肉餅的pH值，這可能是因為RosA是一種含多酚羥基的酸，其pH值為4.25±0.02。此外，與PE包裝袋相比，PE/明膠膜包裹的豬肉pH值上升速率也較緩慢，這可能是因為明膠膜具有吸水性，作為內膜可以吸收并鎖住豬肉內部滲出的水分，減少因汁液溢出而導致的微生物生長加速。

2.2 不同膜處理對豬肉冷藏過程中菌落總數的影響

在鮮肉冷藏過程中，腐敗微生物的生長會影響肉制品的品質，縮短其貨架期，GB/T 9959.2—2008《分割鮮、凍豬瘦肉》中規定，菌落總數限量應不超過6（lg（CFU/g））。圖2為菌落總數在豬肉冷藏過程中的變化情況，初始菌落總數為4.78（lg（CFU/g）），對照組在第6天時菌落總數為6.21（lg（CFU/g）），超過了GB/T 9959.2—2008的限量標準，為腐敗肉；0.3 g/L RosA明膠膜包裹的豬肉在第6天時為5.84（lg（CFU/g）），0.8 g/L RosA明膠膜在第8 天時為5.93（lg（CFU/g）），與對照組相比，貨架期分別延長了約1、2 d，這表明隨著RosA質量濃度的增加，復合膜的抑菌效應也逐漸增強，與pH值變化分析一致。孫峋等[25]研究表明，RosA可以較好地抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等常見食品污染菌的生長。單純PE包裝膜包裹和PE/0.8 g/L RosA明膠膜包裹的豬肉分別在第8、10天時菌落總數超過6（lg（CFU/g）），與對照組相比，貨架期分別延長了2、4 d。總地來說，PE/RosA明膠膜的組合包裝方式對于延緩豬肉腐敗有明顯效果。一方面，PE包裝袋作為外層包裝，可以較好地隔絕內部明膠膜與外界水分、CO2和微生物等的接觸；另一方面，含有RosA的明膠膜可以吸收豬肉浸出的汁液，并在豬肉表面緩慢釋放RosA，RosA具有一定的抑菌作用，可以降低由微生物引起的蛋白質分解速率，使豬肉保持良好品質。

圖2 豬肉在冷藏過程中菌落總數的變化Fig. 2 Changes in total bacterial count in pork during refrigerated storage

2.3 不同膜處理對豬肉冷藏過程中TVB-N含量的影響

根據GB 2707—2016《食品安全國家標準 鮮（凍）畜、禽產品》規定，鮮畜、禽產品的TVB-N含量不超過15 mg/100 g。圖3為不同包裝方式下豬肉在冷藏過程中TVB-N含量的變化情況，隨著冷藏時間的延長，所有處理組的TVB-N含量均呈上升趨勢。第4天時，對照組和單純明膠膜組的TVB-N含量分別為15.62、15.04 mg/100 g，超過標準；PE包裝袋包裹豬肉在第6天時的TVB-N含量為15.21 mg/100 g，超過標準，這一結果表明，PE包裝袋具有比單純明膠膜更好的效果，這是由于明膠膜的阻隔性能略低于PE包裝袋；第8天時，0.8 g/L RosA明膠膜組的TVB-N含量為16.54 mg/100 g，超過標準，與單純明膠膜組相比，RosA的加入可以有效延緩豬肉TVB-N含量的上升，延長豬肉的貯藏期；此外，與0.8 g/L RosA明膠膜相比，PE/0.8 g/L RosA明膠膜包裹的豬肉在第10天時TVB-N含量為15.47 mg/100 g，具有更好的貯藏效果。

綜合豬肉冷藏過程中菌落總數和TVB-N含量的變化，得到各處理組的貨架期分別為：對照組4 d，單純明膠膜組4 d，0.3 g/L RosA明膠膜組7 d，0.8 g/L RosA明膠膜組8 d，單純PE包裝膜組6 d，PE/明膠膜組7 d，PE/0.3 g/L RosA明膠膜組8 d，PE/0.8 g/L RosA明膠膜組10 d。

圖3 豬肉在冷藏過程中TVB-N含量的變化Fig. 3 Changes in TVB-N content of pork during refrigerated storage

2.4 不同膜處理對豬肉冷藏過程中TBARS值的影響

不同包裝方式下TBARS值在豬肉冷藏期間的變化如圖4所示，隨著冷藏時間的延長，所有處理組的TBARS值均呈上升趨勢，與對照組相比，其他處理組的TBARS值都相對較低。冷藏初期豬肉的TBARS值為0.20 mg/kg，冷藏至12 d時，對照組、單純明膠組、單純PE包裝組的TBARS值分別上升至1.70、0.97、0.68 mg/kg，與明膠膜相比，PE具有更好的貯藏效果，這是因為PE包裝袋具有比明膠膜更好的阻隔氧氣的作用；同時，0.8 g/L RosA明膠膜、PE/0.8 g/L RosA明膠膜組的TBARS值分別為0.46、0.33 mg/kg，含有RosA的包裝膜包裹的豬肉TBARS值增長幅度普遍較小，這是因為RosA可以通過捕獲過氧自由基來抑制過氧化鏈式反應的進行，阻斷自由基鏈的傳遞和增長，從而延緩了脂肪氧化進程。與該研究結果相類似，Kaewprachu等[8]將含有兒茶素-溶菌酶的明膠膜（catechin-lysozyme incorporated gelatin film，CLGF）與PVC分別覆蓋在盛有豬肉的托盤上，于4 ℃貯藏7 d，結果發現，CLGF覆蓋的豬肉的TBARS值顯著小于PVC組，這是因為兒茶素是一種有效的金屬螯合劑和自由基清除劑，具有很強的抗氧化性，可以抑制脂肪氧化。

圖4 豬肉在冷藏過程中TBARS值的變化Fig. 4 Changes in thiobarbituric acid reactive substances value of pork during refrigerated storage

2.5 不同膜處理對豬肉冷藏過程中硬度的影響

表1 豬肉在冷藏過程中硬度的變化Table 1 Changes in hardness of pork during refrigerated storage

豬肉在冷藏過程中硬度的變化如表1所示，在0～2 d內，所有處理組的豬肉硬度呈上升趨勢，這是因為豬被宰殺后，豬胴體進入尸僵狀態，肌肉收縮變硬而失去彈性，所以硬度升高。在2～4 d內，各處理組的硬度逐漸下降，這是因為在肌肉組織中酶及微生物的作用下，骨架蛋白以及肌原蛋白被分解，使得肌原纖維斷裂，包圍在肌原纖維周圍的網絡結構變得疏松，從而導致肌肉質地軟化，硬度下降。4 d之后，所有含PE膜的處理組硬度持續下降，而對照組、明膠膜、0.3 g/L和0.8 g/L RosA明膠膜實驗組上升，這是因為PE膜具有良好的密封性，可以防止豬肉失水，而明膠膜具有一定的水蒸氣透過率，可與外界形成相對流通的環境，導致豬肉失水，使得硬度升高。當冷藏至第10天時，由于不含PE膜的豬肉水分損失嚴重，測得的硬度不再具有實際參考價值。貯藏至后期時，與單純PE膜處理組相比，PE/RosA處理組隨著RosA質量濃度的增加，硬度下降速率愈加緩慢，這可能是因為復合膜在水分子的作用下逐漸溶脹，膜中RosA緩慢遷移釋放，因RosA具有一定的抗氧化和抗菌作用，從而有效延緩了豬肉硬度的下降。

2.6 不同膜處理對豬肉冷藏過程中色差的影響

豬肉在冷藏過程中L*值的變化如表2所示。L*值越大，亮度越大。隨著冷藏時間的延長，所有處理組的L*值都有所下降，但是含有PE包裝組的L*值整體高于對照組和對應的明膠膜處理組，這可能是由于冷藏過程中豬肉內部水分滲出，而明膠膜具有一定的水蒸氣透過率，水分滲出后逐漸散發，相反，PE包裝袋具有很好的密封性，滲出的水分會積于肉的表面，增強對光的反射能力，故表現為較高的L*值。

表2 豬肉在冷藏過程中色差L*值的變化Table 2 Changes in CIE L* value of pork during refrigerated storage

表3列出了豬肉在冷藏過程中a*值的變化。肌紅蛋白的含量是影響豬肉肉色的主要因素，也直接影響著消費者的可接受度[26]。隨著冷藏時間的延長，肌紅蛋白與氧氣的結合程度以及還原型、氧合型和高鐵型肌紅蛋白之間的構成比例對豬肉的色澤有重要影響。在冷藏過程中，所有處理組的a*值均先上升后下降，這與肌紅蛋白受氧氣氧化作用而生成氧合肌紅蛋白，然后進一步氧化成為高鐵肌紅蛋白，肉色由紅色變為鮮紅色然后再轉變為暗褐色有關。4 d后a*值逐漸降低，其中對照組下降速率最快，由10.34±0.75降低為2.84±1.12，與明膠膜、RosA明膠膜處理組相比，相應PE/明膠膜、PE/RosA明膠膜組的a*值雖然也逐漸下降，但是都保持有較高的a*值，這是因為外層用PE真空包裝時，隔絕了大部分氧氣；且與單獨明膠膜組相比，含RosA的明膠膜組具有更高的a*值，是因為RosA在豬肉表面緩慢滲透釋放，延緩了豬肉氧化，對豬肉色澤具有很好的保護作用。Kroll等[27]研究發現，酚類物質可以與肌紅蛋白直接反應，延緩肌紅蛋白的氧化和變色。陽暉[28]將仙草膠加入明膠中制得仙草膠/明膠膜，包裹在豬肉表面，于4 ℃下貯藏12 d，結果發現含有仙草膠的處理組具有更高的a*值，這是因為仙草膠具有抗氧化和抑菌作用，可以延緩氧化，延長肉色保持時間。

表3 豬肉在冷藏過程中色差a*值的變化Table 3 Changes in CIE a* value of pork during refrigerated storage

圖5為不同包裝方式包裝的新鮮豬肉在貯藏期間的外觀色澤變化，觀察發現，對照組及單獨明膠膜包裝的豬肉顏色從開始的鮮紅色逐漸轉變為暗褐色。單獨PE膜包裝的豬肉初始為鮮紅色，隨著貯藏時間的延長，豬肉表面泛白，肉色不新鮮。以含RosA的明膠膜為內包、PE為外包的復合膜包裝的豬肉在整個貯藏期間都保持著較好的色澤，這是因為內層為含有RosA的明膠膜時，一方面明膠膜中含有部分氧氣，可使肌紅蛋白氧化為氧合肌紅蛋白而呈現鮮紅色；另一方面，明膠膜可以鎖住豬肉滲出的汁液，同時RosA在豬肉表面緩慢滲透釋放，延緩豬肉進一步氧化，對豬肉色澤具有很好的保護作用。而外層用PE真空包裝時，隔絕了大部分氧氣，減少了因氧合肌紅蛋白受氧氣氧化作用生成高鐵肌紅蛋白而導致的肉色由鮮紅色轉變為暗褐色。由此說明PE/RosA明膠膜可以作為一種有效的活性包裝材料用于冷鮮肉的貯藏保鮮。

圖5 豬肉冷藏期間的色澤Fig. 5 Visual observation of color changes in pork during refrigerated storage

3 結 論

由于RosA具有抗菌和抗氧化作用，可通過向豬肉中滲透活性成分從而有效延緩微生物的生長和pH值的上升，并一定程度地抑制脂肪氧化；與對照組相比，0.8 g/L RosA明膠膜和PE/0.8 g/L RosA明膠膜處理均有效抑制了菌落總數和TVB-N含量的增加，貨架期分別延長4 d和6 d左右；貯藏至末期時，PE/RosA明膠膜處理組包裝的豬肉有較高的硬度、L*值和a*值，具有相對較好的品質，即當外層用PE包裝袋密封時，冷藏效果更佳。因此，RosA的加入可以延緩豬肉腐敗變質，從而延長貨架期，同時PE/RosA明膠膜可以作為一種有效的活性包裝材料，用于冷鮮肉的貯藏保鮮。