PHC患者血清mir-355的表達水平變化及與腫瘤病理學特征的相關性

王曉，馬慧，張衛衛

(洛陽市中心醫院肝膽一區，河南 洛陽 471001)

原發性肝癌(primary liver cancer，PHC)的發生率具有顯著的上升趨勢，流行病學研究證實，PHC的年平均發病率可達283～459/10萬人左右[1]。臨床上PHC的發生能夠導致患者總體生存時間的下降，影響患者的5年生存率等預后指標[2]。

在探討PHC發病機制的過程中可以發現微小RNA水平的改變，能夠通過影響肝臟上皮細胞的生物學特征，進而參與到早期PHC的發生過程中。微小RNA-355(mir-355)是微小RNA家族的重要成員，mir-355的表達濃度的維持能夠有效穩定癌細胞的增殖速度，抑制癌細胞對于血管內皮細胞的粘附和侵襲過程[3]。同時mir-355的表達，還能夠提高癌細胞的分化成熟能力，降低癌細胞的低分化或者中低分化的風險[4]。部分研究者探討了mir-355在胃癌或者結直腸癌患者中的表達情況，認為mir-355的表達下降能夠顯著促進胃癌等惡性腫瘤的發生[5]。為了深入揭示mir-355的表達與PHC的關系，從而為臨床上PHC患者的診療提供理論基礎，本次研究取我院2015年1月至2016年12月經病理學明確診斷的90例PHC患者，探討了mir-355的表達及其與患者臨床病理特征的關系，報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇我院2015年1月至2016年12月經病理學明確診斷的90例PHC患者(PHC組)、慢性乙肝后肝硬化患者90例(對照組(、90例健康體檢志愿者(健康組)。PHC組，年齡44～79歲，平均為60.5±11.5歲，男52例、女38例，其中腫瘤單發66例、多發24例，病灶直徑＞5cm 49例、≤5cm 41例，分化程度：高分化22例、中分化38例、低分化30例；TNM分期：Ⅰ期20例、Ⅱ期35例、Ⅲ期30例、Ⅳ期5例。對照組，年齡39～76歲，平均為58.0±10.5歲，男49例、女41例。健康組，年齡 41～79歲，平均為 57.5±13.2歲，男 47例、女 43例。三組研究對象的年齡、性別比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。納入標準：(1)PHC患者的診斷標準參考《原發性肝癌診療規范2015年版》、慢性乙肝或慢性乙肝后肝硬化患者的診斷標準參考 《內科學》人民衛生出版社中的標準；(2)PHC的確診以病理學結果作為金標準；(3)本研究獲得醫學倫理委員會的批準。排除標準：(1)重度營養不良；(2)具有放化療病史；(3)精神疾病患者；(4)免疫疾病；(5)類風濕性關節炎疾病。

1.2 指標檢測方法 mir-355的檢測：采集患者空腹血5ml，加入0.2ml的氯仿，2℃～8℃ 冰凍離心機中離心(12000g/min，15min)，反復一次洗滌 RNA，棄上清，在管底部可見一乳白色小沉淀物，加入 1 ml75%乙醇，0.1%DEPC水溶解。加入GAPDH上下游引物、0.1%DEPC使其終濃度均為 20pmol/ul，制備反應體系，RT-PCR擴增的條件與參數：48℃，45min，94℃，2min； 94℃ 30s，58℃ 60s，68℃ 2 min共40個循環；循環完畢后68℃延伸7min。

2 結果

2.1 三組研究對象血清mir-355水平比較 PHC組、對照組的血清中mir-355水平顯著低于健康組(P＜0.05)，PHC組的血清中mir-355水平顯著低于對照組(P＜0.05)；見表 1，圖 1。

表1 三組研究對象血清mir-355水平比較()

表1 三組研究對象血清mir-355水平比較()

組別 n mir-355（2-△△ct） F 值 P 值PHC組對照組健康組90 90 90 1.14±0.40 1.69±0.50 2.26±0.59 27.594 0.000

圖1 血清mir-355水平擴增電泳圖

2.2 不同病理學特征的PHC患者血清mir-355水平比較 病灶多發、病灶直徑≥5cm、發生脈管侵犯、低分化、TNM分期(Ⅲ期+Ⅳ期)的PHC患者血清mir-355水平低于病灶單發、病灶直徑＜5cm、未發生脈管侵犯、高中分化、TNM分期(Ⅰ期+Ⅱ期(的PHC患者(P＜0.05)；不同AFP水平PHC患者的血清mir-355水平差異無統計學意義(P＞0.05)；見表2。

表2 不同病理學特征的PHC患者血清mir-355水平比較()

表2 不同病理學特征的PHC患者血清mir-355水平比較()

因素 n mir-355(2-△△ct) t值 P值AFP(μg/L)≥20＜20病灶數目單發多發病灶直徑(cm)≥5＜5脈管侵犯是 否分化程度高+中低分化TNM分期Ⅰ期+Ⅱ期Ⅲ期+Ⅳ期62 28 66 24 49 41 38 52 60 30 55 35 1.10±0.34 1.24±0.37 1.26±0.38 0.81±0.26 0.91±0.39 1.35±0.33 0.83±0.27 1.31±0.38 1.20±0.38 1.01±0.35 1.33±0.35 0.86±0.37-1.759 5.354-5.712-6.651 2.294 6.074 0.082 0.000 0.000 0.000 0.024 0.000

3 討論

PHC的病情進展相對較為隱匿，雖然早期可表現為惡心嘔吐等臨床癥狀，但疾病總體的早期診斷水平較低[6]。同時PHC的手術治療或者放化療治療后，患者的病死率或者生存時間等指標均無明顯改善[7,8]。一項包含了334例樣本量的多中心PHC臨床研究顯示，PHC的早期診斷水平不足55%，治療后的病情緩解率不足40%，無瘤生存時間不足48個月[9]。本次研究通過對于相關分子生物學水平的相關研究，不僅能夠為揭示PHC的發病機制提供參考，同時可以對于疾病的診斷提供潛在的臨床指標。

微小RNA在惡性腫瘤的發生過程中發揮了重要的作用，其能夠參與到腫瘤細胞的代謝、細胞周期調控及細胞凋亡等過程中。mir-355水平的改變對于腫瘤信號通路的抑制，能夠減少癌細胞轉錄調控因子的激活，降低癌細胞DNA的擴增速度。mir-355能夠促進癌細胞膜表面糖蛋白配體的沉默，降低細胞周期調控依賴性蛋白激活的轉錄水平，穩定G1/S期比例，降低G1期細胞的總數[10]。近年來相關基礎方面的研究顯示，mir-355其表達濃度的改變能夠通過穩定上皮細胞的極性，抑制癌細胞上皮-間質轉化過程，從而降低了癌細胞的擴散風險[11]。部分研究者以及探討了mir-355的表達與直腸癌或者結腸癌的關系，認為mir-355的表達缺失是導致惡性腫瘤放化療治療敏感性下降的重要因素[12]。雖然有部分研究者探討了mir-355在PHC患者中的表達情況，但相關研究僅限于流行病學研究的探討，未深入探討mir-355的表達與PHC患者臨床病理特征和甲胎蛋白(AFP)的關系。

對于mir-355的表達分析研究發現，mir-355在肝癌或者肝硬化患者中的表達濃度均明顯的下降，低于正常對照組人群，差異較為明顯，特別是在PHC組患者中，mir-355的表達下降更為明顯，提示了mir-355的表達下降能夠影響PHC的發生過程。通過匯集不同的相關文獻，筆者認為這主要考慮與mir-355的下列幾個方面的作用有關[13]：(1)mir-355的表達下降能夠導致肝臟癌細胞變形能力的上升，癌細胞對于臨近正常肝臟小葉組織的浸潤能力明顯的增強；(2)mir-355的表達下降導致癌細胞周期調控的異常，癌細胞快速跨越G0期的能力明顯增加。余斌等[14]研究者也發現，在PHC患者中，mir-355的表達濃度可平均下降35%以上，特別是在合并有明顯的高腫瘤負荷表現或者遠期病死率較高的患者中，mir-355的表達濃度的下降更為明顯。對于mir-355的表達與PHC患者臨床病理特征的分析研究可見，發生了脈管浸潤、癌細胞分化程度較差或者臨床分期較晚的患者中，mir-355的表達濃度可顯著的下降，提示了mir-355的表達與PHC患者的臨床病理特征具有密切關系，這主要由于mir-355的表達下降能夠影響到癌細胞的分化成熟過程，導致癌細胞對于腹腔內臨近臟器組織損傷風險的增加；在腫瘤直徑較大或者多發性的腫瘤患者中，mir-355的表達濃度明顯的下降，mir-355與PHC患者一般性臨床資料特征的關系，考慮與mir-355的表達缺失能夠影響到癌細胞的增殖過程，從而促進腫瘤體積的增大[15]。AFP是PHC相對特異性的腫瘤指標，AFP的上升對于PHC的診斷和治療預后的評估均具有重要的意義，本次研究并未發現AFP的表達水平與mir-355的關系，提示mir-355的表達缺失并不能影響到癌細胞對于AFP的釋放，但部分研究者認為在AFP較高的患者中，mir-355的表達濃度可進一步的下降，本次研究并未相關結論，考慮可能與PHC患者的基礎性病情差別較大或者AFP的檢測時機的不同有關。