簡易方法檢測O型婦女IgG型抗A(B)抗體效價的臨床應(yīng)用價值研究

李小燕 ，王小中 ，曾選 ，姜玉環(huán)

(1南昌大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江西 南昌330006；2、江西省婦幼保健院輸血科 江西 南昌330006)

新生兒溶血病 (haemolytic disease of the newborn and fetus，HDFN)是指母親和胎兒血型不合導(dǎo)致的胎兒或新生兒的一種免疫性溶血性疾病。胎兒的紅細(xì)胞抗原源自于父親和母親，如果從父親遺傳的那部分紅細(xì)胞抗原是母親所缺少的，那么胎兒的紅細(xì)胞對于母親來說就是一種異抗原，當(dāng)它通過胎盤進(jìn)入母體的血液循環(huán)時，可刺激母體產(chǎn)生免疫性抗體。此抗體經(jīng)胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，與胎兒紅細(xì)胞上相應(yīng)的抗原結(jié)合，使紅細(xì)胞溶解破壞進(jìn)而出現(xiàn)新生兒黃疸、貧血、水腫、肝脾腫大，甚至死胎、新生兒死亡等溶血病的癥狀和合并癥[3-4]。我國大部分HDN是由ABO血型不合引起，輕者導(dǎo)致新生兒黃疸、貧血、水腫、肝脾腫大，嚴(yán)重者導(dǎo)致核黃疸以及病死。O型孕婦血清中的IgG型抗-A(B)抗體分子量小，可以經(jīng)過胎盤對含有相應(yīng)抗原的胎兒血液進(jìn)行攻擊，導(dǎo)致溶血。O型孕婦血清中IgG型抗-A(B)抗體效價或滴度越高，胎兒發(fā)生新生兒 ABO 溶血癥的概率越大[1，4，9]。 檢測孕婦的 IgG抗A(B)抗體效價可以協(xié)助臨床預(yù)測胎兒或新生兒HDFN的發(fā)生，以及O型婦女反復(fù)流產(chǎn)的原因分析。本研究采用一種簡易的方法和傳統(tǒng)經(jīng)典抗人球蛋白法平行檢測O型婦女血清中的IgG抗A(B)效價，分析兩種檢測結(jié)果的差異，探討簡易方法在O型孕婦或O型反復(fù)不良孕產(chǎn)史婦女產(chǎn)前檢查IgG抗體效價的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2018年5月-2018年12月在本院門診或住院做產(chǎn)前或孕前檢查的O型婦女，其丈夫均為非O型，做孕前檢查的包括有反復(fù)流產(chǎn)史的婦女流產(chǎn)原因檢查。年齡在16～45歲。身體健康，無肝腎及血液系統(tǒng)疾病，不規(guī)則抗體陰性。送檢抗A效價103例，送檢抗B效價105例，送檢抗A/B效價69例。用簡易方法和傳統(tǒng)經(jīng)典抗人球蛋白法平行檢測共346個抗A(B)效價，其中抗A共172例，抗B共174例。

1.2 方法

1.2.1 儀器和試劑 離心機(jī) (日本久保田KA-2200)，水浴箱 (上海精宏醫(yī)療器械DK-BB)，0.2mol/L2-Me、2%～5%標(biāo)準(zhǔn)A、B型紅細(xì)胞懸液、抗人球蛋白試劑(上海血液生物醫(yī)藥有限公司)

1.2.2 標(biāo)本預(yù)處理 取200ul婦女血清標(biāo)本和200ul0.2mol/L2-Me應(yīng)用液充分混勻，試管加塞置37℃水浴箱溫浴 15～30min[2-3]。

1.2.3 簡易方法 取一支試管，標(biāo)記，取100ul處理好的血清及50ul2%～5%標(biāo)準(zhǔn)A(B)細(xì)胞加入試管，混勻，置37℃水浴箱溫浴60min后不離心輕搖試管肉眼觀察紅細(xì)胞凝集情況，依據(jù)凝集強(qiáng)度判斷相應(yīng)效價。具體強(qiáng)度及相應(yīng)效價判斷方法如下：

無凝集紅細(xì)胞，即細(xì)胞呈細(xì)沙狀無凝集顆粒：判斷效價≤32

紅細(xì)胞有+-強(qiáng)度凝集，即有肉眼可見的細(xì)小凝集顆粒，底液渾濁：判斷效價64

紅細(xì)胞有1+強(qiáng)度凝集，即有較粗凝集顆粒，底液渾濁：判斷效價128

紅細(xì)胞有2+強(qiáng)度凝集，即有較粗凝集顆粒，且底液清亮：判斷效價256

紅細(xì)胞有3+強(qiáng)度凝集，即凝集顆粒大塊，帶有少許小塊，底液清亮：判斷效價512

紅細(xì)胞有4+強(qiáng)度凝集，即凝集顆粒為整塊，底液清亮：判斷效價≥1024

1.2.4 傳統(tǒng)經(jīng)典抗人球蛋白法 取十支試管標(biāo)記，從第 2 管(1：4)至第 10 管(1：1024)每管加 200μl生理鹽水，陰性對照管加100μl生理鹽水。向倍比稀釋管中加入200μl處理后的血清做倍比稀釋。取每個稀釋度的待檢血清100μl，加入50μl2%～5%標(biāo)準(zhǔn) A(B)細(xì)胞，900～1000g 離心 15s，觀察 IgM 是否中和徹底，將鹽水介質(zhì)不出現(xiàn)凝集的管，重新輕搖混勻后做間接抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)。具體細(xì)節(jié)參考文獻(xiàn)[2-3]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 簡易法與傳統(tǒng)經(jīng)典抗人球蛋白法檢測結(jié)果取稀釋倍數(shù)為數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)用SPSS22.0軟件分析。兩種方法陽性檢出率比較采用四格表配對資料χ2檢驗(yàn)驗(yàn)證，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，同時做直線相關(guān)與直線回歸分析并建立回歸方程。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法平行檢測IgG抗A(B)效價結(jié)果比較簡易法和傳統(tǒng)經(jīng)典抗人球蛋白法平行檢測172例IgG抗A效價，結(jié)果完全一致113例，概率為65.70%(113/172)，相差一個稀釋度46例，概率為26.74%(46/172)，相差一個稀釋度以內(nèi)概率為92.44%，相差兩個及以上稀釋度13例，概率為7.56%(13/172)。平行檢測抗B效價174例，結(jié)果完全一致115例，概率為66.09%(115/174)，相差一個稀釋度44例，概率為25.29%(44/1742)，相差一個稀釋度以內(nèi)概率為91.38%，相差兩個及以上稀釋度15例，概率為8.62%(15/174)。見表1。

2.2 兩種方法平行檢測IgG抗A(B)效價 以IgG抗A(B)抗體效價≥64為陽性值判斷，簡易法和傳統(tǒng)經(jīng)典抗人球蛋白法檢測IgG抗A抗體效價的陽性率分別為 62.79%(108/172)，66.86%(115/172).兩種方法陽性率用卡方檢驗(yàn)，(χ2=2.0,P＞0.05)無統(tǒng)計學(xué)意義,兩種方法檢測結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異。抗B抗體效價的陽性率分別為47.12%(82/174)，62.07%(108/174).兩種方法陽性率用卡方檢驗(yàn)，(χ2=2.0,P＞0.05)，無統(tǒng)計學(xué)意義，兩種方法檢測結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異。見表2。

表1 兩種方法平行檢測IgG抗A(B)效價結(jié)果比較

表2 以效價≥64為陽性，兩種方法檢測抗A(B)效價的陽性檢出率

2.3 兩種方法相關(guān)性分析 效價前后相差一管被認(rèn)為可以接受值[2]，兩種方法檢測抗A相關(guān)性分析結(jié)果：兩種方法檢測結(jié)果具有相關(guān)性 (r=0.93，P＜0.01)，回歸方程為Y=0.964X+0.05，檢測抗 B相關(guān)性分析結(jié)果：兩種方法檢測結(jié)果具有相關(guān)性 (r=0.91，P＜0.01)，回歸方程為 Y=0.918X-0.015。 見表3。

表3 兩種方法平行檢測IgG抗A(B)效價

3 討論

新生兒溶血病(HDN)以AB0和Rh系統(tǒng)最為常見。新生兒溶血病是導(dǎo)致新生兒黃疸、貧血、水腫、肝脾腫大的重要因素[8]，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死胎、新生兒死亡。ABO不和的妊娠比例為20%～25%，其中發(fā)病的占10%。ABO HDN多見為0型母親所生的A型或B型胎兒，第1胎即可發(fā)病[1]。自20世紀(jì)以來測定IgG抗-A(B)抗體效價的方法國內(nèi)外推薦的方法為經(jīng)典抗人球蛋白法[3-4]。經(jīng)典抗人球蛋白法檢測步驟比較繁瑣，耗時。目前國內(nèi)外均生產(chǎn)出微柱凝膠卡以及凝聚胺試劑盒，也在國內(nèi)取得了檢測認(rèn)可。目前國內(nèi)檢測IgG抗-A(B)抗體效價的方法有經(jīng)典抗人球蛋白法、微柱凝膠法、凝聚胺法。這些方法各有特點(diǎn)，經(jīng)典抗人球蛋白法一直被視為標(biāo)準(zhǔn)方法，其特點(diǎn)是過多的洗滌步驟，較長的孵育時間，使得該方法較繁瑣、費(fèi)時，且難以自動化和標(biāo)準(zhǔn)化以及對檢測人員的操作手法要求較高。微柱凝膠卡法具有操作簡便、易于標(biāo)準(zhǔn)化、結(jié)果可保存等優(yōu)點(diǎn)，且方便快捷利于臨床推廣。但近年來的研究表明微柱凝膠卡法在檢測紅細(xì)胞抗體效價方面與經(jīng)典抗人球蛋白蛋白法相比具有更高的敏感性而需要重新界定參考值，且價格昂貴使得該方法難以得到廣泛推廣。凝聚胺法近年來在血型血清學(xué)中被逐漸采用，其基礎(chǔ)也是抗球蛋白法，凝聚胺是一種多價陽離子聚合物，在低離子介質(zhì)中可促進(jìn)紅細(xì)胞和血清之間的抗原抗體反應(yīng)使試驗(yàn)靈敏度提高。但它在實(shí)驗(yàn)溫度較低或患者含冷抗體時凝集會變得更強(qiáng)而會干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果[5，6]。以上方法均需要對處理后血清做系列倍比稀釋，步驟繁瑣，樣本量大時操作難度較大。本研究的簡易法操作簡便，實(shí)驗(yàn)成本低廉。

另外，抗體效價檢測方法僅為半定量技術(shù)。所用技術(shù)的不同，在很大程度上可影響反應(yīng)結(jié)果。移液技術(shù)及移液量的大小都將影響抗體效價結(jié)果[2]。采用經(jīng)典抗人球蛋白法重復(fù)檢測同一實(shí)驗(yàn)標(biāo)本結(jié)果一致率也僅為79%，相差一個滴度以內(nèi)概率為92%[7]。本研究的簡易方法更為簡便，適用于產(chǎn)前批量篩檢O型婦女IgG抗-A(B)抗體效價，該方法和傳統(tǒng)經(jīng)典抗人球蛋白法相比有較好的一致性及重疊性。在進(jìn)行O型婦女產(chǎn)前IgG抗A(B)抗體效價檢測時，可在使用經(jīng)典抗人球蛋白法時或凝膠卡等其他方法時加做簡易法，兩種方法結(jié)果相互驗(yàn)證以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。但本研究范圍僅限于檢測O型孕婦或因抗體效價高而引起反復(fù)流產(chǎn)的O型婦女的IgG型抗A(B)抗體效價，針對小于32的效價值需要用傳統(tǒng)經(jīng)典抗人球蛋白法或凝膠卡等方法來測定。