校正系數(shù)F在青錢柳代用茶檢驗(yàn)過(guò)程中的應(yīng)用

摘 要：青錢柳代用茶黃酮單體成份檢測(cè)過(guò)程中“樣品回流后冷卻稱重，加入純甲醇至回流前重量”步驟，在實(shí)際操作過(guò)程中要求做到“衡重”存在一定弊端、難度和安全風(fēng)險(xiǎn)。本文減少“衡重”實(shí)驗(yàn)步驟引入校正系數(shù)F參與計(jì)算（簡(jiǎn)稱方法2），通過(guò)分析純甲醇的毒性、減少不確定度因素提高不確定度及減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程工作量等考慮因素提出方法2的必要性;通過(guò)對(duì)Fv與Fm計(jì)算及驗(yàn)證，2例實(shí)例計(jì)算Fv與Fm相對(duì)誤差值0.17%和0.45%，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于5%，得出方法2檢驗(yàn)的可行性和一致性;通過(guò)分析比較2種方法6種檢測(cè)目標(biāo)物的RSD值（n=5）1.35%～4.48%，均小于5%，得出2種檢驗(yàn)方法結(jié)果的一致性。

關(guān)鍵詞：青錢柳代用茶檢測(cè);校正系數(shù)F;應(yīng)用

基金項(xiàng)目：湖南省食品藥品監(jiān)督管理局“湘西州人工種植青錢柳的質(zhì)量安全性評(píng)價(jià)及青錢柳葉代用茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究”（項(xiàng)目編號(hào)：湘食藥科R201726）? 青錢柳為胡桃科青錢柳屬植物，我國(guó)獨(dú)有單種屬植物，屬國(guó)家二級(jí)保護(hù)樹(shù)種，別名金錢柳、銅錢樹(shù)、搖錢樹(shù)等。主要生長(zhǎng)在中國(guó)南部海拔 420～2500m 的高山野外，現(xiàn)也有部分人工種植林，較多見(jiàn)于湖南、江西等省份，湖南省境內(nèi)主要分布在湘西州和邵陽(yáng)市等市州。青錢柳是一種食藥兩用植物，其葉、花、果均可入藥，其葉在食品加工領(lǐng)域中可作為新食品原料（中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)2013年第10號(hào)公告），食品加工領(lǐng)域一般用青錢柳葉加工成代用茶，我國(guó)湖南、江西等省份己有部分企業(yè)獲得青錢柳葉代用茶食品生產(chǎn)許可證。

現(xiàn)代藥學(xué)及食品加工業(yè)研究表明青錢柳葉中含有一定量的黃酮類化合物，并有一定的藥理活性。王克全等在青錢柳化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展，研究表明青錢柳中主要含有三萜皂苷、黃酮、甾體、萜類、有機(jī)酸、生物堿等類型成分，并且具有降血糖、降血脂、降血壓、增強(qiáng)免疫力、抗氧化和防衰老等藥理活性[1];張學(xué)英等在茶葉和3種代用茶總黃酮及9種單體化合物分析中研究表明青錢柳中含有綠原酸、異槲皮素等黃酮單體物質(zhì)[2]。經(jīng)查資料，青錢柳葉代用茶中黃酮及黃酮類化合物的檢測(cè)方法主要有分光光度計(jì)法、薄層色譜法、高效液相色譜法等，液相色譜法常用于黃酮單體的檢測(cè)，章發(fā)盛等研究了HPLC法同時(shí)測(cè)定青錢柳葉中綠原酸等4種多酚酸的含量[3];張學(xué)英等研究了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定青錢柳葉中異槲皮素等5種黃酮單體的含量研究[4];陳丹等研究了湖南綏寧青錢柳中槲皮素、山柰素含量測(cè)定[5] ;酈宏巖等研究了HPLC測(cè)定青錢柳中槲皮素和山柰素的含量[6]。經(jīng)查資料，黃酮單體檢測(cè)在樣品前處理過(guò)程中，一般處理步驟是“樣品中加入一定量的70%（或其他濃度）甲醇回流冷卻稱重，并加入純甲醇（或其他濃度）至回流前重量”[3-8]，但在實(shí)際操作過(guò)程中要求做到“衡重”存在一定弊端和難度，比如冷卻程度不徹底使衡重稱重不穩(wěn)、加入純甲醇至“衡重”操作控制難精準(zhǔn)到位、長(zhǎng)時(shí)間使用純甲醇對(duì)于檢測(cè)人員身體有一定傷害風(fēng)險(xiǎn)（甲醇：CH3OH是結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單的飽和一元醇，無(wú)色有酒精氣味易揮發(fā)的液體，分子量32.04，沸點(diǎn)64.7℃;甲醇對(duì)人體有強(qiáng)烈毒性，甲醇在人體新陳代謝中會(huì)氧化成比甲醇毒性更強(qiáng)的甲醛和甲酸，飲用含有甲醇的酒可引致失明、肝病、甚至死亡），應(yīng)盡量減少實(shí)驗(yàn)步驟比如二次稱量，以減少工作量且提高檢測(cè)不確定度等。本試驗(yàn)在樣品前處理過(guò)程中減少“加入純甲醇至回流前重量”操作步驟，引入校正系數(shù)F參與計(jì)算，并通過(guò)校正系數(shù)F驗(yàn)證和樣品平行檢測(cè)分析比較，得出通過(guò)減少實(shí)驗(yàn)步驟引入校正系數(shù)F方法的必要性、可行性和2種方法一致性。

1 試驗(yàn)材料

1.1 儀器

試劑高效液相色譜儀器（安捷倫1260，帶自動(dòng)進(jìn)樣裝置，PAD檢測(cè)器）;BSA-224S分析天平;JY502電子天平;ZWT-H1-20超純水機(jī);電熱恒溫水浴鍋;常用玻璃器皿等。甲醇（HPLC，含量≥99.9%）;乙腈（HPLC，含量≥99.9%）;乙醇（HPLC，含量≥99.8%）;磷酸;0.1%磷酸水溶液（自配）;超純水（自制）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品

混合標(biāo)準(zhǔn)液本試驗(yàn)用安譜實(shí)驗(yàn)室技術(shù)（上海）有限公司生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)品，共9種黃酮單體標(biāo)準(zhǔn)品：蘆丁（CAS號(hào)153-18-4，純度99.3%）;異槲皮素（CAS號(hào)482-35-9，純度99.6%）;槲皮素（CAS號(hào)117-39-5，純度98.8%）;山奈素（CAS號(hào)491-54-3，純度99.5%）;山奈酚（CAS號(hào)520-18-3，純度98.9%）;新綠原酸（CAS號(hào)906-33-2，純度99.9%）;綠原酸（CAS號(hào)327-97-9，純度99.7%）;隱綠原酸（CAS號(hào)905-99-7，純度99.6%）;咖啡酸（CAS號(hào)331-39-5，純度98.1%）。配制成2種混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：混標(biāo)使用液1，濃度分別為蘆丁136ug/mL、異槲皮素82ug/mL、槲皮素64ug/mL、山奈酚70ug/mL和山奈素148ug/mL;混標(biāo)使用液2，濃度分別為新綠原酸84ug/mL、綠原酸102ug/mL、隱綠原酸110ug/mL和咖啡酸64ug/mL。

1.3 試驗(yàn)樣品

試驗(yàn)樣品來(lái)源于湘食藥科[R201726]課題的科研樣品及青錢柳葉代用茶成品?？蒲袠悠窞?017-2018年春夏秋三季由科研人員野外現(xiàn)場(chǎng)采摘鮮葉，在試驗(yàn)室內(nèi)加工制成。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品前處理方法

2.1.1 樣品前處理方法1（簡(jiǎn)稱方法1）

準(zhǔn)確稱取過(guò)60目篩青錢柳粉碎樣品約0.5g（準(zhǔn)確至0.0001g）至250mL三角瓶中，準(zhǔn)確加入30.0mL70%甲醇水溶液稱重記數(shù)，加裝回流裝置于80℃水浴鍋中恒溫回流2h，取出冷卻至室溫再次稱重，并用純甲醇補(bǔ)至回流前的重量（即衡重），混均過(guò)0.45μm濾膜，待上機(jī)[3-8]。

2.1.2 樣品前處理方法2（簡(jiǎn)稱方法2）

準(zhǔn)確稱取過(guò)60目篩青錢柳粉碎樣品約0.5g（樣品重M、準(zhǔn)確至0.0001g）至250mL三角瓶中（空瓶重M0），準(zhǔn)確加入30.0mL70%甲醇水溶液（稱重記數(shù)M'），加裝回流裝置于80℃水浴鍋中恒溫回流2h，取出冷卻至室溫再次稱重（再次稱重記數(shù)M"），混均過(guò)0.45μm濾膜，待上機(jī)。

2.2 液相色譜檢測(cè)條件及系統(tǒng)適用性

2.2.1 液相色譜檢測(cè)條件

色譜柱C18（4.6×250mm，5μm）;流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%磷酸水溶液，按流動(dòng)相A（1～7分）10%→（7～13分）10%～16%→（13～14分）16%→（14～17分）16%～24%→（17～24分）24%→（24～32分）24%～50%→（32～45分）50%→（45～53分）10%時(shí)間和比例進(jìn)行梯度洗脫;進(jìn)樣量20ul;檢測(cè)柱溫30℃;檢測(cè)時(shí)間53min每針。

2.2.2 系統(tǒng)適用性

取異槲皮素等5種混合標(biāo)液1及單一標(biāo)準(zhǔn)品，用高效液相色譜儀PAD檢測(cè)器進(jìn)行三維掃描光譜分析，混合標(biāo)液1色譜圖見(jiàn)圖1，其它檢測(cè)數(shù)據(jù)及分析見(jiàn)表1。

通過(guò)三維掃描圖譜分析，異槲皮素等5種黃酮單體在360nm處色譜圖響應(yīng)值最大、基線平穩(wěn)、峰形好，故360nm為5種黃酮單體檢測(cè)波長(zhǎng)[4]。從圖1和表1可見(jiàn)異槲皮素等5種黃酮單體分離效果很好，理論塔板數(shù)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于4000;分離度均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于1.5;標(biāo)準(zhǔn)系列線性回歸方程相關(guān)系數(shù)均很接近1。證明液相色譜檢測(cè)系統(tǒng)適用性良好。

另取綠原酸等4種混合標(biāo)液2及單一標(biāo)準(zhǔn)品，用高效液相色譜儀PAD檢測(cè)器進(jìn)行三維掃描，混合標(biāo)液2色譜圖見(jiàn)圖2、其它檢測(cè)數(shù)據(jù)及分析見(jiàn)表2。

通過(guò)三維掃描圖譜分析，綠原酸等4種多酚酸在326nm處色譜圖響應(yīng)值最大、基線平穩(wěn)、峰形好，確定326nm為4種多酚酸檢測(cè)波長(zhǎng)[5]。從圖2和表2可見(jiàn)綠原酸等4多酚酸分離效果好，理論塔板數(shù)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于4000;分離度均大于1.5;標(biāo)準(zhǔn)系列線性回歸方程相關(guān)系數(shù)為1或很接近1。證明液相色譜檢測(cè)系統(tǒng)適用性良好。

3 校正系數(shù)F及驗(yàn)證

3.1 相關(guān)試劑

室溫環(huán)境下測(cè)定相關(guān)試劑的密度，檢測(cè)數(shù)據(jù)及分析見(jiàn)表3至表5。

由表3可見(jiàn)超純水（自制）平均密度為1.0057g/mL，RSD值為0.41%;由表4可見(jiàn)色譜純無(wú)水甲醇平均密度為0.7890g/mL，RSD值為0.19%，同時(shí)檢測(cè)值與理論值的相對(duì)誤差0.35%遠(yuǎn)小于10%;由表5可見(jiàn)70%甲醇水溶液平均密度為0.8545g/mL，RSD值為0.22%，同時(shí)檢測(cè)值與理論值的相對(duì)誤差9.6%小于10%，綜上分析本試驗(yàn)所用相關(guān)試劑均理想。

從以上2個(gè)計(jì)算實(shí)例分析，可見(jiàn)回流過(guò)程跑走純甲醇量比例為7.61%和3.92%，均小于10%，說(shuō)明回流過(guò)程中跑走的純甲醇量比例較小，并不影響整個(gè)試驗(yàn)合理性;2個(gè)計(jì)算實(shí)例Fv與Fm相對(duì)誤差值為0.17%和0.45%，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于5%，說(shuō)明2種系數(shù)驗(yàn)證法計(jì)算結(jié)果很接近且能相互驗(yàn)證一致性;比較2種驗(yàn)證法計(jì)算難易程度Fv比Fm難些，但從一般樣品前處理定容檢驗(yàn)步驟的理解Fv比Fm更易于理解，因?yàn)闄z驗(yàn)檢測(cè)“定溶”一般以液體體積為準(zhǔn)，而本試驗(yàn)是以“質(zhì)量定容”為準(zhǔn)。綜合以上分析以Fm應(yīng)用于本試驗(yàn)校正系數(shù)，且通過(guò)Fv和Fm驗(yàn)證試驗(yàn)可行性和一致性。

3.4 2種方法的檢測(cè)結(jié)果分析

比較用2種方法檢測(cè)同一樣品（n=5），所得樣品重現(xiàn)性檢測(cè)數(shù)據(jù)及結(jié)果分析，見(jiàn)表6。

從表6分析可見(jiàn)，用2種前處理方法檢測(cè)9種黃酮單體物質(zhì)，其中檢出的6種目標(biāo)物RSD值（n=5）1.35%～4.48%，均小于5%，說(shuō)明2種前處理B方法檢測(cè)結(jié)果相符即2種前處理方法的一致性。

4 結(jié)論

方法1在實(shí)際操作過(guò)程中要求做到“衡重”存在一定弊端和難度：比如液體冷卻程度不徹底或液體固有揮發(fā)性使稱重不穩(wěn);加入純甲醇至“衡重”操作控制難精確到位;長(zhǎng)時(shí)間使用純甲醇對(duì)于檢測(cè)人員身體有一定傷害風(fēng)險(xiǎn);宜盡量減少實(shí)驗(yàn)步驟比如二次稱量，以減少工作量且提高檢測(cè)不確定度等（即方法2必要性）;方法2通過(guò)減少實(shí)驗(yàn)步驟引入校正系數(shù)法，從而減少實(shí)驗(yàn)工作量及實(shí)驗(yàn)安全性，提高檢測(cè)不確定度。分析純甲醇的毒性、減少不確定度因素提高不確定度及減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程工作量等考慮因素提出方法2的必要性;通過(guò)對(duì)Fv與Fm計(jì)算及驗(yàn)證，兩例實(shí)例計(jì)算Fv與Fm相對(duì)誤差值0.17%和0.45%，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于5%，得出方法2檢驗(yàn)的可行性和一致性;通過(guò)分析比較2種方法6種檢測(cè)目標(biāo)物的RSD值（n=5）1.35%～4.48%，均小于5%，得出2種檢驗(yàn)方法結(jié)果的一致性。

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