犬細小病毒的生物信息學分析

魏玲 楊國淋 王懷禹 李彩虹

（1，南充職業技術學院 63700 ；2，川北醫學院 637000）

細小病毒病是寵物醫院臨床上常見的犬疾病，在感染該病后主要導致狗出現急性出血性腸炎和心肌炎，是一種高度傳染性的疾病，發病率高，死亡率高達60%，是最具威脅性的疾病之一[1]。目前，隨著生物技術的發展，可以從分子生物學角度進一步了解CPV 的功能結構，為CPV 病毒的真核或原核表達策略提供參考資料。此外，為CPV 膠體金快速診斷條帶基因工程疫苗的制備奠定基礎。為進一步了解和探索犬細小病毒的生長特性和增殖規律，為本病防治提供理論依據。

1 材料與方法

先通過登陸NCBI 網站，查詢VP2 基因的DNA 序列，然后采用分子生物學軟件對VP2 的蛋白理化性質進行檢測分析，主要使用VP2An-the-2000 來完成；通過ProtScale 軟件對VP2 基因的疏水性進行分析；通過http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi 完成蛋白質二級結構預測分析；通過http://emboss.bioinformatics.nl 完成蛋白質三級結構預測分析；采用NetPhos 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/Net.Phos）分析CPV-VP2蛋白存在磷酸化位點，經NetNGlyc1.0 （http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGbc）分析CPV-VP2蛋白存在的糖基化位點，采用Bcepred ( http://www.imtech.res.in/raghava/bce -pred/bcepred_submission.html) 分析CPV-VP2蛋白存在的B 細胞抗原表位。

2 結果與分析

2.1 VP2 基因蛋白基本理化性質分析

從NCBI 網站的核苷酸模塊中可以找到CPV-VP2 基因的全長DNA 序列，該基因的登錄號為KF803643。CPV 的VP2 DNA總長度為1755bp，其編碼氨基酸個數為584。經過采用ProtParam 程序來預測VP2 基因氨基酸序列的基本特性。當蛋白質的濃度為1g/L 時，結合半胱氨酸不形成二硫鍵的條件下，其光的吸收數值（Abs）為1.703，蛋白的不穩定數值為28.91（＜40.00），此數據顯示了該基因的蛋白質結構相對穩定。

2.2 VP2 基因的疏水性分析

CPV-VP2蛋白的最高親水值為-2.467，最高疏水值為2.178。通常，親水性氨基酸比疏水性氨基酸更均勻地分布，并且整條蛋白鏈呈現出親水性的特點。通過在線平臺檢測發現，CPV-VP2 沒有表達出蛋白的相關信息，且原核表達與編碼序列有著緊密聯系。本次研究發現，CPV-VP2蛋白屬于親水性，而且其氨基酸無顯著的跨膜現象，這一現象與疏水性相關分析有相似之處。

2.3 VP2蛋白二級結構的預測

通過Phyre2 蛋白預測程序預測氨基酸序列的二維結構。其中，α-螺旋區有58 個氨基酸，占9.05%，非常小。β 折疊區有143 個氨基酸，占25.77%，相對較大。不規則卷曲區域有383個氨基酸，占66.19%，占很大比例。

2.4 VP2蛋白三級結構的預測

通過同源建模檢測CPV-VP2 相關理論的維度結構區域，在線服務器主要使用SWISS-MODEL。檢測分析發現CPV-VP2的蛋白質3 級結構有折疊區域和螺旋區域，其顯著的特點為不規則。此外，還發現在VP2 的氨基酸位點上存在的殘基諾發生突變能形成不同的菌株，如CPV-2a 和CPV-2b，并且還可以影響CPV 的抗原特征。

2.5 CPV-VP2蛋白磷酸化位點和糖基化位點分析

通過NetPhos 2.0 （ http://www.cbs.dtu.dk/services/Net.Phos）預測分析CPV-VP2蛋白磷酸化位點發現，該蛋白存在8 個絲氨酸 （Ser）位點，分別為27、110、156、221、226、344、519、542；酪氨酸的位點個數為7 個，分別為79、305、338、343、378、400、561；蘇氨酸（Thr）的位點個數為9 個，分別為31、155、187、221、242、271、388、389、455。經典NetNGlyc1.0 （http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGbc）預測分析CPV-VP2蛋白一共含有7 個糖基化位點，分別為25-NGSG、47-NQTE、64-NSSR、180-NNTM、443-NYTN、505-NLTN、S17-NMSR。

2.6 CPV-VP2 B 細胞抗原表位預測

通過Bcepred 在線平臺分析發現，CPV-VP2蛋白存在6 個B 細胞抗原表位區域，見附表，其中22 和23 位點的抗原性指數最高。

3 犬細小病毒病臨床病例分析

通過對市區寵物醫院進行臨床調查，共統計了61 例犬細小病毒病臨床病例，調查顯示，該病的治愈率為50.8% （31/61），死亡率為14.8% （9/61），遺棄或不明確的預后為34.4%（21/61）。入院時72.1% （44/61）病犬體溫超過39℃，8.2% （5/61）患者出現嘔吐，63.9% （39/61）病犬出現嚴重嘔吐和腹瀉。在所有受影響的狗中，70.5% （43/61）未接種疫苗。腸炎型細小病毒病主要發生在3 個月左右的幼犬中，潛伏期為7～14d，腹瀉后1～3d 為死亡高峰期。心肌炎在4～6 周齡的幼犬中更常見。該研究發現，該病的死亡率很高，應優先考慮預防。目前，疫苗接種是預防控制CPV 最具有療效的辦法。臨床上，選擇弱毒病毒疫苗進行免疫接種，過程中嚴格按照相關程序進行，以確保免疫接種準確，不會跳過分裂[2]。Lu 等研究發現，在病毒衣殼蛋白的相關表位區域，氨基酸的非同義取代不但將抗原構象發生一定的改變，還可以使CPV 發生進化現象[3]。

4 討論

目前，關于細小病毒CPV-VP2蛋白功能的研究主要集中在MVMO，VP2蛋白分子量為83ku，細胞核中出現磷酸化蛋白，CPV-VP2蛋白可以與DNA 序列特異性結合，具有多種蛋白酶活性，參與病毒DNA 的復制，病毒基因表達調控及多種生理過程。在病毒DNA 復制中，細小病毒以類似于原核生物的發夾模式復制[4]。CPV-VP2蛋白特異性結合病毒復制（ACCA）2～3 序列的起始點，并在A 單鏈DNA 識別位點鄰近序列CTW-WTCA （W 代表A 或T）切入切口，產生3'-OH 作為A引物，在細胞聚合酶作用下進行病毒DNA 復制，然后通過CPV-VP2蛋白酪氨酸磷酸鍵共價鍵在切口的5'末端，穩定病毒DNA 鏈[5]。就細胞毒性而言，CPV-VP2蛋白主要影響幾種轉錄因子的生理活性，從而干擾這些細胞蛋白的功能并破壞細胞周期。在病毒感染A9 成纖維細胞以產生子代病毒過程中，VP2 在A9 細胞中引起的形態變化，導致細胞破裂和子代病毒釋放。發生這種變化是因為A9 成纖維細胞的VP2 感染選擇性地改變細胞骨架細絲和中間纖維，導致f-肌動蛋白和網格蛋白地顯著結構重排和降解。

附表 CPV-VP2蛋白B 細胞抗原表位預測

氨基酸疏水性可用作指示物，以確定蛋白質是否是跨膜蛋白質。如果發現多個親水/疏水區域在蛋白鏈中被分離，可以用作跨膜蛋白的標記。在該研究中預測VP2蛋白的疏水性，親水性和跨膜結構域表明，該蛋白質沒有顯著的跨膜區。因此，CPV-VP2蛋白可能不是膜蛋白。CPV-2a 和CPV-2b 之間的差異是氨基酸376，氨基酸376 是VP2 的主要抗原位點（表位A），CPV-2a 的氨基酸376 是天冬氨酸（D）和CPV 的氨基酸376。VP2-2c 是谷氨酸（E）。1990 年以后測序顯示，CPV-2a的第555 個氨基酸大多數為纈氨酸[6]。李世靜等研究發現，在試驗中克隆的CPV-vp2 的380 處氨基酸是天冬氨酸，418 處氨基酸是丙氨酸（A），屬于新的“CPV-2a”型[7]。早在20 世紀80 年代，由表位組成的多膚疫苗被認為是未來的終極疫苗。由于CPV 易于進化突變，使用天然抗原的免疫效果不是很理想，也可能引起免疫耐受。在人類醫學中，天然抗原已被修飾以產生更多免疫原性抗原。但CPV-VP2 在天然抗原修飾方面的研究較少，深度研究分析CPV-VP2 的基因表位及抗原修飾的意義重大，以提高該病的預防與治愈效果。