EDTA抗凝標本保存條件和時間對微柱凝膠法檢測血型的影響

徐 樸 周 愫 何紫琪 余 華

EDTA抗凝標本是血型檢測常用的標本，而微柱凝膠法是目前檢測血型的常用方法[1～5]。臨床輸血相關法規規定輸血標本檢測后于2～6℃至少保存7天，主要是為了追查不良事件，如果能保存更長時間則更有利于追查不良事件，但EDTA抗凝標本究竟保存多長時間仍然能有效地檢測出血型，目前尚無報道。本研究對血型標本保存時間和結果的準確性方面進行了探討，現將結果報道如下。

材料與方法

1.標本來源：隨機收集筆者醫院2017年9月體檢健康人群EDTA-K2抗凝標本256例，分為常溫組和4℃組。常溫組128例，其中男性76例，女性52例，患者年齡18～56歲，中位年齡35歲；4℃組128例，其中男性67例，女性61例，患者年齡19～53歲，中位年齡32歲；為避免血型之間的差異，每組A型、B型、AB型、O型標本各選取64例。經統計學分析，各組間年齡、性別構成、ABO血型比例比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.試劑與儀器：ABO、RhD血型定型檢測卡由長春博迅生物技術有限責任公司提供，人ABO血型反定型用紅細胞試劑盒由上海血液生物醫藥有限責任公司提供?？ㄊ诫x心機為BYL型血型血清學多用途離心機。

3.保存條件與觀察指標：常溫組于室溫下保存，4℃于2～6℃冰箱保存，觀察標本開始發生溶血(部分溶血)和完全溶血的時間。

4.微柱凝膠法檢測血型：對發生溶血不同階段的標本用微柱凝膠法檢測血型，按試劑說明書要求進行操作，在BYL型血型血清學多用途離心機上離心后觀察結果。

5.統計學方法：使用SPSS 20.0軟件學軟件對數據進行統計分析，各組間差異采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.不同保存條件下標本溶血狀態比較：標本分類保存后開始記錄，第1周均未發現溶血。從第2周開始，無論哪種條件保存，均有部分標本開始溶血。常溫保存至35天時所有標本均完全溶血，4℃保存至77天時所有標本均完全溶血。4℃與常溫條件比較差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 不同保存條件下標本溶血狀態比較 (n)

與常溫比較，t=3.033,P=0.011

2.不同溶血狀態對微柱凝膠法檢測血型的影響：用微柱凝膠法檢測血型，當標本不溶血時正反定型結果均清晰可見，詳見圖1；部分溶血時，正定型無影響而反定型稍有影響，但不影響血型鑒定，詳見圖2；當標本完全溶血后，反定型無法判斷結果，而正定型結果已模糊不清，血型不能準確鑒定，詳見圖3。

圖1 未溶血時微柱凝膠法檢測結果

圖2 部分溶血時微柱凝膠法檢測結果

圖3 完全溶血時微柱凝膠法檢測結果

討 論

安全有效的臨床輸血是現代醫療中的一項重要措施，而準確的血型鑒定是臨床輸血安全的重要保障[6～8]。為保障臨床輸血安全及輸血后不良事件追蹤與調查，無論是臨床輸血科(血庫)還是血站，均會對檢測的血型標本留存以方便后期核查，一般認為保存時間越長則越有利于不良事件的追蹤與調查，但這些標本究竟可以保存多長時間而不影響血型鑒定，目前尚無相關報道。EDTA抗凝標本由于無稀釋、無凝塊、可用于自動化檢測等諸多優點，因而是輸血前檢測常用的標本[9～12]。標本保存常用的條件是常溫和4℃。微柱凝膠法具有簡單、規范、靈敏度高、易于操作等優點而成為目前檢測血型常用的方法[13～16]。本研究就常用的EDTA抗凝標本在常溫和4℃條件下保存后用微柱凝膠法檢測血型，探討保存條件和保存時間對微柱凝膠法檢測血型的影響。

隨著保存時間的延長，標本開始溶血并且逐漸加重。溶血狀態通常有不溶血、不完全溶血和完全溶血3種。不溶血標本血清(漿)層呈淡黃色清晰透明，紅細胞和血清(漿)層分界清晰，不完全溶血標本血清(漿)層呈紅色半透明狀態，紅細胞和血清(漿)層分界模糊，完全溶血標本呈暗紅色混濁狀態，紅細胞和血清(漿)不能分層。

本研究發現，在常溫或4℃保存條件下，第7天均未發現溶血；第14天時，常溫保存標本約有1/3開始溶血，4℃保存標本只有少量發生溶血，隨保存時間延長，溶血程度逐漸加重；常溫保存標本第35天時均完全溶血，而4℃保存標本第77天時均完全溶血。標本未同時發生溶血與不同個體紅細胞膜穩定性、脆性以及采血技巧等有關。上述結果表明，無論是常溫還是4℃保存，EDTA-K2抗凝標本在1周內均無明顯變化，但隨著保存時間延長，4℃保存條件明顯優于常溫保存(P<0.05)。

通過觀察不同溶血狀態對微柱凝膠法血型檢測結果的影響發現，標本未溶血時，正反定型結果均清晰可見，對血型鑒定無影響；當標本發生部分溶血時，正定型無明顯影響，而反定型雖然液體顏色偏紅，但不影響凝集強度的觀察，對血型鑒定影響不大；當標本發生完全溶血后，反定型結果受到嚴重干擾，已無法判斷，正定型結果亦較難判斷，此時已不能再用微柱凝膠法進行鑒定。上述結果表明，常溫標本保存至第35天、4℃標本保存至第77天時，已無法用微柱凝膠法檢測血型。本研究結果與許桂平等[17]研究發現溶血標本對血型檢測有影響的結果一致。而屠海濤等[18]研究發現，標本溶血對反定型無影響，完全溶血對正定型有影響。該研究對正定型的影響和完全溶血標本無法進行血型檢測的結論與本研究一致，但反定型的結論與本研究不一致，其原因是該研究采取冰凍和機械溶血的方法，而本研究模擬日常工作對標本的保存方式進行保存，隨保存時間延長，溶血更為徹底；同時該研究采用的實驗方法為試管法，與本研究采用的微柱凝膠法也不一致。

綜上所述，本研究中無論是常溫還是4℃保存，EDTA抗凝標本的最佳保存時間為1周，此時用微柱凝膠法檢測血型無影響。常溫保存35天內、4℃保存77天內，對反定型有影響，此時用微柱凝膠法檢測血型須謹慎。常溫標本保存超過35天、4℃標本保存超過77天時，標本發生完全溶血，此時不宜用微柱凝膠法檢測血型。上述研究可為輸血不良事件調查中關于標本保存條件、期限以及檢測方法提供實驗室參考數據，實驗室可根據自身需要選擇標本保存條件、期限和檢測方法。