大孔樹脂純化銀杏葉中總黃酮的工藝研究

馮靖，彭效明，李翠清，王騰，居瑞軍，湯晨洋，邱曉

(北京石油化工學院 燃料清潔化及高效催化減排技術北京市重點實驗室 化學化工國家級示范中心，北京 102617)

銀杏葉是我國藥用歷史悠久的中藥材，產量大、價格低廉。銀杏葉中總黃酮的藥理作用有抗癌、抗衰老、抗炎等。至今已從銀杏葉中分離得到46種黃酮類化合物，廣泛應用在藥品、保健品中[1-5]。傳統方法提取量低，耗時長，而微波-超聲聯合提取的方法可以提高提取效率，國內外對此提取方法研究尚少，前景廣闊。大孔樹脂是一種穩定的純化用吸附劑，具有效率高、選擇性強、可循環利用等優點[6-8]。

本文采用微波-超聲雙輔助的方法從銀杏葉中提取黃酮類化合物粗品，探究大孔樹脂純化銀杏葉總黃酮的最佳工藝條件，純化效率高，且效果顯著。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

銀杏葉，飲片級；蘆丁標準品；乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸均為分析純；大孔吸附樹脂HPD-100、D-101、AB-8、DM130、DM-301均為工業品，性質見表1。

表1 大孔樹脂的性質Table 1 Macroporous resin properties

CP224C天平；UV-2600紫外-可見光分光光度計；DT5-4B低速離心機；KQ-300DB超聲波清洗機；JY96-IIN超聲波細胞粉碎機；ZN-20L小型粉碎機；XH-100A微波催化合成萃取儀；SHB-III循環水式多用真空泵；DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器；HY-4調速多用振蕩器；WB-2000水浴鍋；R-1001VN旋轉蒸發儀；DL-1510節能型低溫冷卻液循環機；10N冷凍干燥機。

1.2 銀杏葉中黃酮類化合物的提取

25 mL錐形瓶中加入銀杏葉0.5 g，10 mL的70%乙醇溶液，置于微波萃取合成發生器中，微波功率100 W，微波時間2 min，隨后放入超聲波細胞粉碎儀中，超聲功率75 W，超聲時間8 min，放入低速離心機中，轉速1 500 r/min，離心時間3 min。取上清液，放入25 mL錐形瓶中。離心管中固體進行二次提取，兩次上清液混合為提取液，將提取液旋蒸，保證液體中沒有乙醇后預凍36 h[9-10]，隨后凍干樣品至樣品溫度為常溫，得到粗品，純度為24%，粗品配制成0.75 mg/mL 的黃酮類化合物水溶液，備用[11]。

1.3 黃酮粗品的純化

1.3.1 大孔樹脂的預處理 大孔樹脂用去離子水沖洗，除去白色漂浮物，吸水紙吸走樹脂表面的水分，樹脂用95%乙醇浸泡24 h。用去離子水淋洗樹脂至無醇味，4% HCl溶液浸泡2 h。用去離子水淋洗樹脂至中性，4% NaOH 溶液浸泡2 h，用去離子水淋洗樹脂至中性，以濾紙吸去樹脂表面水分，備用[12]。

1.3.2 銀杏葉中總黃酮的純化 錐形瓶中加入大孔樹脂2 g，20 mL粗品黃酮類化合物含量為0.75 mg/mL的溶液，將錐形瓶置于搖床中，振蕩速率為100次/min，振蕩2 h，使之達到吸附平衡，取樣，用紫外分光光度儀在510 nm處測量吸光度，計算吸附率。

25 mL錐形瓶中加入達到吸附平衡的2 g大孔樹脂，20 mL 60%的乙醇水溶液，將錐形瓶置于搖床中，振蕩速率為100次/min，振蕩3 h，使之達到解吸平衡，取樣進行檢測，計算解吸率。

吸附量Qt=(C0-Ct)/C0×V/M

吸附率(解吸率)At=(C0-Ct)/C0

其中，C0為吸附或解吸前溶液黃酮類化合物含量；Ct為吸附或解吸后溶液黃酮類化合物含量；V為溶液體積；M為樹脂質量。

1.4 標準曲線的建立

取蘆丁標準品5.0 mg，去離子水定容至50 mL，配制成0.1 mg/mL的蘆丁標準品母液，分別用移液槍移取母液0.00，0.10，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.4，1.6 mL到10 mL比色管中，70%乙醇溶液定容至2 mL，加入5% NaNO2水溶液 0.3 mL，搖勻靜置6 min，加入10% Al(NO)3水溶液 0.3 mL，搖勻靜置6 min，最后加入10% NaOH水溶液 3 mL，搖勻，靜置15 min。分別放入已經校準過基線的紫外分光光度儀中，依次在510 nm處測量吸光度，以吸光度作為縱坐標，蘆丁標準品濃度作為橫坐標，繪制蘆丁標準曲線[13]，見圖1，線性回歸得標準曲線方程y=12.257x+0.004。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Rutin standard curve

2 結果與討論

2.1 大孔樹脂的篩選

5種大孔樹脂達到吸附和解吸平衡時的吸附率、吸附量、解吸率、解吸量見表2。

表2 5種大孔樹脂的吸附與解吸效果比較Table 2 Comparison of adsorption and desorption effects of five macroporous resins

由表2可知，吸附效果最好的是HPD-100與D101，二者吸附效果不相上下，吸附率均達到80%以上，而HPD-100的解吸率比D101高8.4%，可以使黃酮類化合物很好的被洗脫。因此，選定大孔樹脂HPD-100作為后續吸附黃酮類化合物的樹脂[14]。

2.2 大孔樹脂HPD-100吸附解吸動力學

取大孔樹脂HPD-100 2 g于錐形瓶中，加入20 mL粗品黃酮類化合物含量為0.75 mg/mL的溶液，將錐形瓶置于搖床中，振蕩速率為100次/min，振蕩10，20，30，60，90，120，180，240 min，取樣 1 mL，進行檢測，繪制大孔樹脂HPD-100的吸附動力學曲線，利用Boyd擴散方程計算樹脂對銀杏葉黃酮的吸附速率[15]。

Ln[Q平/(Q平-Qt)]=kt

式中Q平——吸附平衡時的吸附量，mg/g；

Qt——t時刻的吸附量，mg/g；

k——平衡速率常數。

25 mL錐形瓶中，分別加入達到吸附平衡的大孔樹脂HPD-100 2 g，20 mL 60%的乙醇水溶液，將錐形瓶置于搖床中，振蕩速率為100次/min。振蕩10，20，30，60，90，120，180，240 min取樣1 mL進行檢測，繪制大孔樹脂HPD-100的解吸動力學曲線，結果見圖2、圖3。

圖2 大孔樹脂HPD-100吸附動力學曲線Fig.2 Adsorption kinetics curve of HPD-100

圖3 大孔樹脂HPD-100的解吸動力學曲線Fig.3 Desorption kinetics curve of HPD-100

由圖2與圖3可知，大孔樹脂HPD-100在120 min達到吸附平衡，吸附率最高可達80.12%，吸附量3.68 mg/mL。解吸過程在180 min達到平衡，解吸率最高可達99.18%，解吸量 36.68 mg/mL，吸附與解吸速度很快，且效率高，根據Boyd擴散方程擬合結果見表3。

表3 大孔樹脂HPD-100對黃酮類化合物的吸附動力學方程Table 3 Adsorption kinetic equation of macroporous resin HPD-100 for flavonoids

由表3可知，樹脂HPD-100可以很好的擬合吸附效果，吸附速度快，擬合相關系數高，可以使得黃酮類化合物很好的被洗脫。

2.3 單因素實驗

2.3.1 上樣濃度對黃酮類化合物吸附效果的影響 25 mL錐形瓶中，分別加入粗品黃酮類化合物含量為0.25，0.5，0.75，1.0，1.25，1.5 mg/mL的溶液20 mL，大孔樹脂HPD-100 2.0 g，錐形瓶放到空氣浴搖床中振蕩2 h。分別取樣檢測，吸附率最高所對應的上樣濃度為最佳上樣濃度。

實驗結果見圖4。

圖4 上樣濃度對黃酮類化合物吸附率的影響Fig.4 Effect of loading concentration on the adsorption rate of flavonoids

由圖4可知，上樣濃度為0.75 mg/mL時，吸附率最高，達到80.98%，所以最佳上樣濃度為0.75 mg/mL。上樣液濃度過低，使得大孔樹脂沒有完全發揮吸附的效果，上樣液濃度過高，使得黃酮類化合物沒有完全被吸附，所以上樣液濃度過高或過低均會使得吸附率降低。

2.3.2 上樣液pH對黃酮類化合物吸附效果的影響 以稀釋的NaOH和HCl溶液調節0.75 mol/L的黃酮類化合物溶液pH至1，2，3，4，5，6，7，8，9各20 mL，加入大孔樹脂HPD-100 2.0 g，將錐形瓶放到空氣浴搖床中振蕩2 h。分別取樣，吸附率最高所對應的上樣液pH為最佳上樣液pH。實驗結果見圖5。

由圖5可知，上樣液pH為6時吸附率最高，達到81.23%，所以最佳上樣液pH為6。當上樣液pH高于7或者低于5時，過堿過酸的環境使得黃酮類化合物穩定性較差。這可能由于黃酮類化合物結構中存在酚羥基，使黃酮類化合物顯弱酸性，在弱酸性的條件下比較穩定。

圖5 上樣液pH對黃酮類化合物吸附率的影響Fig.5 Effect of pH of the sample solution on the adsorption rate of flavonoids

2.3.3 上樣流速與上樣體積對大孔樹脂吸附效果的影響 向吸附平衡的樹脂上加入濃度60%的洗脫液，分別以0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 BV/h的流速淋洗。每相隔10 mL測量收集液中黃酮濃度。上樣流速與上樣體積對吸附效果的影響見圖6。

圖6 上樣流速與上樣體積對吸附效果的影響Fig.6 The effect of load flow rate and loading volume on the adsorption effect

由圖6可知，當流速為0.5 BV/h時，收集液體積達到160 mL時，泄露點出現，總黃酮濃度有上升趨勢，證明樹脂吸附將達到飽和，此時，黃酮類化合物與樹脂接觸比較充分，使得黃酮吸附率較高。當流出液體積達到360 mL時，流出液濃度與上樣液濃度接近，吸附達到飽和。當流速為1.0 BV/h時，收集液體積達到140 mL時，泄露點相比較0.5 BV/h提前出現，總黃酮濃度有上升趨勢，證明樹脂吸附將達到飽和，當流出液體積達到360 mL時，流出液濃度與上樣液濃度接近，吸附達到飽和。當流速為1.5 BV/h時，曲線沒有出現泄漏點，證明流速過快，樹脂和黃酮類化合物沒有充分接觸便流出，黃酮類化合物沒有完全被吸附，證明此流速是不合理的。

2.3.4 洗脫液濃度對黃酮類化合物解吸效果的影響 分別稱取10份2 g達到吸附平衡的樹脂置于錐形瓶中，加入10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%乙醇水溶液20 mL，放于空氣浴搖床上振蕩3 h，使之達到解吸平衡。分別測量解吸液中黃酮類化合物的含量，計算解吸率。解吸率最高時對應的乙醇濃度即為最佳洗脫液濃度。實驗結果見圖7。

圖7 洗脫液濃度對黃酮類化合物解吸效果的影響Fig.7 Effect of eluent concentration on desorption of flavonoids

由圖7可知，洗脫液濃度60%時解吸率最高，達到99.99%。洗脫液濃度過低，造成黃酮類化合物解吸不完全，洗脫液濃度過高，解吸率呈現微弱下降趨勢，猜測原因是洗脫液濃度過高，破壞了黃酮類化合物結構[15]。

2.3.5 洗脫液流速與洗脫液體積對大孔樹脂吸附效果的影響 吸附平衡的樹脂上加入濃度60%的洗脫液，分別以0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 BV/h的流速淋洗。每隔10 mL測量收集液中黃酮濃度。洗脫液流速與洗脫液體積對大孔樹脂吸附效果的影響見圖8。

圖8 洗脫液流速與洗脫液體積對大孔樹脂吸附效果的影響Fig.8 Effect of eluent flow rate and eluent volume on adsorption of microporous resin

由圖8可知，當洗脫流速為2.0 BV/h 以及2.5 BV/h時，峰型尖銳且無拖尾現象，當洗脫流速為2.0 BV/h，解吸率最高，解吸量也最高。所以洗脫流速為2.0 BV/h時，洗脫效果最佳，最佳洗脫體積為55 mL時解吸率最高，達到95.28%，解吸量達到2.57 mg/g。當流速小于2.0 BV/h或大于2.5 BV/h時，峰型較鈍，出現拖尾現象，洗脫不集中。因此實驗中選擇2.0 BV/h。

2.4 大孔樹脂的再生

解吸完全后的樹脂用去離子水沖洗至無白色漂浮物，95%乙醇浸泡24 h。用去離子水淋洗樹脂至無醇味，4% HCl溶液浸泡2 h。用去離子水淋洗樹脂至中性，4% NaOH 溶液浸泡2 h。用去離子水淋洗樹脂至中性(pH=7.0)，濾紙吸去樹脂表面水分，再次使用。大孔樹脂HPD-100再生次數對大孔樹脂吸附效果的影響見圖9。

圖9 大孔樹脂再生次數對黃酮類化合物吸附效果的影響Fig.9 Effect of regeneration times of macroporous resin on adsorption of flavonoids

由圖9可知，大孔樹脂利用6次，靜態吸附率為74.4%，7次以上，黃酮類化合物靜態吸附率降低到72.2%以下，且下降比較明顯，不利于回收再利用，所以大孔樹脂HPD-100可回收再利用6次。

2.5 銀杏葉總黃酮的純化驗證性實驗

按照最佳工藝條件，即上樣濃度0.75 mg/mL，pH=6，流速0.5 BV/h，體積360 mL，洗脫液乙醇濃度60%，流速2.0 BV/h，體積55 mL，對銀杏葉黃酮進行動態吸附與解吸，將洗脫后的溶液進行旋蒸、凍干，得到銀杏葉黃酮精品，對精品進行純度檢測，結果見表4。

表4 黃酮類化合物純化前后純度對比Table 4 Purity comparison of flavonoids before and after purification

由表4可知，黃酮類化合物的產物純度由24%提高到74%，且3次實驗RSD值為1.9%，小于3%，符合要求，實驗方案可行。

3 結論

考察了5種大孔樹脂對銀杏葉黃酮的吸附與解吸效果，結果表明，大孔樹脂HPD-100可作為銀杏葉黃酮的最佳吸附樹脂，吸附率高達81.23%，解吸率高達99.99%，最佳實驗條件為：上樣濃度0.75 mg/mL，pH=6，流速0.5 BV/h，體積360 mL，洗脫液乙醇濃度60%，流速2.0 BV/h，體積55 mL。同時，此種樹脂2 h達到吸附平衡，3 h達到解吸平衡，吸附和解吸的速度快，凍干后銀杏葉黃酮純度可由24%提高到74%，大孔樹脂可回收再利用6次。大孔樹脂HPD-100非常適合銀杏葉總黃酮純化，相比較其他純化方法，選擇性強、環保、成本低廉，為銀杏葉黃酮的工業化提供了強有力的支持。