黃芪多糖提取、純化及其應用研究進展

臧凱，張萍，袁彩彩，石賢才，章亞東

(鄭州大學 化工與能源學院 鄭州大學濟源研究院，河南 鄭州 450001)

黃芪主要分為莢膜黃芪和內蒙古黃芪兩種，在黑龍江、內蒙古、江西等地均有分布。黃芪性甘，微溫，在我國有2 000多年的藥用歷史，對黃芪的記載始見于《馬王堆帛書五十二病方》，黃芪與芍藥、甘草等復配使用可以治療疽病。

黃芪含有黃芪皂苷、多糖、蛋白質、黃酮等有效成分，多糖是黃芪的水溶性主要成分之一[1]。黃芪多糖具有抗氧化、免疫調節、抗腫瘤等生理功能。黃芪多糖由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖組成。由于其具有突出的生理功能，黃芪多糖已經成為醫療、食品、養殖等方面的研究熱點。本文就黃芪多糖提取、純化及其應用進行綜述，以期為黃芪多糖的進一步開發利用提供參考。

1 黃芪多糖的提取

在黃芪多糖的提取過程中可以先用石油醚、乙醇脫脂處理，這樣可以使多糖更易溶出。黃芪多糖的提取方法有溶劑法、酶輔助法、微生物發酵法、物理強化法等。

1.1 溶劑法

溶劑法是工業上較常用的提取方法，操作方便、成本低但其提取時間長、溫度高、會導致活性組分失活。表1中列舉了3種溶劑法提取黃芪多糖的提取率。

表1 溶劑法提取黃芪多糖提取率Table 1 Solvent method Astragalus polysaccharide extraction rate

1.2 酶輔助提取

酶能破壞細胞壁結構，減少細胞壁和細胞間質的阻力，提高提取率。Chen等[4]比較了纖維素酶、果膠酶等8種酶對黃芪多糖的提取率，發現葡萄糖氧化酶的效果最好，并用響應面法優化提取工藝：酶量3.0%，處理時間3.44 d，處理溫度56.9 ℃，提取溶劑pH 7.8，在此條件下，黃芪多糖的提取率達到(29.96±0.14)%，與沒有酶輔助相比提高了250%。董玲玲[5]將微波和纖維素酶提取聯合使用，多糖的提取率達到16.07%。除此之外，在植物提取的過程中也常將多種酶共同使用[6]。使用酶進行輔助提取污染小，方法簡單，成本較低，但酶對環境條件的要求較高，需要嚴格控制環境條件。

1.3 微生物發酵提取

微生物發酵提取是利用細菌或真菌等微生物在代謝過程產生的多種酶對提取底物進行作用。這些酶能破壞或修飾細胞壁的結構，使中藥中的活性成分更容易釋放出來，還能將多糖降解為小分子多糖并轉化為其他類型的多糖。邊亞彬[7]優化了非解乳鏈球菌(FGM)發酵黃芪多糖的工藝，在提取時間65 min，提取溫度80 ℃，料液比為1∶9的條件下，發酵黃芪多糖的含量為6.72 mg/mL，并證實發酵黃芪多糖能促進小鼠骨髓原DC的成熟。蘇貴龍[8]發現FGM和枯草芽孢桿菌，FGM 固、液兩步法兩種方法均能提高發酵黃芪根、莖、葉多糖的得率。發酵提取中藥有效成分，不僅能提高提取效率，同時還能降低中藥的毒副作用。

1.4 物理強化法

近年來常用的物理強化法有超聲輔助提取、微波輔助提取、負壓空化提取等。物理強化法是用物理方法破壞細胞結構，使多糖從細胞內流出，從而達到提高提取率的目的，也是近年來植物提取中常用的方法。超聲、微波輔助提取與負壓空化提取相比，提取率較低且前人已對其進行了詳細的綜述，本文就不再對其進行展開說明。表2列舉了物理強化法提取黃芪多糖的提取率。

表2 物理強化法提取黃芪多糖提取率Table 2 Physical enhancement method Astragalus polysaccharide extraction rate

負壓空化運用強烈的空化作用和機械振動加快植物組織中有效成分進入溶劑，實現短時間和低溫提取[12]。既可以保護植物中的熱敏性物質不被破壞，同時又可以減少因高溫分解而產生的蛋白質、淀粉等大分子雜質。Jiao等[13]對均質輔助負壓空化提取黃芪多糖的工藝進行了優化，在均質時間70 s，負壓-0.068 MPa，提取溫度64.8 ℃，水料比1∶13.4，提取時間53 min的條件下提取率為16.74%。同時FTIR結果表明，此法不改變黃芪多糖的一級結構。與傳統的熱水提取方法相比，負壓空化提取具有提取率高、條件溫和等優點。在其他植物的提取中有將負壓空化和其他提取方法進行連用，田莉等[14]優化了減壓耦合超聲提取蘋果渣多酚的工藝，得到的多酚提取液的還原能力要大于超聲提取所得到的。

熱水浸提法雖然提取率低，但適用于工業化大規模提取。超聲、微波輔助提取對工藝設備要求高，不適合大規模生產應用。酶輔助提取高效，但對環境要求高。微生物發酵中，需要解決如何選育優良的菌種的問題[15]。研究表明提取溫度能通過影響黃芪多糖的結構影響其生理活性[16]，每一種方法都有優缺點，如何揚長避短，實現低溫、高效提取應是以后黃芪多糖提取研究重點。

2 黃芪多糖的純化

2.1 脫蛋白

有報道表明黃芪粗多糖中蛋白質的含量大于15%。除去蛋白質是獲得高活性、高價值黃芪多糖產品的重要步驟。黃芪多糖常用的脫蛋白方法見表3。

表3 黃芪多糖除蛋白的主要方法及其優缺點Table 3 The main methods of removing protein from Astragalus membranaceus polysaccharides and their advantagesand disadvantages

為了便于操作，提高多糖的得率，近年來通常將酶法和Sevage法聯用。胡媛媛[20]對蛋白酶和Sevayge法聯用脫蛋白工藝進行優化，在酶底比2.0%，pH 5.0，50 ℃水浴酶解24 h時效果最好，蛋白脫除率89.82%，黃芪多糖質量分數83.47%。酶法和Sevage法連用，去除蛋白質效果好且多糖的損失率較低，同時又簡化了操作。

2.2 黃芪多糖純化

2.2.1 分級沉淀法 多糖的結構和分子量不同會導致其極性不同，從而導致它們在有機溶劑中的溶解度不同，根據這一原理，可以依次增加有機溶劑的濃度，將不同分子量的多糖沉淀出來。在多糖的分級沉淀中乙醇是常用的一種沉淀劑。李紅發等[21]采用30%，50%，70%，75%，80%，90%的乙醇溶液對黃芪多糖進行分級沉淀，得到6個不同組分。分別對各個組分結構、組成及其抗氧化性進行分析，結果表明隨著乙醇濃度的增加，得到的多糖的分子量逐漸降低，多糖中半乳糖、甘露糖和鼠李糖的含量依次升高，葡萄糖的含量依次降低，但抗氧化活性增強，且抗氧化活性與多糖的結構有關。

2.2.2 柱層析法 在黃芪多糖的分離純化中用的最廣泛的是離子交換柱層析和凝膠柱層析。離子交換柱層析主要用于多糖粗提液中單組分多糖的粗分離。依據被分離多糖的結構、分子量的大小使用不同規格的凝膠柱層析能實現多糖的分離或進一步純化。屈靜等[22]使用SephadexCL-6B凝膠柱，0.9%NaCl作為洗脫劑，對脫蛋白的黃芪多糖進行柱層析，得到分子量為5 600 Da，含量為96.3%的均一多糖。王瑞遵[23]先用DEA-Cellulose離子交換柱層析，以0.5 mol/L NaCl為洗脫劑，將黃芪多糖進行粗分離，得到兩個組分，之后用SephadexCL-6B凝膠柱，以0.15 mol/L NaCl為洗脫劑，對多糖進一步純化，得到AMPSA-a、AMPSA-b、AMPSA-c、AMPSB-d 4種四個分子量且各個組分多糖均具有顯著的抗氧化作用。

2.2.3 膜分離 在常溫下進行的膜分離過程，具有不使用有機溶劑、分離選擇性高、易于與其他方法連用等優點。超濾法是20世紀60年代興起的膜分離技術，因其產率高且對產物的破壞極小，廣范地用于植物的分離提純。張慶雷[24]將超頻震動膜過濾技術與乙醇分級沉淀法用于黃芪多糖純化，發現前者易得到分子量比較均一的多糖。唐雨微[25]利用不同截留量(150，100，50，20，10，6 kDa)的中空纖維膜，在0.1 MPa壓力下，將脫蛋白的黃芪多糖分成7組，經DEAE-Cellulose和Sephadex G-100柱層析進行分離，得到6個多糖，研究表明得到的多糖具有微生態調節功能。

目前對黃芪多糖的分離純化方法比較固定，可以參照其他多糖的分離純化工藝，以便更好的對黃芪多糖進行純化，例如應用膜集成技術對多糖進行分離純化：微濾和超濾分離純化茶多糖，可以得到兩個組分。除此之外常用的膜分離法還有微濾、納濾等，在黃芪多糖的純化中應用的較少，但已用于其他植物多糖的純化，在黃芪多糖的分離純化中可以借鑒。

3 應用

3.1 醫療

由于黃芪多糖具有良好的免疫調節、抗腫瘤、抗炎等藥理作用。目前黃芪多糖在疾病的治療中取得了較大的進展。在臨床上已經用于治療腫瘤、哮喘、糖尿病方面的疾病。對其他一些疾病的治療還停留動物試驗階段。

3.1.1 腫瘤 高死亡率使癌癥成為全球人類健康的主要威脅。目前治療癌癥的主要方法是化療，但化療往往伴隨著一些毒副反應，還可能產生耐藥性。黃芪多糖在增強機體免疫、抑制腫瘤生長和促進細胞凋亡的同時還能降低藥物的毒副作用。近年來黃芪多糖在治療癌癥方面發展迅猛。有研究表明黃芪多糖對胃癌MGC-803細胞，人非小細胞肺癌A549細胞和人肝癌HepG2細胞具有抑制作用，可誘導胃癌MGC-803細胞凋亡[26]。楊曉嵐[27]將注射性黃芪多糖和放療結合用于胃癌的治療，聯合治療組癌癥治療率、腫瘤體積變小率分別為63.9%，59%，而對照組分別為53%，51.8%，同時聯合治療組患者的免疫、造血和肝腎的功能水平與對照組相比明顯提高。張瑩等[28]將黃芪多糖和細胞因子誘導的殺傷細胞聯合治療中晚期氣虛型非小細胞肺癌。疾病控制率和卡氏評分分別為聯合治療組69.4%，77.8%，對照組為36.1%，55.6%。此外黃芪多糖還可以和吉西他濱聯用，治療胰腺癌，和阿霉素脂質體連用治療肝癌等。

3.1.2 哮喘 黃芪多糖可能通過調節免疫細胞功能和細胞因子表達，增強抗炎活性，從而對呼吸系統疾病起到較好的作用。在常規治療的基礎上給哮喘患者注射黃芪多糖注射液能顯著降低患者BALF或痰液所含炎癥細胞水平[29]，維持免疫平衡，提高機體免疫能力，同時恢復肺功能，降低不良反應風險。另有研究表明黃芪多糖能通過對T淋巴細胞發揮免疫調控作用，改善患者免疫應激狀況，提高患者免疫力，從而提高支氣管哮喘患者治愈率[30]。

3.1.3 糖尿病 黃芪多糖能夠通過調節患者的免疫功能、減少炎癥反應，改善患者的腎功能。鄧海鷗等[31]用黃芪多糖注射液治療老年早期糖尿病腎。賴瑜[32]研究表明，黃芪多糖和三黃化瘀湯聯合使用能降低糖尿病腎病早期患者中血清中炎癥因子血漿纖溶酶原激活物抑制因子-1的含量。

3.1.4 其他 此外黃芪多糖也可用于治療心血管、神經系統方面的疾病。 陳添華[33]的研究表明，黃芪多糖對AngⅡ刺激引起的心肌細胞肥大及炎癥反應有良好的保護作用。王愛青[34]證實黃芪多糖對急性高眼壓大鼠視網膜損傷具有保護作用，與用藥劑量相關。

3.2 食品 《保健食品原料手冊》一書指出黃芪多糖可作為保健食品原料使用。周關鍵等人以黃芪多糖、銀杏葉提取物和富硒黑番茄為主要的功能成分，研發出一種對糖尿病并發癥具有防治作用的面條。邵寶平等[35]以黃芪多糖為原料研制出一種口感舒適、色澤良好具有增強免疫抗疲勞的功能飲料。

3.3 養殖

3.3.1 免疫增強劑 黃芪多糖能改善血清環境，激發機體免疫應答反應，促進細胞因子分泌，增強體內抗體水平來增強疫苗的效果。Zhu等[36]通過實時定量RT-PCR檢測表明，在脾臟和頭腎組織中，炎癥細胞因子IL-1β的mRNA表達在免疫早期增加，激發Th1免疫應答反應，整個免疫期細胞因子IL-2、IFN-γ2升高，血清中IgM明顯增強，黃芪多糖可增強黃鯰愛德華氏菌疫苗效力。

黃芪多糖作為天然的飼料添加劑不僅能提高機體的免疫力同時還能提高機體的生產性能。陳亞軍[37]發現當黃芪多糖在飼料中的添加量為50～400 mg/kg 時，能顯著的增強泥鰍的非特異性免疫和抗氧化能力。這可能是由于黃芪多糖能提高白細胞、紅細胞和血清中NO的含量造成的。Wu等[38]的研究證實1 g/kg黃芪多糖喂食肉雞能促進幼年肉雞的生長。與對照組相比，肉雞體內淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性更高，但黃芪多糖含量過高時，則會降低消化酶的活性。

3.3.2 生殖 人工授精廣泛的應用于現代豬場中，液氮保存精液壽命短，冷凍保存可延長精液的壽命。在精液的冷凍解凍過程中，怎樣為精子建立一個強大的抗氧化體系已成為人們急需解決的問題。黃芪多糖具有良好的抗氧化功能，因此黃芪多糖有可能會成為解決這一問題的不錯選擇。Fu等[39]研究證實黃芪多糖可以通過影響活性氧進入環腺苷磷酸的途徑，從而對精子蛋白的去磷脂化進行抑制。宋健[40]研究證明黃芪多糖能夠通過降低豬解凍精液活性氧的含量，提高精子的抗氧化能力，從而提高體外受精效率及胚胎發育能力。

4 討論與展望

黃芪多糖具有極高的應用價值，目前關于黃芪多糖的研究雖然取得了很大的進展，但還存在一些問題如：(1)目前的很多研究并未對其構效關系進行說明，這就需要完善黃芪多糖的制備方法，借助指紋譜圖技術、相似度分析和聚類分析等技術[41]來研究黃芪多糖的結構，制定質量控制方案如確定其有效片段的分子量范圍；(2)黃芪多糖是保健食品原料，但目前市場上與黃芪多糖相關的保健品并不多見，可以進一步完善黃芪多糖的作用機制，加強食品方面的研究力度；(3)在醫療(如神經系統、心血管疾病等)方面，還只停留在動物實驗上，可加強這方面的深入研究，進一步推動臨床開發和應用；(4)黃芪多糖具有清除自由基[42]的功能，有望成為抗衰老、抗氧化化妝品的活性成分。