基于數據庫分析肝細胞癌細胞XPO5基因水平變化及其臨床意義*

王 剛，趙洪波，朱亞玲，蔣保三，張越美，刁勇

肝細胞癌（hepatocellular caicinoma，HCC）是世界上第六大癌癥和第三大常見的癌癥死因[1，2]。XPO5屬于核轉運蛋白家族，其轉運的pre-miRNAs從細胞核向細胞質的輸出是miRNA成熟不可或缺的一步。XPO5作為通過調節miRNA來控制基因表達的關鍵分子，其本身的表達改變或突變對miRNA水平有顯著的影響[3]。大量研究證明，HCC的發生發展與miRNA的差異性表達有著密切的關系，甚至相當數量的miRNA直接參與了HCC的分化、凋亡、侵襲和遠處轉移過程[4]。據文獻報道，XPO5表達與前列腺癌和黑色素瘤等腫瘤相關，發現在前列腺癌細胞，敲低XPO5表達可抑制癌細胞增殖和前列腺癌的發展[5]。XPO5過表達導致miRNA加工機制的失調，導致蛋白質穩定性發生變化，這一過程可能是通過較低的泛素化和糖基化而實現的[6]。但XPO5基因與HCC的相關報道還不多，具體作用機制尚不清楚。本研究應用公共數據庫分析了HCC細胞XPO5基因水平的變化，并分析了其對患者預后的影響，現將結果報道如下。

1 對象與方法

1.1 Oncomine數據庫分析 Oncomine（https://www.oncomine.org/）數據庫[7]為收集和標準化分析腫瘤樣本基因表達譜芯片的數據庫，能提供腫瘤轉錄組數據。目前，Oncomine已經收集了來自715個基因表達數據集，86733個癌組織和正常組織的樣本數據，用于識別腫瘤基因組中失調的基因、通路和調控網絡。Oncomine可以分析多個基因的差異性表達，給出比較全面的結論。從Oncomine數據庫中篩選基因，在本研究中設置的檢索條件如下：①Analysis type：Cancer vs.Normal analysis；②Cancer type：Liver cancer；③Data type：mRNA；④設定條件：Over-expression；⑤XPO5。分析HCC組織XPO5 mRNA水平。

1.2 基因表達譜互相作用分析（gene expression profilling interactive analysis，GEPIA，http://gepia.cancer-pku.cn）數據庫 由北京大學研制開發用于分析基因在癌組織與正常組織差異表達的在線應用程序[8]。在GEPIA中，數據是基于TCGA（The Cancer Genome Atlas）和 GTEx（Genotype-Tissue Expression）數據庫，得出標準RNA測序數據。在本研究，首先，在GEPIA數據庫中選擇來源于TCGA數據庫的所有HCC和正常組織的RNA測序數據，分析其是否存在差異表達,以驗證Oncomine數據庫的結論。然后，分析不同臨床和病理分級患者該基因的差異及其該基因水平差異對患者總體生存率和無病生存率的影響。

1.3 MethHC（a database of DNA Methylation and gene expression in Human Cancer）數據庫分析 MethHC數據庫[9]（http：//methhc.mbc.nctu.edu.tw）是關于腫瘤基因表達和DNA甲基化的綜合數據庫，由臺灣國立交通大學開發，包含18種人類腫瘤，包括正常和腫瘤組織DNA甲基化和mRNA/miRNA表達譜。利用MethHC可以探討正常和腫瘤組織DNA甲基化模式，并分析甲基化和表達之間的關系。我們運用該數據庫分析XPO5基因DNA甲基化水平。

1.4 STRING（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes）數據庫分析 STRING（http：//stringdb.org/）是包含各種蛋白質相互作用的數據庫[10]。數據來源主要為文獻報道的蛋白質相互作用信息以及通過共表達研究、高通量實驗和基因組信息分析預測的結果，描述的相互作用關系包括生理上的直接相互作用和功能上的間接相互作用。該數據庫為本研究提供了HCC組織XPO5相關蛋白的相互作用的分析資料。

2 結果

2.1 HCC組織與正常肝組織XPO5基因水平的比較 在Oncomine數據庫，有Chen Liver（Mol Biol Cell,2002）和 Wurmbach Liver（Hepatology，2007）2個子數據庫符合篩選條件。分析發現HCC組織XPO5基因較正常肝組織呈顯著高水平（P值為1×5.11-6，圖 1A、圖 1B）；在 Chen Liver數據庫中，有76例正常肝組織和103例HCC組織，后者XPO5基因呈高水平，其中n=179，Fold Change=1.758（P 值為 1×3.80-13，圖 1A）；在 Wurmbach Liver數據庫中，有10例正常肝組織和35例HCC組織，后者 XPO5基因為高水平，其中 n=45，Fold Change=2.125（P 值為 1×1.02-5，圖 1B）。應用GEPIA分析TCGA中HCC數據，包括正常肝組織50例和HCC組織369例。HCC組織 XPO5基因水平較正常肝組織顯著升高（P＜0.01，圖 2），與Oncomine數據庫結果一致。

2.2 XPO5基因水平與HCC患者生存期的關系 利用GEPIA中TCGA數據分析XPO5基因水平與HCC患者生存期的關系，發現了182例XPO5基因高水平與182例XPO5基因低水平患者的生存曲線，顯示XPO5基因高水平組總體生存期顯著短于低水平組（P＜0.01，圖3A），XPO5基因高水平組無病生存期也顯著短于低水平組（P＜0.01，圖3B）。

圖1 Oncomine各子數據庫中HCC組織與正常肝組織XPO5 mRNA水平差異

圖2 TCGA數據庫419個樣本XPO5水平（紅色為369例HCC，灰色為50例正常肝組織）

圖3 XPO5基因水平與HCC生存期的關系

2.3 XPO5基因水平與HCC病理學分級關系 HCC病理學分為Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級。Ⅰ/Ⅱ級為高分化，Ⅲ/Ⅳ級為低分化。利用GEPIA中TCGA數據分析不同病理學分級的HCC組織XPO5基因水平的差異，結果Ⅲ級HCC組織XPO5水平最高（圖4）。

圖4 不同病理學分級的HCC組織XPO5水平比較

2.4 XPO5基因主體區域DNA甲基化水平分析 在MethHC數據庫中顯示XPO5基因甲基化轉錄模板NM-020750，在HCC中其甲基化水平較正常肝組織低（P＜0.005,圖5A）。分析HCC組織XPO5基因在啟動子（promoter）區域、增強子（enhancer）區域和基因體（gene body）區域等區域甲基化水平，發現其在基因體區域甲基化水平較正常肝組織顯著降低（圖5B）。

圖5 XPO5基因體區域甲基化水平比較

2.5 XPO5相關作用蛋白網絡 利用STRING數據庫分析XPO5蛋白的相互作用，其中以XPO5為中心發現有多個相互作用的蛋白質，如RAN、DICER1和ILF3等（圖6）。

圖6 XPO5蛋白的相互關系

3 討論

XPO5存在于核膜，介導pre-miRNA的運輸，從而調控miRNA的表達。阻止XPO5的表達能導致miRNA水平的減低。XPO5的突變將導致miRNA合成減少，且減少對miRNA靶基因的抑制。有文獻報道，Pin1的敲減能恢復XPO5功能和miRNA的合成，從而抑制HCC增殖和遷移。因此，研究XPO5與HCC的關系尤為重要。

我們首先利用Oncomine數據庫篩選出在HCC組織呈高水平的XPO5基因，并與正常肝組織進行比較，結果2個子數據集均顯示HCC組織XPO5 mRNA水平比正常肝組織高。再選擇TCGA數據中369例HCC患者和50例正常人進行分析，結果與Oncomine數據庫篩選結果一致。我們又通過MethHC網站分析了XPO5基因在HCC和正常肝組織中的甲基化水平，MethHC分析結果顯示在HCC組織XPO5基因在基因體區域甲基化水平比正常肝組織中的低，提示XPO5基因在基因體區域甲基化水平降低可能在HCC的發生和發展過程中扮演著重要的角色。DNA甲基化的主要功能區域包括promoter、enhancer和gene body。這三個區域DNA甲基化對基因轉錄的影響是不同的，啟動子甲基化能抑制轉錄起始，而轉錄延伸會增強基因體甲基化，增強子的甲基化更加復雜。研究表明，基因體DNA甲基化可能通過阻斷啟動子的啟動或通過影響轉錄單元內重復DNA的活性來增加轉錄活性，這也正好驗證了本研究發現的HCC患者癌組織XPO5基因體區域甲基化水平降低的結論，但其具體機制還需要進一步研究。

最后，我們利用GEPIA中TCGA數據庫分析了XPO5基因水平與HCC患者癌組織不同病理學分級之間的關系及其對患者生存時間的影響。XPO5基因上的rs11077單核苷酸位點可以改變XPO5的表達，從而影響miRNA的整體表達。已有研究證實 rs11077基因多態性與我國小細胞肺癌、非小細胞肺癌和肝癌等惡性腫瘤患者預后相關。與XPO5基因低水平組相比，XPO5基因呈高水平者總體生存率和無病生存期均明顯縮短。HCC分級代表了腫瘤的惡性程度，但是XPO5基因水平卻在Ⅲ級患者癌組織最高。由于HCC癌組織分化Ⅳ級比較罕見，可能由于數量較少造成這一結果，具體原因仍需進一步研究和驗證。我們還利用STRING數據庫分析了XPO5蛋白與其他蛋白的相互作用情況，結果發現RAN、ILF3和DICER1等蛋白與XPO5關系密切。DICER1是miRNA生成的關鍵酶，是大多數miRNA合成所需要的酶。XPO5基因調控DICER1的表達，而抑制DICER1的表達，使HCC細胞惡性轉化和遷移能力顯著下降。有研究發現,DICER1缺失與其他致癌因子共同作用加速HCC的發生。有人認為DICER1是一個潛在的腫瘤抑制因子。ILF3蛋白的雙鏈RNA結合域的功能是作為一種奇特的核輸出序列，其功能的實現依賴于XPO5的表達。ILF3蛋白家族對病毒感染反應、mRNA的運輸與定位、翻譯控制、轉錄和信號轉導等方面發揮著非常重要的作用。RAN mRNA及其蛋白在多種腫瘤的細胞系和組織中呈高表達，抑制該基因的表達可以降低腫瘤的發生，并且RAN可調控 HCC相關蛋白有絲分裂在紡錘體的定位。也有研究認為可將RAN蛋白作為治療HCC的靶標之一。