探討HIF-1α途徑介導(dǎo)七氟烷/異丙酚對(duì)肺癌細(xì)胞惡性程度的調(diào)節(jié)作用

崔艷田，劉東亞，韓快娟

(1.漢中市人民醫(yī)院麻醉科，陜西 漢中 723000；2.西安高新醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710075)

肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的臨床常見的惡性腫瘤，病程進(jìn)展快，具有較高的致殘率與死亡率，常給患者家庭及社會(huì)造成巨大的生活及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。因此，探索肺癌細(xì)胞惡性程度的變化與發(fā)病機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)。肺癌的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，其中低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1α信號(hào)通路的激活是目前研究最為深入的肺癌發(fā)生缺氧相關(guān)機(jī)制，其在膀胱癌、直腸癌[3]、前列腺癌[4]、肝癌[5]中呈高表達(dá)，可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、血管形成、腫瘤細(xì)胞代謝、轉(zhuǎn)移/侵襲、藥物抵抗等諸多生物學(xué)過程[6]。已有研究[7]顯示，HIF-1α顯著高表達(dá)于鱗狀細(xì)胞肺癌中，但是具體的作用機(jī)制尚不明確。麻醉藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響關(guān)系到腫瘤患者術(shù)后的長(zhǎng)期轉(zhuǎn)歸，因而探討麻醉藥對(duì)細(xì)胞惡性程度的調(diào)節(jié)作用具有重要意義。七氟烷為一種揮發(fā)性麻醉藥，不刺激上呼吸道，血?dú)夥峙湎禂?shù)低，起效快[8]；異丙酚為靜脈全麻常用藥物，具有代謝迅速、高脂溶性的特點(diǎn)[9]。本文旨在探討HIF-1α途徑介導(dǎo)七氟烷和異丙酚單獨(dú)或聯(lián)合使用對(duì)肺癌細(xì)胞惡性程度的調(diào)節(jié)作用。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料

非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H1299，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)(HyClone公司培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是37 ℃、5% CO2，2 d更換1 次培養(yǎng)液，0.25%胰蛋白酶消化傳代)。胰酶購自Gibco公司，抗HIF-1α抗體、抗β-actin抗體購自Abcam公司。七氟烷與異丙酚購自江蘇恒瑞公司。

1.2 細(xì)胞分組與處理

將H1299細(xì)胞分為4組：空白組、七氟烷組、異丙酚組與聯(lián)合組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，空白組不進(jìn)行處理，以PBS代替。七氟烷組加入終濃度1 nmol/L的七氟烷，異丙酚組加入終濃度1 nmol/L的異丙酚，聯(lián)合組加入終濃度均為1 nmol/L的七氟烷和異丙酚，孵育6 h后更換成正常培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按照5×104個(gè)/孔傳到96孔板中，細(xì)胞處理培養(yǎng)24 h與36 h后，每孔加MTT 10 μL。作用4 h后，吸管洗凈培養(yǎng)液，每孔中加入DMS0 150 μL，振蕩培養(yǎng)10 min，充分混勻溶解后使用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度值(OD)，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞1×106個(gè)/孔接種于6孔板，細(xì)胞處理培養(yǎng)24 h與36 h后，胰酶消化法收集細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次(15 min/次)。用含有10 μL Annexinv/PI 2∶1的結(jié)合緩沖液共500 μL重懸細(xì)胞，避光冰上放置30 min，采用流式細(xì)胞儀(FACSCaliburTM)進(jìn)行檢測(cè)分析細(xì)胞凋亡率。

1.5 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲

細(xì)胞接種于6孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/孔。細(xì)胞處理培養(yǎng)24 h與36 h后，在侵襲實(shí)驗(yàn)中，在Transwell小室上下室之間孔徑為8 μm的聚碳酸酯微孔膜上鋪上Matrigel溶液50 μL，聚合30 min后進(jìn)行37 ℃平衡12 h。下室中加入600 μL常規(guī)培養(yǎng)基，將細(xì)胞加入上室，每室100 μL。培養(yǎng)24 h后室溫下甲醛固定15 min，采用0.5%結(jié)晶紫染液，計(jì)數(shù)穿過濾膜的細(xì)胞。

1.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

細(xì)胞處理培養(yǎng)24 h與36 h后，取所有細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解液，冰上放置30 min，4 ℃、12 000 rpm離心10 min，取上清。將樣品(20 μg)加入到SDS-PAGE加樣孔內(nèi)進(jìn)行電泳，電泳后進(jìn)行PVDF膜轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，分別加入抗HIF-1α抗體(1∶500)、抗β-actin抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜，洗膜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)，室溫孵育120 min，洗膜、顯影后掃描儀成像，采用自動(dòng)成像系統(tǒng)分析。

上述所有實(shí)驗(yàn)都重復(fù)3次，取3次實(shí)驗(yàn)的平均值作為結(jié)果數(shù)據(jù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

選擇SPSS 18.00軟件對(duì)本研究所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與處理，對(duì)各組數(shù)據(jù)首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，兩組計(jì)量資料間的比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖率對(duì)比

細(xì)胞處理培養(yǎng)24 h與36 h后，七氟烷組、異丙酚組與聯(lián)合組的細(xì)胞增殖率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，聯(lián)合組亦低于七氟烷組及異丙酚組(P<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖率對(duì)比

*P<0.05，與對(duì)照組比較；#P<0.05，與異丙酚組比較；△P<0.05，與七氟烷組比較。

2.2 細(xì)胞凋亡率對(duì)比

細(xì)胞處理培養(yǎng)24 h與36 h后，七氟烷組、異丙酚組與聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，聯(lián)合組亦分別高于七氟烷組和異丙酚組(P<0.05)。見表2。

2.3 細(xì)胞侵襲率對(duì)比

細(xì)胞處理培養(yǎng)24 h與36 h后，七氟烷組、異丙酚組與聯(lián)合組的細(xì)胞侵襲能力顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，聯(lián)合組亦分別低于七氟烷組與異丙酚組(P<0.05)。見表3。

表2 各組細(xì)胞凋亡率對(duì)比

*P<0.05，與對(duì)照組比較；#P<0.05，與異丙酚組比較；△P<0.05，與七氟烷組比較。

表3 各組細(xì)胞侵襲能力對(duì)比

*P<0.05，與對(duì)照組比較；#P<0.05，與異丙酚組比較；△P<0.05，與七氟烷組比較。

2.4 HIF -1α表達(dá)水平對(duì)比

細(xì)胞處理培養(yǎng)24 h與36 h后，七氟烷組、異丙酚組與聯(lián)合組的細(xì)胞HIF-1α相對(duì)表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，聯(lián)合組亦分別低于七氟烷組與異丙酚組(P<0.05)。見表4。

表4 各組細(xì)胞HIF-1α相對(duì)表達(dá)水平對(duì)比

*P<0.05，與對(duì)照組比較；#P<0.05，與異丙酚組比較；△P<0.05，與七氟烷組比較。

3 討論

肺癌是目前世界上發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，其早期診斷困難，缺乏特異性治療手段，使得患者的死亡率一直居高不下。惡性腫瘤在生長(zhǎng)和發(fā)展過程中，不受控制地過度生長(zhǎng)使耗氧量顯著增加，因此肺癌機(jī)體普遍存在低氧微環(huán)境，可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[10]。而乏氧腫瘤細(xì)胞對(duì)于放射線抵抗，是造成腫瘤治療后復(fù)發(fā)與放療失敗的原因之一。當(dāng)腫瘤細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)，會(huì)激活細(xì)胞的低氧應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活HIF-1α的表達(dá)。HIF-1α作為這一環(huán)節(jié)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可成為當(dāng)前腫瘤治療研究的重要靶點(diǎn)之一[11]。

七氟烷和異丙酚為經(jīng)典的代表性吸入全麻與靜脈全麻藥物，具有起效快、時(shí)效短、蘇醒迅速等特點(diǎn)。本研究顯示，細(xì)胞處理培養(yǎng)24 h與36 h后，七氟烷組、異丙酚組與聯(lián)合組的細(xì)胞增殖率、侵襲能力均顯著低于對(duì)照組，細(xì)胞凋亡率亦顯著高于對(duì)照組，聯(lián)合組與七氟烷組、異丙酚組對(duì)比，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明，七氟烷、異丙酚的應(yīng)用都能促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡，抑制其增殖與侵襲，而兩者的聯(lián)合使用可發(fā)揮協(xié)同作用。另有研究[12]顯示，七氟烷、異丙酚可呈劑量依賴性地促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

缺氧條件是肺癌發(fā)生與發(fā)展過程中強(qiáng)有力的驅(qū)動(dòng)因素，缺氧可誘導(dǎo)細(xì)胞代謝功能的改變，導(dǎo)致增加放療、化療抵抗能力。HIF-1是由α、β亞基構(gòu)成一種低氧信號(hào)傳遞因子，低氧環(huán)境可誘導(dǎo)HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)，與HIF-1β形成二聚體后可參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[13]。已有研究[14]顯示，HIF-1α與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、生長(zhǎng)、增殖密切相關(guān)，是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞適應(yīng)低氧的核心轉(zhuǎn)錄因子。miRNA沉默HIF-1α表達(dá)可以抑制Survivin基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，提示HIF-1α是參與調(diào)控凋亡相關(guān)基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子。另外，還有研究[15]顯示，HIF-1α在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)狀況，且與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，可作為評(píng)價(jià)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。本研究指出，細(xì)胞處理培養(yǎng)24 h與36 h后，七氟烷組、異丙酚組與聯(lián)合組的細(xì)胞HIF-1α相對(duì)表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，聯(lián)合組亦低于七氟烷組與異丙酚組，表明麻醉藥物的應(yīng)用能抑制HIF-1α的表達(dá)。麻醉藥物的聯(lián)合使用可有效抑制HIF-1α的表達(dá)，從而發(fā)揮更好的抗腫瘤作用。目前，也有研究[8]顯示異丙酚可顯著抑制低氧誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，且作用機(jī)制可能與激動(dòng)α2腎上腺素能受體有關(guān)。此外，研究[9]顯示，肺損傷大鼠接受七氟烷處理后，肺癌組織HIF-1α表達(dá)水平下調(diào)，提示七氟烷具有抑制肺損傷上HIF-1α通路活性和侵襲力的作用。

總之，七氟烷和異丙酚都可抑制HIF-1α途徑的激活，從而發(fā)揮對(duì)肺癌細(xì)胞惡性程度的抑制作用，且七氟烷和異丙酚的聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用。