Wnt信號通路抑制對急性白血病天門冬酰胺酶耐藥性的影響

高曉艷，劉梅，田小清，呂潤林，魯英娟

(1.榆林市第二醫(yī)院血液內(nèi)科，陜西 榆林 719000；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，陜西 西安 710032)

急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是骨髓中異常的髓系原始細胞大量增殖并抑制正常造血而形成的白血病分型，在分子生物學(xué)、形態(tài)學(xué)、細胞遺傳學(xué)上有著極大的異質(zhì)性[1]。ALL的病因非常復(fù)雜，染色體異常和可重現(xiàn)性的基因異常是ALL患者發(fā)病的主要機制，表觀遺傳學(xué)調(diào)控也是ALL的重要發(fā)病機制[2-3]。天門冬酰胺酶(Asp)治療ALL有一定的療效，但是隨著藥物的大量使用與其他因素的影響，ALL患者Asp耐藥性情況越來越多，已經(jīng)嚴重影響到了患者的治療與預(yù)后效果[4-5]。Wnt信號通路是在腫瘤的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，Wnt信號通路被認為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制[6]。在ALL的發(fā)生發(fā)展過程中，激活Wnt信號通路可能導(dǎo)致腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，從而也為可為ALL的治療提供新的思路[7-8]。本文具體探討了Wnt信號通路抑制對ALL Asp耐藥性的影響，希望為明確ALL Asp耐藥的機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人ALL細胞株THP-1購自中科院武漢細胞庫，DMEM細胞培養(yǎng)購自美國Gibco公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM3000、Annexin V-FITC PI細胞凋亡檢測試劑盒購于美國Invitrogen公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；MTT增殖檢測試劑盒購于美國Promega公司；兔抗人一抗購自英國Abcam公司；HRP抗兔二抗購自英國Abcam公司；siRNA陰性對照載體與Wnt siRNA載體由本實驗室保存(構(gòu)建方法：先找靶基因干擾序列Wnt siRNA，然后是做它的反義鏈Wnt，后面加T6結(jié)構(gòu)，中間用loop環(huán)連接，在兩端加上酶切位點)；Asp購自美國Sigma公司(用DMSO配成1.0 mM，4 ℃保存)。

1.2 細胞分組與處理

在含10.0%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)THP-1細胞，培養(yǎng)箱的環(huán)境是37 ℃、5% CO2。將細胞分為3組：對照組、Asp組與si-Wnt組。Asp組與si-Wnt組分別轉(zhuǎn)染siRNA陰性對照載體與Wnt siRNA載體，各2 μg。對照組不進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)染48 h后的各組單細胞懸液調(diào)整濃度為1×105個/mL ，培養(yǎng)于96孔板中。給Asp組與si-Wnt組細胞均加入Asp(終濃度為0.25 μM)進行處理；對照組加生理鹽水，每個時間點進行 3個復(fù)孔的設(shè)置。

1.3 MTT法檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期THP-1細胞經(jīng)胰酶消化后，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至1×105個/mL，培養(yǎng)至相應(yīng)時間節(jié)點時，每孔加入20 μL 0.5 mg/mL MTT溶液，6 h后終止培養(yǎng)，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min后使用酶標儀540 nm波長處檢測與計算增殖活性。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

取對數(shù)生長期THP-1細胞，調(diào)整細胞濃度至1×103個/mL，接種于6孔培養(yǎng)板；培養(yǎng)至相應(yīng)時間節(jié)點時，將細胞采用胰酶消化，1 000 rpm×5 min離心棄上清，加入200 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI雙標記后，避光反應(yīng)15 min，采用流式細胞儀檢測凋亡情況。

1.5 流式細胞儀檢測細胞周期

調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL，使用70%乙醇4 ℃重懸固定。PBS離心沉淀去除固定液，將50 μg/mL碘化丙啶PI添加到每毫升細胞懸液，將100 μL染色液添加進去混勻，在4 ℃避光保存，時間為30 min，采用流式細胞儀檢測與計算各個細胞周期的比例。

1.6 Western-blot法檢測蛋白表達水平

取對數(shù)生長期THP-1細胞，胰酶消化后提取細胞的總蛋白，每組取20 μg蛋白跑SDS-PAGE膠，轉(zhuǎn)膜后進行過夜封閉，剪成將對應(yīng)大小的條帶放入含有相應(yīng)一抗溶液的抗體孵育盒中(稀釋比例為1∶1 000)，4 ℃過夜，TBST洗滌后，再將膜置于相應(yīng)種屬的二抗中(稀釋比例為1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌后進行ELC顯色，檢測Wnt、GAPDH、AKT蛋白表達水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細胞存活情況比較

Asp加藥后24 h、48 h、72 h，si-Wnt組的細胞抑制率高于對照組與Asp組(P<0.05)。對照組在加藥后24 h和48 h的細胞抑制率低于Asp組(P<0.05)，而在加藥后72 h對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組加藥后不同時間點的細胞抑制情況對比

*P<0.05，與空白對照組比較；#P<0.05，與Asp組比較。

2.2 細胞凋亡情況比較

Asp加藥后24 h、48 h、72 h，si-Wnt組的細胞凋亡率高于對照組與Asp組(P<0.05)，且Asp組高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 3組加藥后不同時間點的細胞凋亡情況對比

*P<0.05，與空白對照組比較；#P<0.05，與Asp組比較。

2.3 細胞周期情況對比

Asp加藥后72 h，si-Wnt組的G2/M期細胞比例高于對照組與Asp組(P<0.05)，Asp組高于對照組(P<0.05)。si-Wnt組G0/G1期細胞比例低于對照組與Asp組(P<0.05)，Asp組和對照組對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。3組間，S期細胞比例對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 3組加藥后72 h的細胞周期情況對比

*P<0.05，與空白對照組比較；#P<0.05，與Asp組比較。

2.4 Wnt、AKT蛋白表達對比

Asp加藥后72 h，si-Wnt組中Wnt及AKT蛋白相對表達均低于對照組與Asp組(P<0.05)，Asp組和對照組對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 3組加藥后72 h的Wnt、AKT蛋白相對表達水平對比

*P<0.05，與空白對照組比較；#P<0.05，與Asp組比較。

3 討論

當(dāng)前我國白血病的發(fā)病率逐年上升趨勢，死亡人數(shù)也逐年增多。ALL是白血病的常見類型，多發(fā)病于成年人。雖然臨床上治療ALL的藥物比較多，但是治療效果均較差，五年生存率很難超過40 %。為了改善ALL患者的預(yù)后，深入研究ALL的發(fā)病與治療機制具有重要的價值[9]。

天門冬酰胺酶對ALL和急性單核細胞白血病有一定療效，在臨床上也應(yīng)用于治療惡性淋巴瘤。該藥能將血清中的門冬酰胺水解為門冬氨酸和氨，使得白血病細胞既不能從血中取得足夠門冬酰胺，也不能自身合成，從而抑制白血病細胞的增殖，促使其凋亡[10]。但是隨著天門冬酰胺酶的廣泛使用，天門冬酰胺酶的耐藥性越來越高[11]。Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，其中包含Wnt配體、Frizzled(FZD)受體、共受體、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白等組分，在癌癥發(fā)生、干細胞生長和胚胎發(fā)育中起著重要作用[12]。Wnt基因能夠編碼結(jié)構(gòu)類似的分泌型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，可參與細胞特異化和組織極化，同時參與成人組織的穩(wěn)態(tài)平衡和有絲分裂、分化等過程。Asp加藥后24 h、48 h、72 h可抑制細胞存活，促進細胞凋亡，而Wnt通路抑制更能進一步促進Asp導(dǎo)致的細胞存活抑制及細胞凋亡。這表明Asp對白血病細胞具有一定的殺傷作用，但是Wnt通路抑制可以促進這種殺傷作用。

ALL發(fā)生的確切機制目前仍尚未完全清楚，不過也是一個多基因、多階段的疾病，其病理改變涉及代謝酶、炎癥、細胞周期、細胞凋亡的變化。有研究[13]顯示在白血病細胞株中外源性過表達Wnt可以在體外有效的抑制白血病細胞的增殖，抑制白血病的發(fā)展。還有研究[14]表明Wnt過表達可以通過抑制下游靶基因介導(dǎo)膀胱癌細胞G1期阻滯，從而促使細胞生長受阻，還能抑制膀胱癌細胞的遷移和浸潤能力。Wnt受體結(jié)合可以刺激胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進而促進β-catenin的核易位與穩(wěn)態(tài)。靜息狀態(tài)下，β-catenin與Axin、APC等形成β-catenin降解復(fù)合物，此時β-catenin被激酶激活成磷酸化狀況，導(dǎo)致其泛素化降解，從而使途徑激活。本研究顯示Asp加藥后72 h，G2/M期細胞比例增多，G0/G1期細胞比例降低，Wnt通路抑制可進一步促進這種現(xiàn)象。這提示Asp可能導(dǎo)致DNA損傷，使細胞周期阻滯，防止受損的的DNA進入有絲分裂，對白血病細胞的生長具有抑制作用。而Wnt信號通路抑制可進一步促進此過程，表示W(wǎng)nt信號抑制可促進Asp導(dǎo)致的細胞周期阻滯，抑制細胞生長。

Wnt信號通路與惡性腫瘤細胞的增殖分化、血管生長、浸潤轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。特別是Wnt表達量增加可導(dǎo)致Notch途徑被DNA損傷應(yīng)答激活，進而導(dǎo)致正常細胞的腫瘤轉(zhuǎn)化。本研究顯示Asp加藥后72 h可顯著降低Wnt及AKT蛋白表達，而Wnt信號通路抑制可進一步促進Asp對Wnt及AKT蛋白表達的抑制作用。由此推測，Wnt信號通路抑制可通過間接下調(diào)AKT信號傳導(dǎo)實現(xiàn)對ALL細胞的殺傷作用。當(dāng)前也有研究顯示過表達Wnt能促進白血病細胞凋亡和分化，抑制細胞轉(zhuǎn)移，可能通過激活線粒體通路來誘導(dǎo)細胞凋亡[15]。本研究也有一定的不足，Wnt信號通路的具體作用機制還不明確，其在ALL中的明確靶基因還不清楚，將在后續(xù)研究中深入分析；且本研究沒有進行體內(nèi)實驗分析，可能有一定的研究結(jié)論偏倚，也需要進一步加強分析。

總之，Wnt信號通路抑制可降低ALL細胞對Asp的耐藥性，抑制AKT蛋白的表達，阻滯細胞周期，促進ALL細胞的凋亡，抑制其增殖。