一種高效穩定的大鼠腸粘連模型制備方法

馮成敏，黃文學，張繼，王冰，沈成義

(1.川北醫學院臨床醫學系，四川 南充 637000；2.鹽源縣人民醫院，四川 鹽源 615700；3.電子科技大學醫學院，四川 成都 610054；4.川北醫學院醫學影像四川省重點實驗室；5.川北醫學院基礎醫學院化學教研室；6.川北醫學院形態學研究所，四川 南充 637000)

腹腔粘連是外科腹部手術的常見并發癥之一，可能導致慢性腹痛、腹脹、腸梗阻和腸壞死等諸多后果[1]，防止腹腔粘連成為臨床醫學面臨的亟待解決重要問題之一[2]。而應用聚合物膜、凝膠等生物材料對術后腹腔粘連的防治是解決這一問題的重要手段[3-4]。動物模型是粘連機制研究及對防治粘連手段進行效果評價的重要載體，因此，制作穩定、可重現性高的腹腔粘連動物模型就顯得尤為重要。常見腹腔粘連動物模型有大鼠盲腸摩擦模型、回腸剝離模型等單一損傷模型及盲腸-腹壁粘連模型等多損傷模型[5]。后一種模型常見諸于膜狀防粘連材料效果驗證研究中[6-7]。在既往對自行研制的膜狀防粘連材料效果驗證工作中，本小組也采用了大鼠盲腸-腹壁多損傷動物模型，通過長期觀察發現，術中盲腸暴露時間以及盲腸-腹壁損傷程度可對該模型最終的粘連率有較大影響。為此，本小組擬通過探討盲腸暴露時間和盲腸-腹壁損傷程度對大鼠盲腸-腹壁粘連模型的成模率的影響，以期得到制備穩定模型的操作方法。

1 材料與方法

1.1 材料

體重為195～210 g清潔級SD大鼠27只來自于川北醫學院實驗動物中心[SCXK(川)2013-18]，手術在川北醫學院實驗動物中心進行[SYXK(川)2013-076]，實驗過程對動物的處置符合相關動物倫理學要求。手術材料：無菌干紗布(40 mm ×50 mm)、醫用脫脂棉(原南昌美芳醫療器械廠)、一次性注射器(江西洪達醫療器械集團有限公司)、4.0可吸收性縫線(VICRYL Plus，強生醫療器材有限公司)、血管鉗、剪刀、持針器、鑷子、手術刀柄、手術刀片、止血鉗等(均采用高壓蒸汽法滅菌)。藥物：氯化鈉注射液(四川科倫藥業股份有限公司)、碘伏消毒液(四川伊潔士醫療科技有限公司)、醫用75%酒精(四川金山制藥有限公司)、注射用頭孢匹胺鈉(山東魯抗醫藥股份有限公司)。

1.2 方法

將27只大鼠隨機分為A、B、C 3組，每組各9只(表1)。術前12 h禁食，手術當日禁水。準確稱重后采用3%戊巴比妥鈉(0.69 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉后進行腹部備皮，仰臥位固定于手術臺上，常規消毒后鋪無菌巾，良好地暴露腹部手術區域。于恥骨聯合上1.5 cm沿腹正中線向上做3 cm 切口，逐層打開腹腔，提出盲腸，置于無菌巾上，用手術刀片刮傷盲腸粘膜，致1.5 ×1.5 cm 大小創面(避開肉眼可見血管)，A組及B組見片狀出血，C組見點狀出血；回納盲腸，暴露左側腹壁，于盲腸損傷對應部位以手術刀片刮傷腹壁，致1.5×1.5 cm 大小創面，A組及B組見片狀出血，C組見點狀出血(圖1)。再次取出盲腸，A組暴露至15 min，B組與C組暴露至25 min，用4-0可吸收性縫線經腸系膜將其固定于腹壁，使損傷面對齊，分層縫合關腹。

術后均予以單籠飼養(20～25 ℃保暖)，并于手術前4 d通過腹腔注射給予頭孢匹胺鈉(1次/d，0.25 g/kg)。術后第8 d，采用頸椎脫臼法處死實驗大鼠，劍突下 “[” 型切口開腹。觀察盲腸-腹壁粘連情況，統計各組粘連與未粘連大鼠數量，并拍照記錄。同時，取粘連處組織(若未粘連，取創傷處腹壁組織)，用4%中性甲醛固定。對組織進行梯度乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋處理后，切片。蘇木精-伊紅染色后于顯微鏡下觀察盲腸、腹壁組織損傷深度，并根據炎性細胞數目及浸潤面積確定實驗部位炎癥浸潤情況。

表1 盲腸-腹壁粘連模型動物分組情況

1.3 統計學分析

采用SPSS 17.0 軟件，運用χ2檢驗四格表的Fisher確切概率法進行統計學顯著性檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠術后一般情況及盲腸-粘連模型粘連率比較

實驗過程中大鼠切口愈合均良好，無感染，縫線自然脫落。術后早期大鼠的活動受限、被動仰臥位，術后24 h，各組動物一般狀態較差，活動少，少量進水和食物。術后2 d后各組動物一般狀態、活動、飲水和進食已基本正常。各組大鼠造模7 d后，盲腸暴露時間為25 min、盲腸-腹壁重度損傷的B組粘連率(88.9%)明顯大于A組(11.1%)和C組(33.3%)，經χ2檢驗四格表的Fisher確切概率法檢驗(PA-B=0.003，PB-C=0.05)，A與B組、B與C組之間差異有統計學意義(P<0.05)。此外，與B組相比，減少盲腸暴露時間導致模型粘連率下降77.8%，減弱損傷程度導致模型粘連率下降55.6%。見表2。

表2 實驗各組大鼠盲腸-粘連模型粘連率比較

2.2 鏡下觀察各組大鼠粘連組織病理切片

對比A組與C組實驗大鼠，B組實驗大鼠盲腸-腹壁損傷部位出現大量纖維結締組織增生，炎性細胞數目及浸潤面積均高于A、C兩組大鼠損傷部位。A組與C組實驗大鼠損傷部位也出現炎纖維增生和炎性細胞浸潤，但數目及浸潤面積均不及B組，可見B組實驗大鼠損傷部位炎癥浸潤情況最嚴重。對實驗大鼠盲腸腹壁損傷程度的統計顯示，在盲腸暴露時間均為25 min 的前提下，有88.9%的重度損傷實驗大鼠盲腸與腹壁肌層受損，而在輕度損傷實驗大鼠中這一比例降至33.3%。見圖2及表3。

表3 盲腸暴露時間為25min的B組及C組顯微鏡下損傷深度觀察

3 討論

腹腔粘連是腸管、腹壁等部位損傷后組織愈合修復生理過程的一部分[6]。手術創傷等因素引發急性炎癥反應導致富含纖維蛋白酶原和纖維蛋白的滲出液沉積、凝結為纖維網狀物覆蓋于受刺激組織表面并與周圍組織發生粘合。成纖維細胞在粘合處增殖并分泌大量膠原最終導致損傷組織間的緊密粘連。正常情況下，滲出液尚有纖維蛋溶解功能，與纖維沉積形成動態平衡，從而避免組織間的嚴重粘連。上述平衡是否失調從而導致粘連發生主要取決于局部損傷程度及炎癥反應程度[8-10]。據此以及在實際操作過程中的觀察總結，本小組認為操作過程中盲腸暴露時間及盲腸-腹壁損傷程度對大鼠盲腸-腹壁粘連模型最終是否粘連有較大影響。 本研究結果顯示，A組實驗大鼠與B組實驗大鼠同為重度損傷實驗組，幾乎均傷及肌層，而B組粘連率顯著高于A組，導致這一結果的主要原因是B組實驗大鼠盲腸暴露時間更長，組織脫水及壞死發生幾率增高，并且動物實驗操作環境難以做到絕對無菌，更長的暴露時間也帶來了更高的細菌感染風險。以上因素均會加重實驗大鼠的炎癥反應，而術后組織切片HE染色結果也證實了這一點。與A組實驗大鼠相比，B組實驗大鼠粘連組織可見大量炎癥細胞浸潤及纖維沉積。C組實驗大鼠與B組實驗大鼠均為盲腸暴露25 min組，B組粘連率顯著高于C組實驗大鼠，源于B組實驗大鼠損傷程度重于C組。C組實驗大鼠肌層損傷率僅為33.3%，意味著大部分C組實驗大鼠在造模過程中僅漿膜層受損，漿膜層具有修復快的特點，快速修復避免了炎癥細胞的大量浸潤[8]。C組實驗大鼠損傷組織切片HE染色結果表明，與B組實驗大鼠相比，受損組織并未見大量炎癥細胞浸潤。而B組實驗大鼠大部分肌層受損，壞死的肌肉組織需要大量中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞吞噬清除。在上述實驗中無論是增加盲腸暴露時間還是加重損傷程度均加重了了損傷局部組織的炎癥反應，導致炎癥細胞的大量浸潤，炎癥細胞可分泌多種細胞因子刺激成纖維細胞大量增殖，分泌大量膠原蛋白從而導致纖維沉積及組織間粘連的發生[11]。因此，同時保證損傷程度達重度及盲腸暴露時間達25 min最有利于得到最終粘連率高的穩定的大鼠盲腸-腹壁粘連模型。

綜上，在大鼠盲腸-腹壁粘連模型制備過程中盲腸暴露時間與盲腸-腹壁損傷程度對最終粘連率有較大影響。將大鼠盲腸、腹壁刮傷至片狀出血，空氣中暴露25 min，可得到粘連率達88.9%的高效穩定的大鼠盲腸-腹壁粘連模型。