全麻聯(lián)合硬膜外阻滯對比格犬腦脊液中NSE、Aβ及腦電波的影響

衛(wèi)曉娜，程晶晶，王向輝，陳永學(xué)

(邯鄲市中心醫(yī)院麻醉科，河北 邯鄲 056002)

麻醉的過程是主動干預(yù)并不斷調(diào)控內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的動態(tài)過程。麻醉會產(chǎn)生傷害性刺激，機(jī)體會對傷害性刺激做出一系列反應(yīng)，如表現(xiàn)為疼痛、呼吸及心率增快、血壓升高及出汗等。暫時的應(yīng)激反應(yīng)為良性作用，可增強(qiáng)心血管系統(tǒng)功能，保證重要臟器的血流灌注和支持應(yīng)急后的能量供應(yīng)。而長久的應(yīng)激反應(yīng)則為病理狀態(tài)，會產(chǎn)生一系列非特異性全身反應(yīng)[1-3]，如胃腸道功能紊亂、肝功能障礙、心律失常、分解代謝增加、體溫升高、代謝性酸中毒和血液凝固性增加等。但合理的麻醉措施可有效控制應(yīng)激反應(yīng)。本文旨在探討全麻聯(lián)合硬膜外阻滯對比格犬腦脊液中NSE、Aβ及腦電波形的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

選用上海基爾頓生物公司提供的健康一級比格犬40只，體重8～9 kg，雌雄不限。數(shù)表法隨機(jī)分為全麻組和全麻聯(lián)合硬膜外阻滯組，每組20只。

1.2 全麻聯(lián)合硬膜外阻滯模型的建立

所有比格犬實(shí)驗(yàn)前一晚禁食，自由飲水。麻醉前常規(guī)監(jiān)測血壓、心率、心電圖、體溫和開放靜脈通路。犬的實(shí)驗(yàn)操作均在基礎(chǔ)麻醉下進(jìn)行，即應(yīng)用安定10 mg肌注，待犬進(jìn)入深度睡眠后行硬膜外穿刺。經(jīng)下腔靜脈注入50 mL平衡液后全麻組選擇L1-L2椎間隙行硬膜外穿刺置管，先注入2%鹽酸利多卡因10 mL，5 min后實(shí)施全麻誘導(dǎo)[4]。全麻組和全麻聯(lián)合硬膜外阻滯-硬膜外鎮(zhèn)痛組全麻用藥相同，全麻誘導(dǎo)選用咪達(dá)唑侖0.25 mg/kg、芬太尼0.01 mg/kg、異丙酚5 mg/kg、氯化琥珀膽堿5 mg/kg。麻醉維持靜脈泵注異丙酚25 mg·kg-1·h-1，并吸入5%異氟醚。全麻聯(lián)合硬膜外阻滯組硬膜外注射0.375%布比卡因25 mL，5 min后注入2%鹽酸利多卡因25 mg。兩組均在手術(shù)結(jié)束前10 min停止全麻用藥。實(shí)驗(yàn)犬全麻后均行氣管內(nèi)插管，連接小動物呼吸機(jī)，吸入40%氧氣，呼吸參數(shù)：潮氣量10 mL/kg，呼吸頻率20次/min。待比格犬麻醉后分離左側(cè)頸總動脈和右側(cè)頸外靜脈。用20 G動脈穿刺針行動脈插管，監(jiān)測實(shí)時平均動脈壓。并行右側(cè)外靜脈穿刺插管，用于液體輸注。實(shí)驗(yàn)犬在麻醉狀態(tài)下行小腸部分切除端端吻合術(shù)。

1.3 腦脊液和血清的制備

待模型完成后，對兩組比格犬在L1-L2椎間隙進(jìn)行脊椎穿刺術(shù)，留取腦脊液5 mL于無熱源和內(nèi)毒素的試管中，混勻后采用低溫3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂靡淮涡哉婵詹裳懿扇§o脈血5 mL，靜置20 min，血液完全凝固后使用離心機(jī)3 500 r/min離心15 min，取上清液2 mL于EP管中，放置-80 ℃冰箱保存。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)的測定 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定比格犬腦脊液和血清中NSE的含量，用純化后的抗體包被96孔板，制成固相載體，往包被抗NSE抗體的微孔中按照順序添加標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)記過的NSE抗體，經(jīng)徹底洗滌后用底物3,5,3′,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色。顏色的深淺與與樣品中NSE的濃度呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度，計(jì)算NSE的濃度。該操作嚴(yán)格按照NSE檢測試劑盒說明書進(jìn)行。各試劑使用前在室溫中平衡1 h左右。樣品應(yīng)從-70 ℃冰箱取出并室溫放置1 h以保證樣品溫度與室溫相同。樣品和試劑使用時需混勻，盡量避免氣泡。(1)設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔，分別對應(yīng)添加100 μL于酶標(biāo)板底部，加板37 ℃孵育2 h。(2)丟棄液體并甩干，每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100 μL，加板37 ℃孵育1 h。(3)使用緩沖液反復(fù)清洗3次，每次浸泡2 min，并甩干。(4)每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記工作液100 μL，37 ℃孵育1 h。(5)使用緩沖液反復(fù)清洗3次，每次浸泡2 min，并甩干。(6)加入顯色劑TMB，37 ℃避光孵育30 min。(7)依序向反應(yīng)孔加入50 μL終止液，終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450 nm處測定每孔的光密度(OD值)。

1.4.2 Aβ的測定 采用ELISA法測定腦脊液和血漿中淀粉樣蛋白(amyloid protein，Αβ)含量。樣品2 mL置于聚丙烯EDTA抗凝管中，低溫3 000 r/min離心10 min。將試劑盒及待測樣品置于室溫1 h，加入蛋白酶抑制劑-苯磺酸防止一系列蛋白酶降解Αβ。配制標(biāo)準(zhǔn)品Αβ濃度為：5、10、15、30、62.5、125、250和500 ng/mL，制作標(biāo)曲線，通過標(biāo)曲計(jì)算樣品中Αβ濃度。說明書具體操作如下：(1)取出已經(jīng)包被的96孔板，設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔，分別對應(yīng)添加100 μL于酶標(biāo)板底部，半透膜封存，室溫孵育2 h。(2)丟棄液體并甩干，每孔加一抗工作液100μL，半透膜封存，室溫孵育2 h。(3)酶標(biāo)板上每孔加入二抗100 μL，半透膜封存，室溫孵育2 h，(4)使用緩沖液反復(fù)清洗3次，每次浸泡2 min，并甩干。(5)每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記工作液100 μL，37 ℃孵育1 h。(6)使用緩沖液反復(fù)清洗3次，每次浸泡2 min，并甩干。(7)加入顯色劑TMB，室溫避光孵育30 min。(8)依序向反應(yīng)孔加入50 μL終止液，終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450 nm處測定每孔的光密度(OD值)。

1.4.3 腦電圖的測定 兩組比格犬麻醉后，立即連接電極并進(jìn)行腦電圖測定。采用八道腦電圖儀。測定時將電極的鱷魚夾與注射器正頭連接后刺入皮下，采用7個電極，分別連接與鼻竇上方及左右額、頂、枕部。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 基本情況對比

在本研究中，全麻組中雌性比格犬8只，雄性比格犬12只，平均體重為(8.46±0.27)kg；全麻聯(lián)合硬膜外阻滯-硬膜外鎮(zhèn)痛組中雌性比格犬10只，雄性比格犬10只，平均體重為(8.73±0.35)kg。兩組比格犬基本情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 NSE測定結(jié)果

全麻組腦脊液中NSE的含量為(69.33±11.51)μg/mL，全麻聯(lián)合硬膜外阻滯組其含量為(48.64±8.47)μg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。全麻組血液中NSE為(73.48±10.23)μg/mL，全麻聯(lián)合硬膜外阻滯組其含量為(47.69±11.07)μg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 Αβ的測定結(jié)果

全麻組腦脊液中Αβ為(110.34±14.37)μg/mL，全麻聯(lián)合硬膜外阻滯組的含量為(80.37±8.06)μg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。全麻組血液中Αβ為(120.75±15.14)μg/mL，全麻聯(lián)合硬膜外阻滯組的含量為(91.63±7.48)μg/mL，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 兩組腦電波變化

全麻組腦電波周期和振幅分別為(3.88±0.23)c/s和(4.32±0.41)μV(圖1)，全麻聯(lián)合硬膜外阻滯組的周期和振幅分別為(3.41±0.17)c/s和(3.52±0.62)μV(圖2)，較全麻組均有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

全麻可抑制大腦皮層的興奮，但不能有效阻斷手術(shù)區(qū)域傷害性刺激向交感神經(jīng)低級中樞傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)興奮，所以阻滯手術(shù)創(chuàng)傷上行性傳導(dǎo)是控制應(yīng)激反應(yīng)的相對較好的選擇[5-6]。此外，動物模型還表明，電針可以通過保持免疫反應(yīng)能力減輕手術(shù)期間的應(yīng)激反應(yīng)，從而獲得更好的長期療效[7-9]。全麻-硬膜外聯(lián)合麻醉常應(yīng)用于大型胸腹外科。大腦是人體耗氧量最多的器官，由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元內(nèi)拮抗氧化應(yīng)激的物質(zhì)(如過氧化氫酶、谷胱甘肽及維生素E等)較少，使得神經(jīng)元易于受到自由基的攻擊[10-12]。神經(jīng)元特異性烯醇化酶又名磷酸烯醇轉(zhuǎn)化酶，是糖酵解的關(guān)鍵酶。NSE是中樞神經(jīng)里面的一種重要蛋白質(zhì)，定位于腦灰質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞和末梢神經(jīng)元。當(dāng)腦神經(jīng)元損傷時，神經(jīng)細(xì)胞受損、變性和瓦解，血腦屏障通透性就會增強(qiáng)，NSE被釋放至腦脊液和血液中。由于腦膠質(zhì)細(xì)胞和其他神經(jīng)組織中不含NSE，推測NSE可能是檢測腦內(nèi)神經(jīng)元損傷的客觀指標(biāo)。

在本實(shí)驗(yàn)中，通過建立全麻和全麻聯(lián)合硬膜外阻滯模型，通過測定兩組比格犬腦脊液和血漿中的NSE和Αβ的含量和腦電波形變化，發(fā)現(xiàn)全麻聯(lián)合硬膜外阻滯組腦脊液和血漿中的NSE和Αβ的含量較全麻組降低。全身麻醉狀態(tài)下腦血流明顯降低，既干擾了腦組織代謝，又增加了血腦屏障的通透性，造成了神經(jīng)元和腦膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，最終導(dǎo)致術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)的發(fā)生。而全麻聯(lián)合硬膜外阻滯可阻滯交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)，直接降低傷害性刺激所導(dǎo)致的神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)，將應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控在一個較低的水平。硬膜外麻醉可減少不良反應(yīng)的發(fā)生和免疫抑制因素的發(fā)生，并能更好地緩解術(shù)后疼痛。全麻后腦脊液中的NSE發(fā)生變化可能是神經(jīng)元受到損傷后，NSE在細(xì)胞內(nèi)的分布會有變化。在缺血狀態(tài)下，神經(jīng)元存貨需要NSE提供大量ATP以滿足核酸合成的需要，同時NSE的間接產(chǎn)物丙酮酸也能夠保護(hù)細(xì)胞核免受過氧化物的損害，因此一部分NSE會轉(zhuǎn)移至細(xì)胞間隙中從而導(dǎo)致體液中濃度增高。NSE不與細(xì)胞內(nèi)的肌動蛋白結(jié)合，較易釋放，這為腦組織損傷后檢測腦脊液中NSE的變化提供了依據(jù)[13-15]。NSE不與細(xì)胞膜結(jié)合，當(dāng)神經(jīng)元破壞時，直接釋放至腦脊液中，并通過損傷的血-腦脊液屏障漏至血漿中。已通過動物實(shí)驗(yàn)證明，NSE是腦組織損傷后的特異性蛋白，也是腦組織破壞后較合適的生化標(biāo)記物，其在腦脊液或血液中質(zhì)量濃度的高低可反映神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的損害程度，為判斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害程度提供了定量信息。同樣淀粉樣蛋白與NSE的原理相同。腦電圖也說明全麻聯(lián)合硬膜外阻滯組比全麻組的波形穩(wěn)定[16]。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明全麻聯(lián)合硬膜外阻滯較全麻對大腦的損傷較低，更易于對大腦的保護(hù)。

綜上所述，全麻聯(lián)合硬膜外阻滯與全麻比較，其可降低腦脊液和血漿中的NSE和Αβ的含量，從而起到降低大腦損傷的作用。