飼用枯草芽孢桿菌JY24發酵條件的優化

孔利華， 高書鋒， 雷 平， 曾發姣， 繆 東， 周映華，龔 平， 周小玲，曾 奧， 鄔理洋， 舒 燕， 胡 丹， 王升平， 劉惠知

(湖南省微生物研究院， 湖南 長沙 410009)

近年來，畜禽養殖不斷向規模化、集約化發展，抗生素在飼料中普遍使用，導致了諸多弊端，破壞畜禽腸道正常菌群平衡，引起內源性及二重感染，嚴重導致畜禽產品及環境中藥物的殘留[1-3]。當前，隨著飼料中抗生素的全面禁止，迫切需要新的替代品。中藥和微生態制劑作為兩大類飼料添加劑，具有純天然、無毒害、無藥殘、安全方便及功能全面等優點，已成為國內外研究的熱點[4-7]。

黃芩具有多種藥理活性，包括抗炎[8-9]、抗氧化[10]、抗微生物[11]、抗病毒[12-13]、清除自由基[14]等。其主要成分為黃芩苷，其次為黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素；黃芩苷不易被動物機體直接吸收，需經腸道菌群作用水解成苷元黃芩素后，才能發揮其藥效作用[15]；大量臨床藥效試驗證明，黃芩素的藥理作用強于黃芩苷。由于黃芩中游離型苷元(黃芩素)的含量很低(約1%)，主要以結合型的糖苷(黃芩苷)形式存在(含量大于10%)，導致游離型苷元遠不能滿足市場需求和臨床應用。因此，將黃芩苷轉化為黃芩素，提高其藥理活性具有重大的實際意義。目前，黃芩素大多從藥材中直接提取，近年來雖有利用側耳菌[16]、黑曲霉[16-17]、米曲霉[18]、羅爾夫青霉[19]、納豆芽孢桿菌[20]及短乳桿菌[21]對黃芩進行生物轉化的研究報道，但轉化過程中所用菌種多屬真菌類，難免會產生安全性問題，而作為益生菌的納豆芽孢桿菌，卻非腸源固有土著菌種，在動物腸道中能否定殖、發揮益生作用還不明確。

JY24菌株是課題組從雞源腸道內容物中篩選得到的1株產β-葡萄糖醛酸苷酶的枯草芽孢桿菌，其可將黃芩苷轉化為黃芩素。JY24菌株產芽孢，能耐受飼料加工過程中的高溫，并降低運輸保藏過程中的失活現象；對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等腸道致病菌具有抑制作用，有益于降低畜禽腹瀉率；同時產淀粉酶、蛋白酶，可起到輔助消化、促進生長的作用；源于腸道，具有天然的耐受胃腸道和定殖優勢，經體外模擬試驗，對人工胃液、腸液均有較強耐受性。JY24菌株是微生態制劑和中藥黃芩發酵轉化研發領域內潛在的理想菌株，但還需要對該菌制劑及與黃芩聯用對肉仔雞臨床應用效果進行研究，并有必要對該菌株發酵工藝進行研究。鑒于此，采用單因素試驗與正交試驗相結合的方法對其搖瓶發酵條件和培養基組成進行篩選，并在此基礎上優化培養基成分，旨在為JY24菌株的中試生產和產品研發奠定基礎。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1菌種枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)JY24菌株，由湖南省微生物研究院動物營養微生物室從雞腸道內容物中分離、篩選和保藏。

1.1.2培養基

1) 斜面培養基。蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

2) 種子培養基。蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

3) 基礎發酵培養基。葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，磷酸二氫鉀1.0 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.1.3主要設備LRH-400A生化培養箱、ZQZY-AS9恒溫培養振蕩器、GZX-9146MBE電熱恒溫干燥箱、BH-2型OLYMPUS顯微鏡、LS-30高壓滅菌鍋和PHS-3C型數顯酸度計。

1.2方法

1.2.1菌種預處理

1) 菌種活化。將枯草芽孢桿菌JY24菌株活化后轉接到斜面培養基，33℃培養24 h備用。

2) 種子液制備。取3環活化斜面菌種接入裝有100 mL種子培養基的500 mL三角瓶中，33℃、200 r/min培養18 h備用。

1.2.2枯草芽孢桿菌最佳發酵條件優化試驗

1) 轉速。試驗設4個處理，即搖床轉速為150 r/min、180 r/min、210 r/min和240 r/min。按1%的接種量將種齡為18 h的枯草芽孢桿菌種子液轉接到裝液量為20%、pH 7.0的發酵培養基上，在33℃條件下培養48 h。采用梯度稀釋法[22]檢測發酵液的活菌數，確定搖床最佳發酵轉速。

2) 裝液量。試驗設5個處理，即發酵培養基裝液量為10%、15%、20%、25%和30%。按1%的接種量將種齡為18 h的枯草芽孢桿菌種子液轉接到初始pH 7.0的不同裝液量發酵培養基上，置33℃、240 r/min搖床發酵48 h，檢測發酵液的活菌數，確定最佳裝液量。

3) 發酵時間。試驗設7個處理，即發酵時間為18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h和54 h。按1%的接種量將種齡為18 h的枯草芽孢桿菌種子液轉接到裝液量為10%、初始pH 7.0的發酵培養基上，置33℃、240 r/min搖床發酵，檢測發酵液的活菌數，確定最佳發酵時間。

4) 接種量。試驗設5個處理，即接種量分別為1%、3%、5%、7%和10%。將種齡為18 h的枯草芽孢桿菌種子液分別按相應接種量轉接到裝液量為10%、pH 7.0的發酵培養基上，置33℃、240 r/min搖床發酵36 h，檢測發酵液的活菌數，確定最佳接種量。

5) 發酵溫度。試驗設5個處理，即發酵溫度分別為31℃、33℃、35℃、37℃和39℃。以3%的接種量將種齡為18 h的枯草芽孢桿菌種子液接入初始pH 7.0、裝液量為10%的發酵培養基，置240 r/min搖床發酵36 h，檢測發酵液的活菌數，確定最佳發酵溫度。

6) 初始pH。試驗設7個處理，即初始pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。以3%的接種量將種齡為18 h的枯草芽孢桿菌種子液接入裝液量為10%的不同初始pH發酵培養基，置35℃、240 r/min搖床發酵36 h，檢測發酵液的活菌數，確定發酵培養基最佳初始pH。

1.2.3枯草芽孢桿菌發酵培養基組分的篩選

1) 碳源。以基礎發酵培養基中葡萄糖的碳含量計算碳濃度，將基礎發酵培養基中碳源分別用蔗糖、淀粉、紅糖、糖蜜和麥麩替換，按1.2.2篩選的最佳發酵條件進行發酵。檢測發酵液的活菌數，確定最佳碳源。

2) 氮源。以基礎發酵培養基中蛋白胨的氮含量計算氮濃度，將基礎發酵培養基中的氮源分別用酵母粉、酵母膏、黃豆粉、牛肉膏、硝酸鉀和碳酸銨替換，按1.2.2篩選的最佳發酵條件進行發酵，測定發酵液的活菌數，確定最佳氮源。

3) 磷源。以基礎發酵培養基中磷酸鹽的磷含量計算磷濃度，將基礎發酵培養基中的磷源分別用磷酸二氫鉀、1/2磷酸二氫鉀+1/2磷酸氫二鉀、磷酸氫二鉀替換，按1.2.2篩選的最佳發酵條件進行發酵，測定發酵液的活菌數，確定最佳磷源。

4) 無機鹽。去掉基礎發酵培養基中的無機鹽，分別添加0.002 mol/L的硝酸鉀、氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸錳、三氯化鐵、硫酸亞鐵和硫酸銅，以不加任何無機鹽的發酵培養基為對照(CK)，按1.2.2篩選的最佳發酵條件進行發酵，測定發酵液的活菌數，確定最佳無機鹽類。

1.2.4發酵培養基組成的優化根據JY24菌株發酵培養基組分的單因素試驗結果，選取最佳碳源、氮源和磷源及2種對發酵水平影響較大的無機鹽類，采用5因素4水平的正交試驗設計，選用L16(45) 正交表進行正交試驗(表1)，對試驗結果進行直觀分析和方差分析，優化培養基組分。

表1 發酵培養基正交試驗因素和水平設計

2結果與分析

2.1枯草芽孢桿菌的發酵條件

從圖1看出不同培養條件對枯草芽孢桿菌發酵水平(發酵液活菌數)的影響不同。

2.1.1轉速隨發酵搖床轉速的增大，發酵液活菌數呈增加趨勢。轉速為240 r/min時，發酵液活菌數最高，為7.5×108CFU/mL；轉速為150 r/min時，發酵液活菌數最低，為5.2×108CFU/mL。由于轉速越大，發酵液溶氧越高，因此在發酵過程中盡可能提高轉速以提高好氧菌的發酵水平。試驗初步確定搖床最佳轉速為240 r/min。

2.1.2裝液量隨著裝液量的增加，發酵液活菌數逐漸減小。裝液量為10%時，發酵液活菌數最高，為9.5×108CFU/mL，裝液量為25%和30%時，發酵水平最低，均為4.0×108CFU/mL。搖瓶裝液量越少，相對溶氧量越大，好氧菌生長代謝旺盛，有利于發酵水平的提升；但裝液量太少，發酵過程中發酵液會有一定蒸發，易造成試驗結果偏差。因此，初步確定最佳裝液量為10%。

2.1.3發酵時間隨發酵時間的延長，發酵水平呈先升后降趨勢。其中，發酵時間為36 h時發酵液活菌數最高，為1.2×109CFU/mL。細菌群體的生長規律一般可分為遲緩期、對數期、穩定期和衰亡期4個時期，穩定期的活菌數量最高并維持穩定；當細菌生長進入穩定期時，即可終止發酵。因此，初步確定最佳發酵時間為36 h。另，接種物種齡處于對數期時，接種后能夠迅速繁殖，接種非對數期種齡接種物則延長發酵過程，故在發酵時間優化時，應確保接種物種齡處于對數期。

2.1.4接種量隨接種量的增加，發酵液活菌數呈先升后降趨勢。其中，接種量為3%時，發酵液活菌數較高，為1.4×109CFU/mL；接種量增加，發酵液活菌數減少，當接種量為7%時，發酵水平最低，發酵液活菌數為2.0×108CFU/mL。接種量對發酵水平的影響相對較大，接種量大可以實現快速啟動，但接種量過多易導致菌種吸收不到足夠的營養而影響生長繁殖；接種量少則延長發酵周期，增加能耗和雜菌污染機會[23]。接種量過多或過少均不利于菌體生長，因此，初步確定最佳接種量為3%。

2.1.5溫度不同溫度對枯草芽孢桿菌發酵水平有較大影響，隨發酵溫度的升高，發酵水平呈先升后降趨勢。其中，發酵溫度為35℃時，發酵液活菌數最高，為1.5×109CFU/mL；溫度繼續升高，發酵水平降低；當溫度為39℃時發酵水平最低，發酵液活菌數為1.0×108CFU/mL。溫度對微生物的影響具體表現為影響酶活性，進而影響細胞物質的合成；影響細胞質膜的流動性，影響物質的運輸、吸收和代謝；影響物質的溶解性，同時影響到物質的吸收。微生物無時不在改變生長速率，以適應環境溫度的變化，每個菌株都有各自的最低、最適和最高生長溫度。因此，初步確定最佳發酵溫度為35℃。

2.1.6初始pH不同初始pH對發酵水平影響較大，隨pH的升高，發酵水平呈先升后降趨勢。其中，pH 7.0時，發酵液活菌數最高，為1.7×109CFU/mL；pH 5.5和pH 8.0時，搖瓶發酵生長均較差，發酵液活菌數分別為0.01×108CFU/mL和0.14×108CFU/mL。不同初始pH的發酵液發酵水平相差較為懸殊，原因在于pH通過影響酶促反應、細胞質膜的透性、膜結構的穩定性和物質的溶解性或電離性等影響物質的吸收，進而影響細菌的生長速率，最終直接影響發酵水平。因此，初步確定最佳初始pH為7.0。

圖1不同培養條件枯草芽孢桿菌活菌數

2.2枯草芽孢桿菌的發酵培養基成分

從圖2看出不同培養基組成對枯草芽孢桿菌發酵水平(發酵液活菌數)的影響存在差異。

2.2.1碳源不同碳源處理發酵液的活菌數為蔗糖>淀粉>紅糖>葡萄糖>糖蜜>麥麩。蔗糖為碳源時，發酵液活菌數最高，為2.5×109CFU/mL；其次是淀粉，活菌數為2.3×109CFU/mL；其他種類碳源發酵水平均相對較低。不同菌株利用碳源物質具有選擇性，利用碳源物質的能力也有較大差別，糖類一般是其較容易利用的碳源和能源物質。該試驗初步確定最佳碳源為蔗糖。

2.2.2氮源有機氮源對發酵水平起關鍵作用，酵母膏作為氮源時，發酵液活菌數最高，為8.6×109CFU/mL；黃豆粉和酵母粉作為氮源時，活菌數較高，分別為5.3×109CFU/mL和4.0×109CFU/mL；其他種類氮源發酵水平較低。硝酸鉀和硫酸銨2種無機氮源發酵水平最差，分別為0.25×108CFU/mL和0.10×108CFU/mL。因此，初步確定最佳氮源為酵母膏。

2.2.3磷源不同磷源處理發酵液的活菌數為磷酸二氫鉀>1/2磷酸二氫鉀+1/2磷酸氫二鉀>磷酸氫二鉀。磷酸二氫鉀為磷源時，發酵液活菌數最高，為4.8×109CFU/mL；磷酸氫二鉀為磷源時，活菌數最低，為2.6×109CFU/mL。因此，初步確定最佳磷源為磷酸二氫鉀。

2.2.4無機鹽氯化鈣、硫酸鎂、硫酸錳、硝酸鉀和氯化鈉為無機鹽時，其發酵液活菌數分別為2.2×109CFU/mL、1.8×109CFU/mL、1.4×109CFU/mL、1.2×109CFU/mL和1.0×109CFU/mL，均較CK高，表明，其對發酵水平具有不同程度的促進作用；添加三氯化鐵、硫酸亞鐵和硫酸銅時，發酵液活菌數較CK低，表明，其對發酵水平具有不同程度的抑制作用。因此，最佳無機鹽選擇氯化鈣和硫酸鎂。

圖2不同培養基組成枯草芽孢桿菌的活菌數

2.3發酵培養基組分的優化

從表2看出，方案10(A3B2C4D3E1)的活菌數最高，為1.58×1010CFU/mL；其次是方案11(A3B3C1D2E4)，為1.35×1010CFU/mL。從表3可知，影響發酵水平各因素的關系為蔗糖(A)>酵母膏(B)>硫酸鎂(E)>磷酸二氫鉀(C)>氯化鈣(D)，因素間最佳水平組合為A3B3C4D2E1，該組合不在設計方案中。驗證試驗結果表明，最佳組合A3B3C4D2E1條件下，發酵液活菌數達1.73×1010CFU/mL，較方案10(A3B2C4D3E1)和方案11(A3B3C1D2E4)的活菌數高。表明，最佳發酵培養基組成為蔗糖12.0 g/L，酵母膏12.0 g/L，磷酸二氫鉀1.25 g/L，氯化鈣0.22 g/L，硫酸鎂0.30 g/L。

經方差分析，F蔗糖=10.275>F0.05(3，3)=9.28，表明，蔗糖作用達顯著水平，在發酵過程中應嚴格控制蔗糖用量，其他因素作用未達顯著水平。

表2 枯草芽孢桿菌培養基優化采用的L16(45)正交試驗方案與結果

表3枯草芽孢桿菌活菌數的直觀分析

注：K，各因素某一水平結果之和的平均數；R，極差。

Note:K，the average of sum of the results at a certain level of each factor;R，range.

3結論與討論

研究結果表明，JY24菌株最佳發酵條件為轉速240 r/min，溫度35℃，初始pH7.0，裝液量10%，接種量3%，發酵時間36 h；最佳發酵培養基組成為蔗糖12.0 g/L，酵母膏12.0 g/L，磷酸二氫鉀1.25 g/L，氯化鈣0.22 g/L，硫酸鎂0.30 g/L。該條件下，發酵液活菌數達1.73×1010CFU/mL。與對照相比，不同無機鹽對發酵水平具有促進或抑制作用，原因與不同菌株在發酵過程中為適應環境變化對不同無機元素的不同需求量有關。無機鹽通常具有維持細胞生物大分子和細胞結構穩定性、參與各種酶活性中心組成、調節培養基滲透壓和pH、控制細胞氧化還原電位等作用[24]。在發酵試驗中，在注重碳、氮源優化的同時，也應特別注意對某些無機鹽尤其是微量元素進行優化，有時微量元素也會成為制約、抑制菌株新陳代謝等發酵指標的一個關鍵因素。

陳莉等[25-26]報道，枯草芽孢桿菌K-6-9和NBF-809菌株液體發酵水平分別為1.40×109CFU/mL和3.98×109CFU/mL，發酵水平相對較低。趙達等[27-28]分別優化不同枯草芽孢桿菌菌株的液體發酵條件，發酵水平分別為1.05×1010CFU/mL和1.10×1010CFU/mL，發酵水平相對較高；管國強等[29]報道，枯草芽孢桿菌ZC1菌株液體發酵水平為3.69×1010CFU/mL，發酵水平相對很高。鄭雙鳳等[30-31]分別優化不同枯草芽孢桿菌菌株的高產芽孢發酵工藝，芽孢產量分別為7.33×109CFU/mL和1.43×1010CFU/mL。綜合看，不同枯草芽孢桿菌菌株發酵水平存在一定差異，對特定的菌株需要篩選適宜的培養基配方及發酵條件。下一步將對JY24菌株進行發酵放大和中試生產，進一步提升JY24菌株的發酵水平，同時確定一套發酵工藝參數。