貴州產白及組培瓶苗分級標準及其驗證

陳 磊， 唐成林， 熊 萬， 王禮科， 羅夫來， 趙 致

(1.貴州大學 農學院， 貴州 貴陽 550025; 2.貴州省藥用植物繁育與種植重點(工程)實驗室， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州省農業展覽館， 貴州 貴陽 550001)

白及〔Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.〕別名連及草，為蘭科多年生草本藥用植物[1]。喜潮濕，陰生環境下生長。原產于長江流域，主產于貴州、江西、四川、湖南等地[2]。白及以塊莖入藥，含有白及膠多糖、多酚類、菲類等物質，性苦，具有消腫生肌、收斂止血、消炎抗菌的藥理作用[3-6]。隨著中醫藥的發展，中藥材備受青睞，在貴州大規模栽培中藥材，但很多地方培育的種苗質量參差不齊。隨著市場需求的變化，對藥材種苗質量要求越來越高。因此，對白及組培瓶苗的質量進行等級劃分對貴州產白及組培瓶苗質量的分級、市場的銷售和栽培有著重要意義。近年來，對白及的研究主要集中在組織要培養[7-9]、種質資源[10-11]和藥理作用等方面[12-13]。白及種苗質量方面的研究相對較少，僅有張智慧[14]對云南產白及組培苗質量分級標準進行初步研究。目前，針對貴州產白及組培瓶苗質量等級的劃分和組培瓶苗質量與存活率關系的研究未見報道。為此，筆者以白及組培瓶苗為試驗材料，對組培瓶苗農藝性狀進行相關性分析、主成分分析和K-均值聚類分析，制定出貴州產白及組培瓶苗質量分級初級標準，通過組培瓶苗存活率、植株長勢等確定等級劃分的科學性與合理性，以期為貴州產白及組培瓶苗的質量分級、銷售、煉苗移栽提供參考和借鑒。

1材料與方法

1.1試驗材料

白及種子：由大方縣德馨堂中醫院提供。通過組培方法將白及種子培育成幼苗，再轉接到假鱗莖誘導培養基上培養100 d左右獲得具有根、莖、葉的完整白及組培瓶苗；栽培基質為椰子殼、蛭石和有機質，能很好的保持土壤的透氣性和排水效果，同時能為白及苗的生長提供所必須的營養元素。

1.2試驗方法

1.2.1白及組培瓶苗的分級將白及組培瓶苗從培養瓶中取出，隨機選擇完整的植株300株，對待分級組培瓶苗數量(300株)進行巴特利特球形檢驗，確定選擇的樣本數是否滿足質量分級的要求。測量植株假鱗莖直徑(X1)、株高(X2)、葉片數(X3)、葉寬(X4)、葉長(X5)、莖粗(X6)、根數(X7)等農藝形狀，將所測得數據進行相關性分析、主成分分析以及K-均值聚類分析，對白及組培瓶苗質量等級進行初步劃分，分級作為白及組培瓶苗的初級分級標準。

1.2.2白及組培瓶苗分級標準的驗證按照等級將白及組培瓶苗移栽至已配好的基質上，進行盆栽試驗，每盆5株，每個等級20盆，培養90 d， 比較不同等級白及組培苗的存活率、相對葉綠素含量(使用SPAD儀器進行測定)的變化，各等級白及植株假鱗莖、株高、葉長和葉寬的平均生長量以及出芽率和單株苗的新芽數的差異，考察不同等級白及組培瓶苗等級劃分的合理性。

存活率=(存活的苗數÷總苗數)×100%。

1.3數據統計與分析

采用Microsoft Office Excel2019對數據進行統計，利用SPSS23.0對白及組培苗的假鱗莖直徑、株高等指標進行相關性分析、主成分分析、K-均值聚類分析和作圖。

2結果與分析

2.1白及組培瓶苗等級的劃分

2.1.1白及農藝性狀指標分布頻率由圖1可知，除根數以外，假鱗莖直徑、株高、葉片數、葉寬、葉長和莖粗基本滿足正態分布，分別集中分布在2.5～7.5 mm、2～8.75 cm、3～4片、4～10 mm、0.75～6 cm和1.43～3.43 mm范圍。

圖1白及各農藝性狀指標頻率分布

Fig.1 Frequency distribution of various agronomic traits indicators ofBletilla

2.1.2白及組培瓶苗樣本數有效性檢驗經巴特利特球形檢驗，取樣足夠度的 Kaiser-Meyer-Olkin度量檢驗系數(KMO)為0.642>0.5，顯著性Sig(P)=0<0.05，說明樣本數結構效度合格，可以進行相關性分析、主成分分析和K-值聚類分析。

2.1.3白及組培瓶苗農藝性狀的相關性從表1可知，白及假鱗莖直徑與株高、葉寬、葉長及根數存在極顯著正相關，與莖粗存在顯著正相關，與葉片數存在相關性但并不顯著；株高與葉片數、葉寬、葉長、莖粗、根數均存在極顯著正相關；葉片數與葉寬、葉長、莖粗存在極顯著正相關，與根數存在相關性但不顯著；葉寬與葉長、莖粗、根數均存在極顯著正相關；葉長與莖粗、根數存在極顯著正相關；莖粗與根數存在極顯著正相關。其中，株高和葉長的相關系數最高，達0.944。

表1 白及組培瓶苗各農藝性狀間的相關系數

注：*、**分別表示在0.05和0.01水平相關性顯著和極顯著。

Note：*and** indicate significant correlations at 0.05 and 0.01 levels，respectively.

2.1.4白及組培瓶苗農藝性狀主成分分析主成分分析是將不存在直接相關性狀的數據進行降維處理，從而達到綜合評價性狀目標的方法[15]。試驗從7個特征合計值中，選取了特征合計值較大的3個主成分(表2)。第I主成分的貢獻率為39.832%，第II個主成分的貢獻率為17.153%，第III主成分的貢獻率為15.125%，3個主成分的累計貢獻率為72.11%，能有效反應數據的變化趨勢，同時也說明前三個主成分包含了白及組培瓶苗農藝性狀大量的指標信息含量，符合主成分分析的要求。

從表3可知，第I主成分與株高、葉長呈較大的相關性，相關系數分別為0.855和0.837。因此第I主成分主要反映株高的生長性狀，可以稱為株高生長因子。第II主成分與葉片數、葉寬、莖粗、根數呈正相關，相關系數分別為0.591、0.229、0.664和0.234；與假鱗莖直徑、株高和葉長呈負相關，相關系數分別為-0.223、-0.4和-0.417，因此第II主成分主要反映的是植株葉片和莖的生長情況。第III主成分與假鱗莖直徑和根數呈較大的相關性，相關系數為0.423和0.168，第III主成分主要反映白及莖下部生長情況，因此可以稱為假鱗莖生長發育和根部生長因子。

表2白及組培瓶苗農藝性狀3個主成分的特征合計值與貢獻率

Table 2 Eigen values of three principal components and their contributions of the agronomic traits ofBletillatissue culture seedlings

主成分Principal component特征合計Eigen value方差貢獻率/%Contribution累計方差貢獻率/%Cumulative contributionI2.78839.83239.832II1.20117.15356.985III1.05915.12572.110

第一主成分的表達式為Y1=0.326X1+0.512X2+0.236X3+0.396X4+0.501X5+0.325X6+0.246X7，表明，第一主成分主要由變量X2(株高)、X5(葉長)和X1(假鱗莖直徑)所決定。第二主成分表達式為Y2=-0.203X1-0.365X2+0.474X3+0.209X4-0.381X5+0.606X6+0.214X7，其主成分主要是由變量X3(葉片數)和X6(莖粗)決定；第三主成分表達式為Y3=0.441X1-0.207X2-0.551X3+0.163X4-0.248X5-0.032X6+0.661X7，其主成分主要是由變量X1(假鱗莖直徑)和X7(根數)決定。綜合三個主成分的表達式，參考相關性分析結果、3個主成分的方差貢獻率和各成分指標得分，參照假鱗莖與株高是評價白及質量的主要考慮指標的研究結論[14]，最終將假鱗莖直徑、株高2個主要指標作為貴州產白及組培瓶苗質量分級的主要考慮指標。

表3白及組培瓶苗主成分與農藝性狀因子的相關系數

2.1.5白及組培瓶苗質量等級的初步劃分由表4可知白及組培瓶苗假鱗莖最終的3個聚類中心值分別為5.06 mm、4.54 mm和6.67 mm；株高的聚類中心值分別為4.59 cm、4.29 cm和7.66 cm。將聚類中心值作為白及組培瓶苗質量等級劃分的標準，結合實際生產，白及組培瓶苗質量劃分為3個等級， I級苗為假鱗莖直徑≥7 mm，株高≥8 cm；II級苗假鱗莖直徑≥5.5 mm，株高≥4 cm；III級苗假鱗莖直徑≥4 mm，株高≥4 cm(表5)。

表4白及組培瓶苗2個等級劃分指標的聚類中心

Table 4 Cluster center of two grades ofBletillatissue culture seedlings

農藝性狀 Agronomic traitsⅠⅡⅢ假鱗莖直徑/mm Bulb diameter5.064.546.67株高/cm Plant height4.594.297.66

表5白及組培瓶苗的分級標準

Table 5 Grading standards ofBletillatissue culture seedlings

農藝性狀 Agronomic traitsⅠ級Ⅱ級Ⅲ級假鱗莖直徑/mm Bulb diameter≥7≥5.5≥4株高/cm Plant height≥8≥4≥4

2.2白及組培瓶苗等級劃分合理性的驗證

2.2.1不同等級白及組培瓶苗煉苗情況及存活率煉苗后， I級苗的植株健壯，葉片寬厚肥大、深綠色，假鱗莖能很快由綠色變為白色，死亡率低，長勢良好，有新葉片、新芽長出，植株高，其存活率為91.67%；II級苗植株健壯，葉片深綠色，長勢良好，有新葉長出，植株較高，其存活率為68.33%；III級苗的植株較為健壯，葉綠色，長勢緩慢，植株較高，其存活率為56.67%；等外苗的植株弱小，葉片小、淺綠色，不易適應外界條件，存活率低，為34.54%。

2.2.2不同等級白及組培瓶苗移栽后葉綠素變化情況從圖2可知，不同等級白及組培瓶苗移栽后，緩苗期相對葉綠素含量下降，緩苗期后，葉綠素含量開始上升，最后達到相對穩定狀態。但在各個等級之間相對葉綠素含量差異不明顯。

圖2不同等級組培瓶苗的葉綠素變化

Fig.2 Chlorophyll at different grades ofBletillatissue culture seedlings

2.2.3煉苗后白及組培瓶苗質量的比較從表6可知，培養90 d后，假鱗莖直徑表現為III級苗>I級苗>II級苗，I級苗和II級苗假鱗莖直徑平均增長量小于III級苗，這是因為I級苗和II級苗煉苗時的基礎值較大。隨著培養時間延長，I級苗植株葉片出現死亡，即“倒苗”現象，導致I級苗株高、葉長都小于II級苗和III級苗；葉寬略大于III級苗，小于II級苗。白及植株倒苗后，主要是體現在新芽的產生和根數的增加，I級苗出芽率達70%，新芽數在1～2個/株，且多數假鱗莖已經分叉成“弓”形；II級苗假鱗莖直徑平均增長量相對較小，但株高、葉長、葉寬的平均生長量略大于I級苗和III級苗，“倒苗”數較少，出芽率約50%，且新芽數多為1個/株，根數基本無明顯變化；III級苗假鱗莖直徑平均增長量略大于I級苗和II級苗，主要是因為假鱗莖直徑的基礎值都相對集中，煉苗期間生長狀況良好，幾乎無“倒苗”現象，植株地上部分健壯，有利于白及苗地下假鱗莖的生長，但是出芽率遠低于I級苗和II級苗，僅為10%，新芽數均為1個/株。

表6 不同等級白及組培瓶苗煉苗后的農藝性狀

3結論與討論

對白及組培瓶苗的質量分級不僅要具有一定的科學性與合理性，還要與生產實踐和實際應用相結合。白及組培瓶苗主成分分析結果表明，白及組培瓶苗的質量分級主要指標為假鱗莖直徑、株高、葉片數。有研究指出[16]，白及假鱗莖的質量是決定白及苗存活的關鍵因素，假鱗莖直徑越大，其存活率越高，株高和葉片數是體現白及苗健壯程度。通過對組培瓶苗進行相關性分析、主成分分析和K-聚類分析，確定了白及組培瓶苗質量分級指標為假鱗莖直徑和株高，并將組培瓶苗分為3個等級，I級苗為假鱗莖直徑≥7 mm，株高≥8 cm；II級苗假鱗莖直徑≥5.5 mm，株高≥4 cm；III級苗假鱗莖直徑≥4 mm，株高≥4 cm。白及組培瓶苗質量越好，移栽后其植株存活率越高，即I級苗存活率(91.67%)>II級苗(68.33%)>III級苗存活率(56.67%)>等外苗存活率(34.54%)；I級苗假鱗直莖總體平均增長值大于II級苗，微小于III級苗，但對于個別植株而言，其增長量遠大于II級和III級苗，出芽率和新芽數也相對較高，出芽率為70%，新芽數一般為1～2個/株；每個等級的組培瓶苗在移栽后其相對葉綠素都有下降的趨勢，度過緩苗期，相對葉綠素含量開始上升，到一定的程度后趨于穩定，但各等級苗之間的相對葉綠素差異不明顯。