HPLC法測定云南不同產地白花蛇舌草中齊墩果酸和熊果酸含量

楊新周， 吳 娜， 邱曉雪

(1.德宏師范高等專科學校 理工學院, 云南 德宏 678400； 2.紅河學院 理學院， 云南 蒙自 661199； 3.德宏師范高等專科學校 民族醫藥研究所, 云南 德宏 678400)

白花蛇舌草(HedyotisdiffusaWilld)又叫蛇舌草、蛇總管、蛇痢草、二葉等，屬茜草科(Rubiaceae)耳草屬植物[1]，分布于世界各地，在我國主要產自福建、廣東、香港、廣西、海南、安徽、云南等省區，有清熱解毒、活血止痛、利尿消腫等功效。臨床上用于治療咽喉腫痛、闌尾炎、毒蛇咬傷、盆腔炎、尿路感染、小便不利、菌痢等病癥[2]。白花蛇舌草中主要含有無機元素、多糖類、三萜類、有機酸類、黃酮類、蒽醌類、烷烴類、甾醇類、環烯醚苷萜類、生物堿等化學成分，也含有一些微量元素、氨基酸及揮發性成分[3-4]。其中，齊墩果酸和熊果酸是其主要藥用成分，具有顯著的抗菌、消炎、抗癌、抗突變、抗氧化等藥理作用[5]。有關白花蛇舌草的研究主要集中在成分組成、藥理活性以及有效成分提取等方面。近年來為了進一步開發白花蛇舌草，使其在臨床上得到更合理充分的利用，對其中熊果酸和齊墩果酸含量測定方法的研究越來越受到重視，越來越多的學者研究不同方法同時測定兩種物質的含量[5-8]。高效液相色譜法是檢測白花蛇舌草中齊墩果酸和熊果酸含量最常用的方法[6-7,9-10]。由于齊墩果酸和熊果酸互為同分異構體，結構、性質非常相似，難以分離。近年來雖然廣泛用高效液相色譜法進行測定，但是由于流動相組成復雜，出峰時間長，峰形和分離度均不夠理想，從而影響分析結果的準確性，分離及含量分析還需進一步深入探究。為此，筆者等以乙醇為溶劑結合超聲波提取進行樣品前處理，通過改變優化色譜條件，建立分離效果較好的高效液相色譜分析方法，并用該法測定云南不同產地白花蛇舌草中齊墩果酸和熊果酸的含量，以期為白花蛇舌草的質量控制奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

藥材：白花蛇舌草樣品，采集于云南省不同地區，經德宏師范高等專科學校鑒定為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草，其詳細信息見表1。

表1 白花蛇舌草樣品采集信息

儀器：高效液相色譜儀( Agilent 1100)，超聲波清洗器(SK7200LHC，上海科導超聲儀器有限公司)，色譜柱ZORBAX Eclipse XBD-C18柱(4.6×150 mm, 5 μm)，恒溫水浴鍋(B-260，上海亞榮生化儀器廠)，旋轉蒸發儀(N-1100，上海愛朗儀器有限公司)，電子天平(CP224C，奧豪斯儀器上海有限公司)。

試劑：齊墩果酸、熊果酸標準品(北京普天同創生物科技有限公司)，色譜純甲醇和乙腈、冰乙酸(GR)、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鉀等為分析純，娃哈哈純凈水。

1.2方法

1.2.1樣品的制備將采集的樣品自然陰干，粉碎，過0.3 mm孔徑篩子，保存備用。

1.2.2高效液相色譜檢測條件的優化

1) 流動相的選擇。在液相色譜柱溫為20℃，進樣量30 μL，流速1 mL/min條件下，分別考察甲醇-2%冰乙酸水溶液(88∶12)、甲醇-3%冰乙酸水溶液(88∶12)、乙腈-2%冰乙酸水溶液(60∶40)、乙腈-磷酸鉀鹽緩沖液(pH 8左右)(60∶40)等流動相對分離效果的影響。

2) 柱溫的選擇。以甲醇-2%冰乙酸(88∶12)為流動相，進樣量30 μL，流速1 mL/min，考察柱溫分別為35℃、30℃、25℃和20℃時的分離效果。

3) 進樣量的選擇。以甲醇-2%冰乙酸(88∶12)為流動相，色譜柱溫20℃，流速1 mL/min，考察進樣量分別為20 μL、30 μL和50 μL的分離效果。

4) 流速的選擇。以甲醇-2%冰乙酸(88∶12)為流動相，色譜柱溫20℃，進樣量30 μL，考察流速分別為1 mL/min和0.8 mL/min的分離效果

5) 流動相比例的選擇。在液相色譜柱溫20℃，進樣量30 μL，流速1 mL/min條件下，考察甲醇-2%冰乙酸流動相比例為90∶10、88∶12、85∶15和50∶50對分離效果的影響。

1.2.3標準溶液的配制

1) 單一標準溶液的配制。分別精確稱取0.020 0 g齊墩果酸和0.020 0 g熊果酸標準品用甲醇溶解，轉移至25 mL容量瓶中，定容，得到濃度為0.8 μg/μL的齊墩果酸和熊果酸的單一標準溶液。

2) 混合標準儲備溶液的制備。取齊墩果酸和熊果酸單一標準溶液各5.00 mL置于10 mL容量瓶中，定容，超聲使其充分混合，得齊墩果酸和熊果酸濃度均為0.4 μg/μL的混和標溶液待用。

3) 標準工作溶液的制備。取所配制的混合標準儲備溶液，采用逐級稀釋法，配制濃度范圍為0.025～0.4 μg/μL的齊墩果酸和熊果酸混合標準工作溶液，測定前用0.45 μm微孔濾膜(有機系)過濾，進行檢測。

4) 標準曲線的繪制。將所配制的標準工作溶液在最佳色譜條件下，從低濃度至高濃度依次進樣分析，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到齊墩果酸、熊果酸線性回歸方程。

1.2.4樣品前處理精密稱取白花蛇舌草樣品粉末0.300 0 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入40 mL乙醇，超聲提取30 min。冷卻至室溫后過濾，將濾液用旋轉蒸發儀蒸發濃縮近干，再用乙醇定容至2 mL，通過0.45 μm微孔濾膜(有機系)過濾，將濾液置于2 mL進樣瓶中待測(置于冰箱中冷藏保存)。照上述步驟制備云南7個不同產地的白花蛇舌草樣品溶液待測。

1.2.5系統方法學考察

1) 儀器精密度。將1.2.4配制的第7號(玉溪市元江縣咪哩鄉)白花蛇舌草樣品溶液在最佳色譜條件下連續進樣分析3次，計算齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD。

2) 加標回收率。稱取10份第7號樣品，每份質量為0.300 0 g，分別加入不同量的齊墩果酸和熊果酸，同1.2.4步驟提取制備加標樣品溶液，每個加標量(齊墩果酸不同加標量分別為137.60 μg、168.00 μg、199.20 μg，熊果酸不同加標量分別為127.20 μg、148.40 μg、174.90 μg)作3次平行試驗。將10組加標樣品溶液在最佳色譜條件下逐一進樣分析，分別計算樣品加標回收率。

1.2.6樣品檢測將所制備的云南7個不同產地的白花蛇舌草樣品溶液在優化的最佳檢測條件下依次進樣分析。

2結果與分析

2.1檢測條件的優化

2.1.1流動相種類試驗表明，以乙腈-磷酸鉀鹽作為緩沖液(pH 8左右)、乙腈-2%冰乙酸作為流動相時，單標、混標及樣品溶液都不出峰；但甲醇-2%冰乙酸作流動相對齊墩果酸和熊果酸分離效果相對較好，故選擇甲醇-2%冰乙酸作為流動相。

2.1.2柱溫柱溫也是目標化合物分離效果的一個影響因素。當柱溫在25℃、30℃、35℃齊墩果酸和熊果酸分離度均小于1，而當柱溫為20℃時，分離度為1.329，此時齊墩果酸和熊果酸的分離效果相對較好，故選擇柱溫為20℃。

2.1.3進樣量進樣量的大小影響目標化合物的峰面積和分離度。進樣量為20 μL、30 μL和50 μL時，分離度分別為0.814、1.329和0.937，當進樣量為30 μL時，齊墩果酸和熊果酸分離度最大，說明分離效果相對較好。故選擇30 μL作為進樣量。

2.1.4流速流速的快慢不僅影響目標化合物的出峰時間，也影響分離效果。試驗表明，流速為0.8 mL/min和1 mL/min時，分離度分別為1.048和1.329，當流速為1 mL/min齊墩果酸和熊果酸的分離度高、出峰快，即對齊墩果酸和熊果酸的分離效果相對較好，故選擇流速為1 mL/min。

2.1.5流動相比例當流動相比例為50∶50時，目標化合物沒有出峰；流動相比例為90∶10、88∶12時熊果酸和齊墩果酸的分離度小于比例為85∶15時的分離度，在流動相比例為85∶15時，齊墩果酸和熊果酸分離度最大，分離效果相對較好，故甲醇-2%冰乙酸的比例為85∶15。

2.2線性回歸方程

齊墩果酸和熊果酸線性回歸方程分別為Y=12 756X+86.98(R2=0.999 2)和Y=12 347X+78.029(R2=0.999 4)。說明齊墩果酸和熊果酸在0.025～0.4 μg/μL范圍內線性關系良好。單一標準溶液和混合標準溶液在檢測條件下，得到色譜圖對比圖。從圖1可以看出，齊墩果酸保留時間比熊果酸短，可以確定齊墩果酸先出峰，熊果酸后出峰，且保留時間分別為16.506 min和17.229 min，混合標準溶液色譜圖中得出齊墩果酸和熊果酸分離效果好，可實現同時測定。

注：1，齊墩果酸標準品；2,熊果酸標準品；3和4分別齊墩果酸和熊果酸混標

Note:1,Oleanolic acid standard; 2,Ursolic acid standard; 3 and 4,oleanolic acid and ursolic acid mixed standard

圖 1齊墩果酸和熊果酸的HPLC色譜圖

Fig.1 HPLC chromatogram of oleanolic acid and ursolic acid

2.3方法學考察

經測定，齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD分別為1.2%和1.01%，均小于2%，表明儀器精密度良好。加標回收率試驗表明，齊墩果酸的加標回收率在82.26%～88.01%，平均回收率為85.57%，RSD為2.77%；熊果酸的加標回收率在80.84%～93.08%，平均回收率為84.93%，RSD為4.47%。兩者的RSD均小于5%，說明方法準確度良好。

2.4樣品含量的測定

從表2可知，云南省7個不同產區白花蛇舌草均含有熊果酸和齊墩果酸，7個不同產區齊墩果酸含量在0.139 7～0.523 8 mg/g，平均值為0.409 6 mg/g，其中，普洱市景谷縣景谷鎮和紅河州個舊市大屯鎮產白花蛇舌草中齊墩果酸含量最高，均為0.523 8 mg/g，德宏州芒市江東鄉齊墩果酸含量最低，為0.139 7 mg/g。云南不同產區熊果酸含量在0.656 6～2.645 6 mg/g，平均值為1.888 8 mg/g，其中普洱市鎮沅縣者東鎮產白花蛇舌草含量最大，為2.645 6 mg/g，德宏州芒市江東鄉齊墩果酸含量最低，為0.6566 mg/g。

表2云南不同產區白花蛇舌草樣品中齊墩果酸和熊果酸的含量

Table 2 Contents of oleanolic acid and ursolic acid inH.diffusafrom different habitats in Yunnan mg/g

樣品序號Sample No.齊墩果酸含量Oleanolic acid熊果酸含量Ursolic acid10.139 70.656 620.439 32.187 730.523 82.007 340.437 72.645 650.523 82.004 360.492 72.165 870.310 31.554 6

3結論與討論

試驗表明，HPLC法檢測7個不同產區白花蛇舌草中均含有齊墩果酸和熊果酸含量的最佳條件為 ZORBAX Eclipse XBD-C18柱(4.6×150 mm, 5 μm)，流動相為甲醇-2%冰乙酸水溶液(85∶15)，柱溫為20℃，流速為1 mL/min，檢測波長為210 nm，進樣量為30 μL。在優化條件下，齊墩果酸和熊果酸混合標準溶液在0.025～0.4 μg/μL范圍內線性關系良好，且齊墩果酸加標回收率在82.26%～88.01%，RSD為2.77%；熊果酸加標回收率在80.84%～93.08%，RSD為4.47%。方法的精密度、重復性、穩定性、準確度均良好。采用該法對7個不同產區白花蛇舌草中均含有齊墩果酸和熊果酸，但含量存在差異，7個不同產區齊墩果酸含含量在0.139 7～0.523 8 mg/g，平均值為0.409 6 mg/g；熊果酸含量在0.656 6～2.645 6 mg/g，平均值為1.888 8 mg/g。其中普洱市景谷縣景谷鎮和紅河州個舊市大屯鎮產白花蛇舌草中齊墩果酸含量最高，為0.523 8 mg/g。洱市鎮沅縣者東鎮產白花蛇舌草含量最大，為2.645 6 mg/g。

在測定白花蛇舌草中齊墩果酸和熊果酸含量時，流動相的選擇將影響齊墩果酸和熊果酸能否出峰，所以流動相的選擇至關重要。流動相比例、流速、進樣量的優化直接影響到齊墩果酸和熊果酸分離效果及出峰時間。所以在檢測過程中要綜合考慮到每一個條件，才能保證測定結果的準確可靠。

綜上所述，試驗所建立的測定白花蛇舌草中齊墩果酸和熊果酸含量的HPLC法，預處理方法簡單，測定方法可靠，可運用于白花蛇舌草中齊墩果酸和熊果酸含量的測定和分析。