10%KOH涂片鏡檢和Real-time PCR診斷念珠菌病感染的準確性研究

婁海芳　張喬冶　許歡　吳飛

[摘要] 目的 探討10%KOH涂片鏡檢和Real-time PCR診斷念珠菌病感染的準確性研究，找到一種簡單、快速、有效的臨床用來診斷口腔念珠菌病的方法。 方法 于2014年1月～2017年1月期間在我院口腔科患者中選取患有口腔念珠菌病的患者100例，收集患者唾液（或含漱液）標本和口腔黏膜脫落細胞，10%KOH涂片鏡檢和Real-time PCR法用于檢測標本中白色念珠菌，比較兩種檢測方法的診斷效能（靈敏度、特異度、ROC面積及預測值等）。結果 與10%KOH涂片鏡檢結果相比，Real-time PCR法檢測念球菌的準確性更高（P<0.05）。與10%KOH涂片鏡檢的結果相比，Real-time PCR法檢測念球菌的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值更高（P<0.05）。與10%KOH涂片鏡檢結果相比，Real-time PCR法檢測念球菌的ROC面積值更高（P<0.05）。 結論 10%KOH涂片鏡檢和Real-time PCR診斷念珠菌病感染的準確性較高，Real-time PCR診斷效果更好，具有很高的臨床應用價值，可快速檢測和診斷口腔念珠菌病。

[關鍵詞] 10%KOH涂片鏡檢;Real-time PCR;念珠菌病;診斷效能

[中圖分類號] R644? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）22-0035-04

[Abstract] Objective To investigate the accuracy of 10%KOH smear microscopy and Real-time PCR in the diagnosis of candidiasis infection， and to find a simple， rapid and effective method for the diagnosis of oral candidiasis. Methods 100 patients with oral candidiasis were selected from the dental patients in our hospital from January 2014 to January 2017. The saliva（or gargle） specimens and oral mucosal exfoliated cells were collected for the purpose of detecting candida albicans of specimens. 10% KOH smear microscopy and Real-time PCR were applied to diagnose efficiencies（sensitivity， specificity， ROC area， Yoden index， and predicted values） of the two assays were calculated. Results The accuracy of detection of candida albicans by Real-time PCR was higher than that of the 10%KOH smear microscopy（P<0.05）. Compared with the results of smear microscopy with 10%KOH， the sensitivity， specificity， positive predictive value， and negative predictive value of candida albicans by Real-time PCR were higher（P<0.05）. Compared with the results of smear microscopy with 10%KOH， the ROC area of candida albicans by Real-time PCR assay was higher（P<0.05）. Conclusion The accuracy of 10%KOH smear microscopy and Real-time PCR for the diagnosis of candidiasis is high. Real-time PCR has a better diagnostic effect and has high clinical value. It can rapidly detect and diagnose oral candidiasis.

[Key words] 10%KOH smear microscopy; Real-time PCR; Candidiasis; Diagnostic efficacy

最近的研究發現，條件致病性真菌感染越來越得到醫學界的關注，尤其是深部真菌病，其發病率和死亡率日益升高，威脅著患者的健康和生命。白色念珠菌（candidiasis） 是一種真菌，經常出現在人體內部，包括口腔、上呼吸道、腸道和陰道內，其數量在健康的體內不多，所以不會引發疾病，但是如果免疫功能下降或者正常菌群功能失調時，機體就會被真菌所感染，同時真菌還會在體液中釋放代謝物，其會被作為抗原導致免疫反應，進而產生特異性抗體，特異性抗體快速繁殖，生長形式也改變為芽生菌絲相，在入侵細胞后會造成疾病。念珠菌不耐熱，在60℃環境下1 h就會死亡。白色念珠菌常寄居于正常體內，當機體免疫機能持續降低或體內的微生態環境已經失調，極易引起機體患有念珠菌病。念珠菌在不同位置時可引發不同的疾病[1，2]。

念珠菌的數量與機體內的平衡共生狀態被破壞時，念珠菌會變為菌絲相，而不是原來的圓形或卵圓形，從而導致其在局部快速大量的繁殖，由于近年來大量的免疫抑制劑及抗生素的濫用導致體內正常的菌群出現失調，因此白色念珠菌在臨床檢查中呈現感染率和發病率上升的趨勢[3，4]。由于念珠菌的感染初期，患者的癥狀不明顯，臨床表現亦缺乏明顯的特征性，導致念珠菌的臨床早期診斷率很低，可明顯影響患者的預后。

口腔念珠菌病是臨床上一種常見的多發性口腔疾病，常規的臨床診斷主要依靠患者的癥狀和體征，輔以血培養和組織病理檢查檢出假菌絲和大量芽孢，提示念珠菌經實驗室的細菌檢查證實感染[5，6]。常規檢查方法雖然具有操作簡單、成本較低等優點，但是該方法耗時較長、敏感性較低，容易造成假陰性而出現臨床漏診，會導致患者因病情延誤而最終治療失敗[7，8]。隨著分子生物學的發展，Real-time PCR法敏感性高、特異性強、重復性好、快捷方便，已逐步開始用于真菌病的診斷和研究[9]。本研究擬采用10%KOH涂片鏡檢和Real-time PCR法來實現臨床診斷口腔念珠菌病的感染情況的研究。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月～2017年1月于我院口腔科確診為口腔念珠菌病患者100例作為觀察組，診斷金標準：①均為口腔念珠菌感染;②真菌培養的實驗室檢查結果為陽性念珠菌感染;③2名專家一起給予臨床確診。排除標準：30 d內接受過抗真菌治療或口腔局部治療者;妊娠期或哺乳期女性;不能配合試驗者。觀察組男44例，女56例;平均發病年齡（59.68±11.35）歲;偽膜型念珠菌病14例，紅斑型念珠菌病75例，增殖型念珠菌病11例。

1.2 方法

1.2.1 標本的采集及實驗室處理? ①采集口腔黏膜病損區的脫落細胞：在病損區，采用一次性壓舌板反復涂刮少許黏膜脫落細胞10 次，留取2 mL唾液，12 000 r/min離心 10 min，吸取 50 μL沉淀及上清液混勻后制成口腔黏膜涂片，并收集黏膜標本采集DNA。②唾液（或含漱液）采集：剩余唾液（或含漱液）進行下一步的真菌培養鑒定，沙保氏葡萄糖瓊脂培養基進行定量檢測;法國科瑪嘉念珠菌顯色培養基進行定性檢測。

1.2.2 檢測方法及結果判讀? ①10%KOH 涂片鏡檢：采用 10%KOH 溶液消化法處理載玻片，菌絲或芽生孢子出現明顯的折光性判讀為陽性。②Real-time PCR法：按 DNA 提取試劑盒說明書提取念珠菌 DNA，進行PCR 擴增，并設立陽性對照和陰性對照。檢出DNA擴增即為陽性。評價指標包括診斷試驗的真實性（靈敏度、特異度、預測值等）及受試者工作特征曲線（ROC）下面積。

1.3 統計學方法

采用SPSS22.0統計學軟件處理，計量資料滿足方差齊性和正態分布，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間差異采用單因素方差分析和t檢驗，計數資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗與Kappa 檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。比較脫落細胞和唾液標本與兩種檢測方法組合的診斷效能。

2 結果

2.1 10%KOH鏡檢和Real-time PCR法檢測結果

10%KOH涂片鏡檢的脫落細胞陽性結果為58%（58/100），10%KOH涂片鏡檢唾液（或含漱液）的陽性結果為34%（34/100）。Real-time PCR法檢測的脫落細胞陽性結果為92%（92/100），Real-time PCR法檢測的唾液（或含漱液）陽性結果為96%（96/100）。與10%KOH涂片鏡檢結果相比，Real-time PCR法檢測念球菌的準確性更高（P<0.05）。見表1。

2.2 10%KOH鏡檢和Real-time PCR法檢測的真實性評價

10%KOH鏡檢和Real-time PCR法檢測方法的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值結果見表2、3。與10%KOH涂片鏡檢結果相比，Real-time PCR法檢測念球菌的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值更高（P<0.05）。

2.3 ROC曲線評價10%KOH鏡檢和Real-time PCR法

見表4。與10%KOH涂片鏡檢結果相比，Real-time PCR法檢測念球菌的ROC面積值更高（P<0.05）。

3 討論

在國內外的診斷中，根據臨床癥狀及體征結合實驗室檢查診斷口腔念珠菌病雖已經得到廣泛認同，但仍缺乏統一的國際金標準[10，11]。菌絲（假菌絲、真菌絲）或芽生孢子確診時，利用涂片鏡檢或唾液培養等方法的耗時較長，且敏感性較低，所以致力于尋求一種及時、高效的實驗室檢測方法有利于念球菌的臨床確診和治療措施的實施[12，13]。本研究結果顯示，10%KOH涂片鏡檢脫落細胞的陽性結果為58%（58/100），唾液（或含漱液）陽性結果為34%（34/100）。脫落細胞Real-time PCR法檢測的陽性結果為92%（92/100），唾液（或含漱液）Real-time PCR法檢測的陽性結果為96%（96/100）。與10%KOH涂片鏡檢結果相比，Real-time PCR法檢測念球菌的準確性更高。主要由于脫落細胞10% KOH 涂片鏡檢觀察對象與背景反差小，尤其是唾液（或含漱液）標本在離心處理后，會導致載玻片內的細胞增多，增大了觀察假菌絲和芽生孢子的難度，10% KOH涂片鏡檢靈敏度最高，但實驗室檢查的特異度較低，極易受到唾液（含漱液）沉淀標本等因素干擾[14，15]。

隨著分子生物學的發展，PCR法可以檢測出微量的真菌DNA，己成為真菌檢測的一個研究熱點。Real-time PCR法，即實時檢測PCR擴增產物并進行解析的方法，其敏感性高、特異性強、重復性好、快捷方便，同時還能夠克服普通PCR不能準確定量、容易污染等的不足。由于其操作簡單、快速方便、靈敏度高、污染率低等特點，近年來已經逐步開始應用于真菌病的診斷和研究[16，17]。本研究用DNA 提取試劑盒提取白色念珠菌標準菌株及兩株臨床分離菌株的 DNA，并進行PCR 擴增，通過與標準的分子量進行試驗觀察比較，將白色念珠菌DNA 擴增出 500 bp 左右的特異性條帶，檢測出 1×100個/mL的白色念珠菌。本研究結果表明，與10%KOH涂片鏡檢結果相比，Real-time PCR法檢測念球菌的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值更高;與10%KOH涂片鏡檢結果相比，Real-time PCR法檢測念球菌的ROC面積值更高（P<0.05），從 DNA提取到 PCR 擴增的全部過程中，提取白色念珠菌只需 6 h，縮短實驗室進行血培養和組織病理檢查的時間，有效提高了臨床的診斷時效，說明Real-time PCR法檢測念球菌診斷試驗的臨床應用價值最高，為疾病的治療爭取時間[18]。此種方法在檢測樣本中白色念珠菌的敏感度高、特異性強、可行性好、結果穩定，具有快速、方便、重復性好的優點，可以為白色念珠菌感染的早期診斷提供實驗依據[19，20]。Real-time PCR檢測法只能鑒定 6 種常見念珠菌以及檢測白色念珠菌耐藥基因突變。

本研究在嚴謹觀察和實驗室診斷的基礎上，由兩名專家共同確認白色念珠菌的診斷，以確定其感染和非感染的情況。在最大程度上控制了臨床診斷白色念珠菌的漏診和誤診，可更好評價臨床診斷試驗的可靠性。同時采用雙盲法，判讀人員對標本和研究對象的臨床表現、分組等相關信息完全不知曉，最大程度上避免了人為偏差，確保試驗結果的客觀性。本研究結果提示，10%KOH涂片鏡檢和Real-time PCR診斷念珠菌病感染的準確性較高，Real-time PCR診斷效果更好，臨床應用價值高，可作為口腔念珠菌病診斷的治療和干預的快速檢測法，其臨床應用前景十分良好。但是本研究無法鑒定出來具體的菌種，并且對于免疫力低下、抗真菌治療效果不佳的患者尚需進一步的組織病理學檢查。

[參考文獻]

[1] 呂欣，趙琛，閆志敏，等. 三種快速檢測法用于口腔念珠菌病診斷的準確性研究[J]. 中華口腔醫學雜志，2016， 51（10）：610.

[2] 劉秀卿，王革非，李卓成，等. PCR-反向點雜交法在外陰陰道念珠菌病診斷及白念珠菌耐藥基因突變檢測中的應用[J]. 臨床檢驗雜志，2017，35（7）：212-214.

[3] 劉小琦，杜瓊，劉祥琴. 陰道分泌物念珠菌感染檢測方法對比分析[J]. 重慶醫學，2017，46（35）：4927-4929.

[4] 譚靜文，何文婧，高志琴，等. IL-22對口腔白念珠菌感染的保護作用及機制研究[J]. 中國真菌學雜志，2017， 12（4）：146-149.

[5] 葉鵬. 全自動實時熒光定量PCR系統在肺結核診斷和藥敏試驗檢測中的應用價值[J]. 中國預防醫學雜志，2017，18（4）：72-75.

[6] 王靜，劉立賓，岳永寧，等. RNA恒溫擴增實時檢測技術與熒光定量PCR聯合檢測肺泡灌洗液對痰涂陰性肺結核的快速診斷價值[J]. 中華醫院感染學雜志， 2017，27（2）：300-304，320.

[7] 寧靜，于莉，陳軍. TB-IGRA定量試驗診斷肺結核感染的臨床應用分析[J]. 軍事醫學，2017，41（1）：1855-1857.

[8] 于洪志，吳琦. PCR檢測技術在念珠菌病診斷中應用的新進展[J]. 中國城鄉企業衛生，2017，32（5）：29-31.

[9] 張洪彬. PCR方法檢驗陰道念珠菌病的效果分析[J]. 當代醫學，2012，18（8）：73-74.

[10] Bilhan H，Sulun T，Erkose G，et al. The role of Candida albicans hyphae and Lactobacillus in denture-related stomatitis[J]. Clin Oral Investig，2009，13（4）： 363-368.

[11] 呂欣，趙琛，閆志敏，等. 三種快速檢測法用于口腔念珠菌病診斷的準確性研究[J]. 中華口腔醫學雜志，2016， 51（10）：610-615.

[12] 趙民，周曾同，張濟，等. 口腔念珠菌的PCR ITS1-ITS2和RAPD基因分型[J]. 上海交通大學學報（醫學版），2005，25（4）：342-344.

[13] 孫康德，陳鋮，陳旭，等. 口腔白念珠菌耐藥性與基因分型及耐藥基因表達的分析[J]. 檢驗醫學，2017，32（11）：979-984.

[14] 任愛英. 如何提高白帶涂片檢查念珠菌陽性率[J]. 標記免疫分析與臨床，2010，17（2）：119.

[15] 夏輝，陳麗，柳正衛，等. 痰涂片鏡檢在涂陽肺結核患者隨訪中的準確性研究[J]. 中國防癆雜志，2016，38（9）：736-741.

[16] 顧軍，王英，劉維達，等. 用PCR法快速檢測播散性念珠菌病兔模型血中的念珠菌[J]. 中國皮膚性病學雜志，2001，15（4）：220-222.

[17] 李俊如，楊肇立，李鍵，等. 呼吸道分泌物真菌直接涂片檢查的臨床準確性探討[J]. 國際檢驗醫學雜志，2009， 30（1）：20-22.

[18] 熊延靖，董群. PCR法檢測血液中白色念珠菌的敏感性研究[J]. 皖南醫學院學報，2011，30（5）：359-361.

[19] 熊延靖，董群. PCR法在小鼠早期念珠菌病診斷中的應用研究[J]. 醫學分子生物學雜志，2010，7（5）：414-417.

[20] 趙雯雯，畢慶偉，李巖，等.口腔扁平苔蘚患者黏膜脫落上皮中人β防御素-2和白色念珠菌的研究[J]. 醫學研究雜志，2016，45（7）：92-95.

（收稿日期：2019-01-14）