劍南春天益老號窖泥特殊功能菌的選育及應用

徐占成，唐清蘭，徐姿靜，劉孟華，邱 雪

（四川劍南春集團有限責任公司，四川綿竹 618200）

中國白酒界有這樣一個亙古不變的道理：“千年老窖萬年糟，酒好需得窖池老”。泥窖是濃香型白酒的發酵容器，也是濃香型白酒區別于其他酒類重要的物質性標簽之一。劍南春傳承“泥窖純糧固態發酵”技藝，特別依托于其獨有的老窖窖池。老窖池中富含釀酒特殊功能微生物菌群和微量元素，每一輪投入釀酒的糧食，都是窖池的一次新生，隨著歲月的增長，這些物質不斷向窖池深處繁殖滲透，滋養著窖池。劍南春“天益老號”千年活窖群，經過1500年的自然淘汰、馴化、優選形成一個特定的微生物菌系，賦予了劍南春芳香優雅、綿柔甘洌的典型滋味特色。對于濃香型白酒企業而言，釀酒發酵窖池窖泥功能微生物的相對豐度直接決定產品優級品率的高低。因此利用現代生物技術解析窖泥微生態系統多樣性特征，在優質老窖泥中選育窖泥功能微生物應用于釀酒生產，對新窖老熟及窖池養護具有重大的現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

窖泥樣品：劍南春股份有限公司各釀酒車間，窖齡為2年、5年、10年、20年以及50年以上。

1.2 窖泥微生物群落結構

1.2.1 窖泥總RNA提取

窖泥樣品按10 cm2/mL 加Trizol 后，于室溫放置5 min，使其充分裂解。12000 r/min 離心5 min，棄沉淀。按200 μ L 氯仿/mL Trizol 加入氯仿，振蕩混勻15 min，室溫放置15 min。4 ℃、12000 r/min離心15 min。吸取上層水相，至另一離心管中，按0.5 mL 異丙醇/mL Trizol 加入異丙醇混勻，室溫放置5～10 min，4 ℃、12000 r/min 離心10 min，棄上清，RNA 沉于管底。按1 mL 75 %vol 乙醇/mL Trizol 加入75%vol 乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。4 ℃、8000 r/min 離心5 min，盡量棄上清液。室溫晾干或真空干燥5～10 min。可用50 μ L H2O溶解RNA 樣品。RNA 經提取后，經富集mRNA、去除rRNA 及反轉錄生成cDNA 等過程，獲取供高通量測序用的實驗樣品。利用Illumina 的HiSeq2000測序儀進行測序。測序工作委托商業測序公司完成。

1.2.2 基因組、轉錄組數據的處理及生物信息學分析

基因組數據處理包括DNA 片段統計和拼接、生物信息解釋、基因表達分析(RNA-Seq)等。宏基因組與轉錄組數據放在一起進行拼接，以獲得盡可能長的DNA 重疊組。具體分析過程如下：①利用Newbler 軟件（454 Life Science）和SOAPdenovo 軟件（http://soap.genomics.org.cn）進行基因組的組裝；②與NCBI 的nr/nt 庫進行序列比對，根據已知序列定位Contigs 之間的連接順序；③結合MG-RAST等軟件進行生物信息學數據分析。

1.3 窖泥功能微生物選育

1.3.1 窖泥功能微生物分離

培養基配方：乙酸鈉0.5 %，酵母膏0.5 %，K2HPO40.04 %，(NH4)2SO40.05 %，MgSO40.02 %，調pH6.0～6.5，121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻至65 ℃，在無菌條件下加入2%無水乙醇。

無菌條件下取10 g窖泥于裝有90 mL無菌水并放有玻璃珠的250 mL 三角瓶中，室溫振蕩30 min，于80 ℃水浴中處理10 min，取菌液按10 倍的梯度逐級稀釋到10-6，取各稀釋度菌液1 mL 于無菌平皿中，倒入滅菌后冷卻至50 ℃的培養基，混勻，待凝固后放入35 ℃厭氧培養箱培養5～7 d。挑單菌落于液體培養中于35 ℃培養至產氣為止。取發酵液1 mL于小試管中，加入0.5 mL乙醚和2%硫酸銅溶液1 mL，充分搖勻，靜置分層后，在乙醚層呈現藍色，即證明有己酸生成。顏色越深，含量越高，共篩選到15 株產己酸能力較高的單菌株，分別命名為F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9、F10、F11、F12、F13、F14、F15。

1.3.2 發酵條件優化

選取溫度、發酵天數、乙酸鈉和乙醇濃度進行4因素3水平設計正交實驗，結果見后表1。

1.3.3 功能微生物定性

（1）菌株16S rDNA序列分析

DNA 提取和PCR 擴增，把擴增后的片段送往上海生工進行測序分析。

（2）全自動微生物鑒定儀鑒定

采用Biolog微生物鑒定儀鑒定，方法如下：

第一步、在Biolog 推薦的培養基上培養微生物：將獲得的純培養菌種接種至Biolog 推薦的培養基BUA+B 上，35 ℃厭氧培養。在BUA+B 上培養兩代。培養時間為24～48 h。第二步、準備接種物：使用未接種的含有接種液的干凈接種管調整濁度儀透光度100 %。用棉簽從瓊脂平板中有細胞生長的地方沾取菌落，調整細胞濃度到65%T。第三步、接種微孔板：按每孔100 μ L 的量將菌懸液按順序加入微孔板的所有孔中。蓋好微孔板的蓋子。第四步、孵育微孔板：放入厭氧工作站中培養20～24 h。培養溫度35 ℃。讀板，詮釋結果。

1.4 窖泥功能微生物的應用

將功能菌株逐級擴大培養應用于人工培養窖泥中，菌株增殖培養工藝流程：純菌株→厭氧管液體培養（一級種子液）→厭氧瓶液體培養（二級種子液）→發酵罐液體厭氧培養（三級種子液）→成熟功能菌發酵液→應用于生產。

將功能菌發酵液一部分應用于公司擴建工程新窖人工培養窖泥的培養工藝中，在窖泥培養過程中分階段加入一定量功能菌液，添加功能菌液培養成熟的人工窖泥與同批次未添加功能菌液的人工窖泥做對比分析，同時對糊窖后窖池發酵產酒酒體中己酸乙酯含量進行對比分析。

將功能菌發酵液一部分添加到糟醅中進行強化發酵，以同批次不添加發酵液的處理作對照，最后對發酵產酒酒體中己酸乙酯含量進行對比分析。

2 結果與討論

2.1 窖泥微生物群落結構

2.1.1 門水平下窖泥中的微生物組成

基于功能基因，利用MG-RAST 中的M5NR 數據庫對其進行注釋，在門水平對不同窖齡窖泥中微生物的種類進行分析，其結果如圖1 所示。對比結果表明，2年、5年窖齡窖泥中優勢功能微生物主要分布在厚壁菌門（Firmicutes）、廣古菌門（Euryarchaeota）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinbacteria）中，相對豐度總和均超過85%；而10年、20年、50年以上窖齡及天益老號窖泥中優勢功能微生物只分布在厚壁菌門（Firmicutes）、廣古菌門（Euryarchaeota）、擬桿菌門（Bacteroidetes）中，相對豐度總和超過80%。

圖1 窖泥樣品微生物組成（門水平）

其中，厚壁菌門（Firmicutes）中的梭菌屬（Clostridium）可對大分子有機物進行代謝并生成小分子揮發性有機酸。在已有研究中，其被認為是己酸合成的主要微生物之一。而己酸及己酸乙酯則是酒中風味物質的主要貢獻者。在所有窖泥樣品中，厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度在40.6%～45.03%范圍內。最大值在2年窖齡窖泥中獲得；最小值在天益老號窖泥中獲得；隨著窖齡的增加厚壁菌門相對豐度呈下降趨勢，10年后趨于穩定。不同窖齡窖池中該類微生物的相對豐度差異并不顯著。

廣古菌門（Euryarchaeota）包含了古菌中的大多數種類，其中包括產甲烷菌。在窖池這一厭氧環境中，甲烷菌的廣泛分布已有較多報道。從廣古菌門（Euryarchaeota）的相對豐度值分析，其變化范圍介于22.5 %～26.32 %之間。其中，天益老號窖泥中，該類微生物的相對豐度最低；而在2年窖齡窖泥中，廣古菌門（Euryarchaeota）則獲得了最高的相對豐度值；隨著窖齡的增加，廣古菌門相對豐度呈下降趨勢，10年后趨于穩定。不同窖齡窖泥中該類微生物的相對豐度并無顯著差異。

擬桿菌門（Bacteroidetes）包含了擬桿菌綱、黃桿菌綱及鞘脂桿菌綱三大類細菌。窖池中的擬桿菌屬和噬胞菌屬，可以降解纖維素，為其他微生物提供能源。擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度值變化范圍介于6.50%～15.85%之間。其中，2年窖齡窖泥中，該類微生物的相對豐度最低；而在20年及以上窖齡窖泥中，擬桿菌門（Bacteroidetes）則獲得了最高的相對豐度值；隨著窖齡的增加擬桿菌門相對豐度呈上升趨勢，10年后趨于穩定。

變形菌門（Proteobacteria）是一類外膜主要由脂多糖組成的革蘭氏陰性菌，大多數具有固氮能力，兼性或專性厭氧。變形菌門在窖齡短的窖泥中所占的相對豐度值較高，2年窖齡中其相對豐度值達3.40%，5年窖齡其相對豐度值為3.01%。

放線菌門（Actinbacteria）是原核生物中的一個類群，是一類革蘭氏陽性細菌。因其菌落呈放射狀而得名。大多有基內菌絲和氣生菌絲，少數無氣生菌絲，多數產生分生孢子，有些形成孢囊和孢囊孢子。大多數為好氧，可以產生抗生素。放線菌門（Actinbacteria）在窖齡短的窖泥中所占的相對豐度值較高，在2～5年窖齡窖泥中其相對豐度值為3 %～4 %，而在10年以上窖齡窖泥中其相對豐度值下降到1.2%左右。基于功能基因的群落分析表明，不同窖齡窖池內的優勢微生物，在門水平上，其相對豐度并無顯著差別。

2.1.2 屬水平下窖泥中的微生物組成（圖2）

圖2 窖泥樣品微生物組成（屬水平）

基于功能基因，利用MG-RAST 中的M5NR 數據庫對其在屬水平進行注釋，不同窖齡窖泥中微生物的種類分析結果如圖2。根據各屬的相對豐度值，選擇數值最高的前10 類微生物進行展示，分別為：梭菌屬（Clostridium）、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）、擬桿菌屬（Bacteroides）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）、紫單胞菌屬（Parabacteroides）、互營單胞菌屬（Syntrophomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、真桿菌屬（Eubacterium）和一種產氫細菌（Ethanoligenens）。

梭菌屬（Clostridium）是一類能形成芽孢、厭氧生長的革蘭氏陽性菌，它們可對大分子有機物進行代謝并生成小分子揮發性有機酸。在已有研究中，其被認為是己酸合成的主要微生物之一。在所檢測窖泥樣品中，梭菌屬的相對豐度在5.32 %～13.26%范圍內變化。其中，最小值在2年窖齡窖泥中獲得；最大值則在50年及以上窖齡窖泥中獲得。隨著窖齡的增加，梭菌屬相對豐度值呈增長趨勢，10年后趨于穩定。10年以上窖泥梭菌屬相對豐度值為2年的2.31倍，為5年的1.46倍。

甲烷囊菌屬（Methanoculleus）是產甲烷微生物，以二氧化碳為底物，通過氫營養途徑進行甲烷的合成；但是該類產甲烷菌不能以乙酸為底物，通過乙酸營養途徑進行甲烷合成。在所有樣品中，甲烷囊菌屬（Methanoculleus）的相對豐度值介于9.75 %～13.55 %之間。最小值在天益老號窖泥中獲得，最大值在5年窖齡窖泥中獲得。隨著窖齡的增加，甲烷囊菌屬相對豐度值呈下降趨勢。

擬桿菌屬（Bacteroides）是一類革蘭氏染色陰性菌，無芽孢，專性厭氧。該類微生物可代謝大分子有機物，產生乙酸、丁酸等有機酸。在所分析窖泥樣品中，該類微生物的相對豐度值介于5.56%～6.17 %之間。不同窖齡窖泥間的擬桿菌屬（Bacteroides）相對豐度差異極小。

乳酸桿菌屬（Lactobacillus）是一群桿狀的革蘭氏陽性菌，它們能把碳水化合物（主要指葡萄糖）發酵成乳酸。釀酒微生物可以利用乳酸為底物進行其他物質的生物合成，如丙酸菌可以利用乳酸產生丙酸，丁酸菌利用乳酸為碳源生成丁酸，己酸菌利用乳酸為碳源生成己酸，乳酸通過酯化反應生成乳酸乙酯，丁酸可進一步生成丁酸乙酯，己酸可進一步生成己酸乙酯等。乳酸菌在釀酒中還發揮代謝活性作用，能直接為其他微生物提供生長繁殖可利用的必需氨基酸和各種維生素，還能提高礦物元素的生物學活性，為固態法白酒發酵微生物提供必需的營養物質，促進釀酒微生物的生長繁殖。在所分析窖泥樣品中，乳酸桿菌屬的相對豐度值介于5.41 %～8.11 %之間。其中，最小值由2年窖齡窖泥獲得；最大值由天益老號窖泥獲得；隨著窖齡的增加，乳酸桿菌屬的相對豐度值呈增加趨勢。

甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）也是一種產甲烷古菌，其既可利用二氧化碳為底物，通過氫營養途徑進行甲烷的合成；也可以乙酸為底物，通過乙酸營養途徑進行甲烷合成。在各年窖齡窖泥中，甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）的相對豐度分別為2年0.28 %、5年0.48 %、10年5.18 %、20年5.25%、50年5.30%、天益老號5.35%；隨窖齡的增加呈增長趨勢。經方差分析發現，不同窖齡窖泥間，甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）的相對豐度值具有顯著差異（p＜0.05）。基于以往研究，甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）在20年以上窖齡窖泥中是2年窖齡窖泥的18.75 倍以上；是5年窖齡窖泥的11.14倍，其相對豐度有顯著提升。

甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）為典型小聚集體八疊狀。有時聚集體為大的胞囊，具有一個共同的外壁而包裹單獨的球狀細胞。該類微生物不產生芽孢。單個的球形細胞可能對去污劑裂解或高滲敏感，無鞭毛，不可運動，是一種極端嚴格厭氧微生物。其最適NaCl 濃度為0.1～0.5 mol/L，中溫菌的最適溫度為30～40 ℃，嗜熱菌的最適溫度為50～55 ℃。該類產甲烷菌可利用乙酸或二氧化碳作為底物進行甲烷合成代謝，但從不利用甲酸。可在缺氧的海水沉積物、湖水沉積物或厭氧消化器等體系內發現分離。

在窖泥的微生物代謝網絡中，微生物將大分子有機物（纖維素等多糖、蛋白質、脂類）分解為小分子有機酸（如乙酸等）的過程中，氫氣作為代謝產物會同時生成。老窖泥中含有大量甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina），這些菌群能利用氫氣、二氧化碳或乙酸產生甲烷，這些物質都是釀酒發酵過程中的副產物，尤其是氫氣，如果不去除，就會抑制有益發酵菌群的生長。甲烷菌實際上起到了調控發酵過程的作用，它們將氫氣利用掉，產己酸菌才能正常生長，而在窖齡較小的窖泥中，由于pH 值較低，會抑制產甲烷菌的生長。因此，該菌的存在可有效降低乙酸和氫氣的累積，消除抑制效應，使后續的碳鏈延長（丁酸、己酸的合成）過程得以順利實現。

紫單胞菌屬（Parabacteroides）、互營單胞菌屬（Syntrophomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、真桿菌屬（Eubacterium）、一種產氫細菌（Ethanoligenens）在不同窖齡窖泥中的相對豐度值略小，都呈現新窖池（2～5年）窖泥中相對豐度值高于老熟窖池（10年及以上）窖泥。紫單胞菌屬（Parabacteroides）能代謝生成丁酸、乙酸等有機酸類；互營單胞菌屬（Syntrophomonas）可通過與耗氫微生物的共培養而降解熱力學上難利用的釀酒纖維素等原料；芽孢桿菌屬（Bacillus）能代謝生成丁酸、乳酸類物質；真桿菌屬（Eubacterium）能利用葡萄糖或蛋白胨產生丁酸、乙酸或甲酸；產氫細菌（Ethanoligenens）主要發酵產物為H2，起調節微生物群落代謝平衡作用。

從屬水平多樣性分析發現，甲烷囊菌屬、互營單胞菌屬在新窖池窖泥中明顯高于老窖池窖泥；而梭菌屬、甲烷八疊球菌屬在老窖池窖泥中遠遠高于新窖池窖泥。研究結果表明，梭菌屬和甲烷八疊球菌屬微生物是窖泥老熟度的標志性微生物。

2.2 窖泥功能微生物選育

2.2.1 菌株產己酸發酵條件優化

選取溫度、發酵時間、乙酸鈉和乙醇濃度進行4因素3水平設計正交實驗，實驗結果見表1。

表1 不同發酵條件對菌種產己酸的影響

表1 結果表明，乙醇濃度對菌株產己酸影響較大，其次為乙酸鈉濃度。溫度和發酵時間影響相對較小。產己酸的最適條件為：溫度35 ℃，培養時間15 d為宜，乙醇濃度2%，乙酸鈉濃度1%。

菌株發酵產己酸優化培養基：乙酸鈉1.5%，黃水2%，酵母膏1.0%，葡萄糖0.5%，K2HPO40.05%，(NH4)2SO40.05 %，MgSO40.02 %，pH6.0～6.5，滅菌后加入2 %無水乙醇。采用優化后發酵培養條件對15 株代謝己酸的單菌株進行產己酸試驗。產己酸對比分析結果見圖3。

圖3 菌株產己酸量對比分析圖

從圖3 可知，F6 產己酸能力最強。經發酵工藝的進一步優化，產己酸能力可達到18000 mg/L，為此對F6 菌株進行了16S rDNA 基因的序列分析和全自動微生物鑒定儀分析。

2.2.2 菌株16S rDNA序列分析

擴增后的片段測序（上海生工測序），通過美國國家生物技術信息中心的BLAST 搜索程序，把試驗中得到的序列信息與基因庫中的基因序列進行比較而獲得同源性分析結果（見表2）。

表2 以16 S rDNA序列為基礎各菌株的同源性比對分析

由表2 可知，該菌株與生孢梭菌、嗜胺梭菌、匙形梭菌和無害梭菌的同源性均達到了99 %，需進行進一步判定。

2.2.3 全自動微生物鑒定儀鑒定

采用Biolog 微生物鑒定儀鑒定該菌株結果見表3。經Biolog 微生物鑒定儀鑒定，篩選得到高產己酸的菌株為生孢梭菌。因此，結合分子和Biolog微生物鑒定儀鑒定結果，確定菌株為生孢梭菌（Clostridium sporogense）。

該菌株為革蘭氏陽性桿菌、產芽孢，次端生。在濕潤培養基上，菌落平坦、邊緣擴散，呈灰色，表面無光澤，半透明。生孢梭菌采用FEI QUANTA250掃描電鏡掃描到的形態結構如圖4。

2.3 窖泥功能微生物的應用

圖4 生孢梭菌（Clostridium sporogense）超微形態圖

2.3.1 功能菌株的培養

將選育的窖泥特殊功能菌株擴大培養應用于人工窖泥的培養和促進新窖老熟。培養成熟后菌液具有純正窖香味，色澤金黃，有懸絲。我們將擴大培養的窖泥功能菌液應用于人工窖泥的培養和促進新窖老熟。具體按照圖5所示進行培養。

2.3.2 應用于人工窖泥的培養（圖6）

采用微生物強化技術添加功能菌液的人工窖泥培養技術，所培養的人工窖泥窖香純正，手感柔和，細膩，黏性好，使成熟窖泥中芽孢桿菌數提高了50%以上，產己酸能力提高了1倍（表4）。

采用宏基因組技術檢測人工窖泥培養技術優化前后生產的成熟人工窖泥微生物多樣性特征，分析結果顯示：添加窖泥功能菌的成熟人工窖泥微生物種類基本一致，但生產的窖泥老熟度標志性微生物梭菌屬提高了1.73 倍，甲烷八疊球菌屬提高了2.04 倍，從窖泥微生物菌落結構和老熟度標志性微生物豐度分析已接近5年窖齡水平。

表3 篩選的細菌鑒定結果

表4 成熟人工培養窖泥性能對比分析表

表5 窖池噴淋功能菌液發酵結果對比分析

圖5 人工窖泥的培養流程圖

圖6 人工窖泥樣品微生物組成

2.3.3 應用于窖齡較短的窖池淋窖，促進新窖泥老熟

將培養成熟的窖泥菌液用酒尾稀釋（1∶50）后噴淋到剛出窖完畢的窖池窖壁（窖齡約5年），裝入糧醅進行發酵，同時做同期對比實驗。

釀酒發酵研究結果表明，窖泥功能菌液的應用，對出酒率無顯著影響，酒體中（酒樣為65 %vol～70%vol 的基酒）己酸乙酯含量提高了35%左右，己酸乙酯含量與乳酸乙酯含量比接近2∶1(表5)，達到濃香型白酒兩大酯最佳比例，酒體感官評價：香氣濃郁，味甜厚，尾味凈，未噴淋功能菌的窖池酒體感官評價香氣悶，味甜，尾味較凈。所生產的基酒質量產品優級品率提高1倍以上。

3 小結

3.1 基于宏基因組學-功能基因研究劍南春不同窖齡的窖泥微生物多樣性特征發現，窖泥微生物主要由細菌和古菌兩大類構成，在門水平上，新窖池窖泥中優勢功能微生物主要分布在厚壁菌門、廣古菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門中，相對豐度總和均超過85 %；而老窖池窖泥中優勢功能微生物只分布在厚壁菌門、廣古菌門、擬桿菌門中，相對豐度總和超過80%。

3.2 從屬水平多樣性分析發現，甲烷囊菌屬、互營單胞菌屬在新窖池窖泥中明顯高于老窖池窖泥；而梭菌屬、甲烷八疊球菌屬在老窖池窖泥中含量遠遠高于新窖池窖泥。研究結果表明，梭菌屬和甲烷八疊球菌屬微生物是窖泥老熟度的標志性微生物。

3.3 在劍南春老窖泥中分離到1 株高產己酸的功能微生物，產己酸能力可達18000 mg/L，定性為生孢梭菌。

3.4 窖泥功能微生物應用于人工窖泥的培養，人工窖泥產己酸能力提高近一倍，酒體中己酸乙酯含量提高了60 %，有效縮短了新窖老熟周期。應用于新窖老熟，同樣使得酒體中的己酸乙酯提高了67%，確保濃香型白酒濃郁幽雅的典型風味特征，產品優級品率提高了1倍以上。