正交試驗聯合CCD-RSM優化濕熱消顆粒中總黃酮提取工藝研究*

梁國成,陳舒茵,黃小鷗,方建康,馮文勇,覃 翔,黃 敏,荀建寧

1.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院(南寧530011)；2.廣西大學(南寧 530004);3.廣西中醫藥大學第一附屬醫院(南寧530023)

正交試驗是目前國內較為常用的用于研究中藥復方成分的提取工藝的試驗設計方法，采用的是線性的數學模型進行優化[1-2]；星點設計(Central composite design,CCD)是一種公認的較為科學的實驗設計方法，在國外應用較廣，其主要是基于非線性的數學模型的擬合，是一種多因素多水平優化設計的方法，試驗數據的處理可用三維效應面(Response surface)進行，再此基礎上以非線性方程擬合，即試驗預測的結果可在模擬方程的基礎上較好地得到反映[3]。效應面優化法(Re-sponse surface methodology)亦是國外流行的一種通過實驗而尋求最優條件的試驗方法，較多用于非線性數據的處理，此法即通過回歸方程的擬合，繪制相應的響應曲面和等高線，通過比較各實驗數據即可簡便快速的得到各數值相應的響應值，從而得到預測的響應最優值，以及相應的實驗條件[4]。

慢性前列腺炎(Chronicprostitis，CP)是臨床上常見的男性科疾病之一，相關數據顯示，所有男性科疾病當中，CP占比達1/3，且發病年齡以20歲至40歲年齡段的青中年居多，超過50%的男性均出現過不同程度的CP癥狀[5]。濕熱消顆粒是根據廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院男性科名老中醫的驗方改劑型而制成，由金錢草，丹參，虎杖等中藥組成，具有清熱利濕、活血消炎的作用，能有效防治CP[6-8]，但關于濕熱消顆粒防治CP的藥效作用物質基礎及其總物質的研究未見報道。現代藥理研究證實，總黃酮為防治CP的有效成分之一[9-11]，處方中金錢草、厚樸、丹參及虎杖等均含黃酮類成分，筆者嘗試采用正交試驗聯合星點設計-效應面法研究其總黃酮的提取工藝。

資料和方法

1 儀 器 AE240分析天平(梅特勒-托利多公司)，DK-S26電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)，L6紫外可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)。

2 試劑與試藥 濕熱消顆粒處方藥材均購自廣西德潤堂中藥科技有限公司，槲皮素對照品(中國食品藥品檢定研究院，100081-201610，含量測定用)，乙醇(南京化學試劑股份有限公司，分析純)，無水乙醇(廣東翁江化學試劑有限公司，分析純)，AlCl3(天津市大茂化學試劑廠，分析純)，NaCH3COOH(天津市大茂化學試劑廠，分析純)，純化水(自制)。

3 研究方法

3.1 對照品溶液的制備： 取適量槲皮素對照品，精密稱定為10.07 mg，以70%乙醇定容于50 ml容量瓶中，再精密量取25 ml至50 ml容量瓶中，加70%乙醇至刻度線，搖勻，即得。

3.2 供試品溶液的制備： 取處方量藥材10 g，按各試驗條件設計進行提取，合并提取液，過濾，定容至1000 ml容量瓶，精密量取10 ml供試液，蒸干，精密加入70%乙醇10 ml，定容，超聲1 h，補足損失，過濾，移至10 ml容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度線，混勻備用。

3.3 最大吸收波長的考察： 分別精密量取上述對照品溶液及供試品溶液各1 ml，置于10 ml容量瓶中，20℃水浴加熱，先加入1.2 ml的0.1 mol/L的AlCl3，后加入1.8 ml的1 mol/L的NaCH3COOH溶液，反應2 min后取出，用70%乙醇定容，搖勻，待溶液溫度降至室溫[12]，以相應試劑為空白，在200～500 nm波長范圍進行掃描。結果顯示，槲皮素對照品溶液與供試品溶液的最大吸收波長均位于442 nm處，且光譜圖基本一致，最終選擇檢測波長為442 nm。

3.4 線性及線性范圍的考察： 精密量取槲皮素對照品溶液1 ml、2 ml、4 ml、6 ml、8 ml分別置于10 ml容量瓶中，20℃水浴加熱，先加入1.2 ml的0.1 mol/L的AlCl3，后加入1.8 ml的1 mol/L的NaCH3COOH溶液，反應2 min后取出，用70%乙醇定容，搖勻，待溶液溫度降至室溫，以相應試劑為空白，紫外-可見分光光度計于442 nm處測量吸光度值，繪制標準曲線，以吸光度A為縱坐標(Y)，槲皮素含量(mg)為橫坐標(X)，回歸方程為Y=10.395X+0.067，R2=0.9996。

3.5 精密度試驗：精密吸取“供試品溶液的制備”項下供試品，在442 nm波長下，連續測定5次，其吸光度的RSD%=0.85%，表明精密度良好。

3.6 穩定性試驗： 精密吸取“供試品溶液的制備”項下供試品，在442 nm波長下，分別于0，1，2，4，8，12 h測定，測定6次，其吸光度的RSD%=0.79%，表明在測定時間(12 h)內供測定樣品的穩定性良好。

3.7 重現性試驗：取5份濕熱消顆粒(同一批次)，分別按“供試品溶液的制備”項下平行制備供試品溶液，依法進行操作及測定，吸光度的RSD%=1.15%，表明本操作及檢測方法重現性良好。

3.8 回收率試驗：取5份供試品(已知含量)并精密稱定，分別精密加入槲皮素對照品，照“供試品溶液的制備”項下操作，依法測定吸光度并計算總黃酮的含量，結果平均回收率為92.82%，RSD%=2.76%。

3.9 總黃酮的回流提取工藝操作： 準確稱取適量處方量藥材(事先經60℃下干燥2 h)，以規定量濃度的一定量乙醇浸泡0.5 h，加熱沸騰煎煮至規定的時間，濾取藥液后依法再進行煎煮，再濾取藥液，與前次所得藥液合并，濃縮、干燥，稱取干膏量(g)并測定其中總黃酮含量(mg/g)，以干膏量及總黃酮含量為指標，優選影響結果的各關鍵工藝參數。

3.10 正交試驗設計：影響提取工藝的關鍵因素通常有：提取所用乙醇的濃度(%)、每次提取用溶劑的用量(倍)、沸騰提取的時間(h)和提取的次數(次)，故本試驗就此四者，進行L9(34)正交試驗考察。

表1 總黃酮提取工藝因素水平表

結 果

試驗結果可直觀分析得到，以干膏得量(g)為觀察指標時，A因素和C因素均對本試驗提取工藝過程產生有顯著影響，通過對比考察的各因素影響主次分別為：A>C>B>D，即乙醇濃度>提取時間>溶劑用量>提取次數；直觀分析得知，各因素中：A2>A3>A1，B3>B1>B2，C3>C2>C1，D3>D2>D1，即組合為A2B3C3D3。

以總黃酮含量(mg/g)為指標時，A因素對本試驗提取工藝過程產生有顯著影響，通過對比考察的各因素影響主次為：A>B>C=D，即乙醇濃度>溶劑用量>提取時間=提取次數；直觀分析得知，各因素中：A3>A2>A1，B3>B1>B2，C1>C3>C2，D2>D1>D3，即組合為A3B3C1D2。

據綜合表3直觀分析結果及綜合考慮各因素對提取的貢獻率以及能源損耗與工藝耗時等因素，在干膏中總黃酮含量相差不大的情況下，以干膏得量為主要指標。綜上所述，最佳提取工藝組合為A2B3C3D2，即用12倍量的60%乙醇提取2次，每次提取2 h。

表2 總黃酮提取工藝試驗結果

表3 總黃酮提取工藝直觀分析結果

表4 總黃酮提取工藝干膏得量方差分析結果

表5 總黃酮含量方差分析結果

注：F0.01(2,2)=99.0；F0.05(2,2)=19.0；F0.10(2,2)=9.0

1 提取工藝驗證 準確稱取3批處方量藥材(已于60℃下干燥2 h)，以12倍量乙醇(60%濃度)浸泡0.5 h，沸騰提取2次，每次2 h，濾取藥液后合并2次提取液，濃縮、干燥，稱取干膏得量并計算其總黃酮含量，結果平均干膏得量為12.0639 g，RSD=2.17%；平均總黃酮含量為35.1558 mg/g，RSD=1.01%。證實所選工藝穩定、可靠。

2 星點設計-效應面法試驗設計及結果 因提取次數為非連續性的，而星點設計試驗各因素應是連續性的，故本次試驗暫定提取次數為2次，考察乙醇濃度(A)、溶劑用量(B)和提取時間(C)，以干膏得量與總黃酮含量為指標，綜合評分。根據正交試驗數據基礎和星點設計試驗的原理，每因素設置5水平，各因素極大、極小水平值根據預試驗結果設立，代碼分別為±α，±1，0，再遵循“任意兩個物理量之間的差值與對應代碼之間的差值呈等比關系”的原則安排試驗的水平，通過建立相關的模型擬合效應及因素，進而可以直觀地描繪得到三維效應面，最后可從較優的效應面區域中快速地讀取本次試驗最佳的工藝條件[13]。采用Design Expert 10.0.7軟件安排實驗，試驗設計與結果見表6～8。

采用多元線性模型對各影響因素和指標進行回歸計算，方程為R1=+88.73+5.56×A+4.38×B+1.29×C(R2=0.6816，P<0.05)。采用二次多項非線性模型對各影響因素和指標進行回歸計算，方程如下：R1=+96.76678+5.55837×A+4.38024×B+1.28578×C+2.36625×A×B+0.053750×A×C+0.84875×B×C-5.50696×A2-4.14754×B2-2.12168×C2(R2=0.8324，P<0.01)

采用Design Expert 10.0.7軟件繪制模型中任意兩因素對各評價指標的效應面圖和等高線圖，分析結果可知，多元線性回歸模型擬合度不佳，預測性不理想。對各因素進行二次多項式擬合，方程擬合度良好，表明模型能較好且誤差較小的反映響應值的變化，且具有顯著影響，可較好的對提取工藝進行分析和預測。預測的三因素的最優條件所在區域為：A：60%～70%，B：11～12倍量，C：105～115min；考慮到生產實際情況，對實驗結果進行了微調，最終優選的處方為A(乙醇濃度)為以11倍量65%乙醇進行提取2次，每次110 min。

表6 總黃酮提取工藝星點設計因素及水平表

表7 總黃酮提取工藝星點試驗設計與結果

表8 二次多項回歸方程方差分析結果

注：*P<0.05，△P<0.01， ◇P<0.0001

處方驗證：根據優化出的處方，依法制備了3批樣品，進行驗證，并以公式“偏差=(預測值-實際值)/預測值×100%”計算偏差[14-15]，結果實際值和預測值偏差絕對值均小于5%，表明試驗所得到的結果達到預期目的。

討 論

正交試驗設計是目前國內比較成熟的、用于研究多因素、多水平的一種高效、快速、經濟的試驗設計方法，能夠極大的減少試驗次數且不會降低試驗的可行性，其根據試驗的正交性，從整體試驗過程中，有針對性的選擇部分有代表性的試驗點進行試驗比較，所選的試驗點具有“均勻分散，齊整可比”的特點。正交表是將預試驗中所選的影響試驗的各水平和因素組合排列成相應的表格，開始由日本著名的統計學家田口玄一提出，經廣泛的應用證實，其能夠極大程度的減少試驗次數，減少試驗的工作量，為廣大科研工作者所接受和采用，現已廣泛應用于生產和科研等很多領域的研究中[16-17]。

星點設計-效應面法是國外常用的用于優化非線性擬合試驗設計的方法，采用歸一化幾何平均數法處理數據，能夠消除各個評價指標單位或量綱不同所引進的不確定因素，預測能力強、精度高[18-19]，且利用對應軟件建立模型，繪制三維效應曲面關系圖，并可旋轉，能夠更好、更直觀的解決目前國內正交試驗設計等方法試驗精度不夠、不能靈敏的體現各因素間交互作用等缺點[20]。本試驗通過星點設計-效應面法優選最佳取值區域，并選取最優工藝參數進行實驗驗證，結果表明該組數據帶入最佳模型方程獲得的理論預測值與實測值比較吻合，證實所建立的數學模型具有較好的預測性，表明采用星點設計-效應面法優化本制劑中總黃酮的提取工藝，達到實現多指標同步優化的目的是可行的。