鹵代有機污染物抑制甲狀腺激素代謝酶活性的研究進展

耿利鳴，馬廣才，尉小旋，于海瀛

浙江師范大學地理與環境科學學院，金華 321004

鹵代有機污染物(halogenated organic contaminants, HOCs)常作為原材料、中間體和溶劑等廣泛應用于有機合成中，在人類生產和生活中發揮了重要作用，例如四溴雙酚A(tetrabromobisphenol A, TBBPA)和多溴聯苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)作為常用的溴代阻燃劑(brominated flame retardants, BFRs)，廣泛添加在電子產品和紡織品等日常用品中，也可以作為中間體合成其他復雜的阻燃劑[1-2]。該類化合物具有高毒性、高持久性、生物累積性、半揮發性和疏水性等性質，在生產和使用過程中，通過各種途徑進入環境。近年來，HOCs的生態環境安全和健康效應受到了很多關注[3]。體外(in vitro)和體內(in vivo)實驗表明，許多HOCs具有內分泌干擾效應，能夠干擾人和動物的雌激素、甲狀腺激素(thyroid hormones, THs)等內源性激素的體內平衡，引起健康問題[4-8]。特別是THs，作為生物體代謝、骨重塑、心臟功能和精神狀態的調節劑，參與多種生理過程，對于正常的機體和智力發育至關重要[9-10]。本文簡要介紹了HOCs影響THs功能的途徑，在此基礎上，重點綜述了HOCs對參與THs代謝的生物酶抑制效應的研究，并討論了環境計算化學和預測毒理學方法在該領域的重要應用，以期為HOCs干擾甲狀腺激素酶代謝活性的研究和發展方向提供參考。

1 甲狀腺激素及其干擾效應(Thyroid hormones and their disrupting effects)

1.1 甲狀腺激素的結構與功能

THs是由甲狀腺產生和釋放的內源性激素，包括三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine, T3)和甲狀腺氨酸(thyroxine, T4)，結構如圖1所示。血清中THs的水平受到下丘腦-垂體-甲狀腺軸(hypothalamus-pituitary-thyroid axis, HPT)反饋的調節，維持THs水平的相對穩定。下丘腦釋放促甲狀激素釋放激素(thyroid releasing hormone, TRH)調節腺垂體促甲狀腺激素(thyroid-stimulating hormone, TSH)的分泌，TSH則調控甲狀腺細胞分泌甲狀腺激素T4和T3；當血液中T4和T3濃度增高后，通過負反饋作用，抑制腺垂體TSH的合成和釋放，使TSH分泌減少，從而使THs分泌不至于過高；而當T4和T3降低時，對腺垂體的負反饋作用減弱，TSH分泌增加，促使T4和T3分泌增多[11-13]。

圖1 甲狀腺激素T3和T4結構式注：T3表示三碘甲狀腺原氨酸；T4表示甲狀腺氨酸。Fig. 1 Structures of thyroid hormones T3 and T4Note: T3 stands for triiodothyronine; T4 stands for thyroxine.

THs是基于酪氨酸的激素，主要負責調節新陳代謝。THs進入血液后，通過運甲狀腺素蛋白(transthyretin, TTR)、甲狀腺結合球蛋白(thyroxine-binding globulin, TBG)及白蛋白(albumin, ALB)等輔助轉運至外周靶組織，進而發揮其生物學作用[11,14]。T4幾乎沒有生物活性，在脫碘酶(deiodinases, DIs)的催化作用下通過外環脫碘形成具有生物活性的T3[15]。T3與甲狀腺受體結合，進而激活THs介導的生物信號，產生各種生理效應。在肝臟中，THs可被磺基轉移酶(sulfotransferases, SULTs)代謝，增加THs水溶性，然后經膽汁、尿液和皮膚等排出體外。

THs具有重要的生理功能[9-10,16-18]：可促進生長發育，主要促進骨骼、腦和生殖器官的生長發育，若沒有THs，垂體的生長激素也不能發揮作用；可調節長骨生長和神經成熟；通過增加交感神經活動增強身體對兒茶酚胺(如腎上腺素)的敏感性；提高神經系統的興奮性；調節蛋白質、脂肪和碳水化合物的代謝，刺激維生素代謝等，提高機體的耗氧率，增加產熱效應。THs幾乎作用于體內的每一個細胞，對生物體所有細胞的發育和分化至關重要。因此，維持正常的THs水平對于機體健康至關重要。

1.2 鹵代有機污染物的甲狀腺激素干擾效應

實驗研究表明，HOCs進入生物體后，可能會通過以下3種途徑影響THs功能的正常發揮：

(1)干擾THs的合成[19-20]。HOCs通過干擾甲狀腺攝碘、甲狀腺過氧化物酶(thyroid peroxidase, TPO)和甲狀腺球蛋白(thyroglobulin, TG)等干擾THs合成，進而影響THs水平。TPO是在THs合成中發揮重要作用的酶，可催化碘化酪氨酸殘基產生甲狀腺激素前體。TG可用來合成THs，一般情況下，TG的表達升高，THs水平相應升高。THs水平也可通過負反饋調節作用調控TG表達。

(2)干擾THs在血液中的轉運以及與受體結合的過程。由于與THs結構上的相似性，HOCs及其羥基、甲氧基代謝物可競爭結合甲狀腺激素轉運蛋白，如TTR[21-24]和TBG[25]，進而影響THs在血液中的正常輸送。同時，這些化合物也可以與甲狀腺激素受體，如TRα或TRβ相結合[26-27]，從而阻礙T3與TRs的正常結合。特別是羥基多溴聯苯醚(OH-PBDEs)，與甲狀腺激素轉運蛋白和甲狀腺激素受體的結合能力顯著高于其母體化合物，表現出更高的甲狀腺干擾效應[28]。

(3)干擾THs的代謝過程。人體內的THs穩態同時受脫碘、葡萄糖醛酸化和硫酸化等過程的調節[4,29]。目前，逐漸有研究開始關注HOCs對參與THs代謝過程的酶以及酶催化效果的影響，發現很多HOCs可以抑制甲狀腺激素SULTs和DIs的活性[6,30-33]。針對具體的分子機制，也出現了一些代表性的工作。本文接下來將重點介紹HOCs對不同甲狀腺激素酶代謝抑制效應的研究進展。

2 鹵代有機污染物對甲狀腺激素酶代謝抑制效應的研究進展(Research progress in the inhibition of thyroid hormones metabolism by halogenated organic contaminants)

2.1 鹵代有機污染物對甲狀腺激素磺基轉移酶的抑制效應

磺酸化過程是藥物和環境化學品以及內源性化合物在生物體內的主要結合反應之一[32]。通常與磺酸鹽結合被認為是天然的解毒機制，可增加各種內源和外源親脂性化合物的水溶性并促進其在膽汁和尿液中的排泄。THs可通過酚羥基與磺酸鹽結合而發生代謝，引發THs的不可逆降解[29]。SULTs是THs磺酸化代謝的關鍵酶類，存在于肝、腎上腺和腎等組織器官中，在多種生物過程中(如細胞通訊、生長、發育和防御)發揮著重要作用，可參與許多內源性物質和異生素如羥基類固醇、THs、膽汁酸和單胺類神經遞質的II期代謝，催化其生物轉化[34-36]。磺酸化過程使用3’-磷酸腺苷-5’-磷酰磺酸(3’-phospate-5’-phosphosulfate, PAPS)為磺酸鹽供體，將磺基轉移到底物的—O、—N或—S等受體基團，催化底物與磺酸鹽結合[37](圖2)。

圖2 SULTs催化THs磺酸化機制注：SULTs表示磺基轉移酶；THs表示甲狀腺激素；PAPS表示3’-磷酸腺苷-5’-磷酸磺酸鹽；PAP表示3’,5’-二磷酸腺苷；3,3’-T2表示3,3’-二碘甲腺原氨酸。Fig. 2 The mechanism of THs sulfonation catalyzed by SULTsNote: SULTs stands for sulfotransferases; THs stands for thyroid hormones; PAPS stands for 3’-phospate-5’-phosphosulfate; PAP stands for 3’,5’-bisphosphate; 3,3’-T2 stands for 3,3’-diiodothyronine.

基于氨基酸序列的同一性及其催化功能，磺基轉移酶可分為酚和羥基類固醇磺基轉移酶2個家族[38-41]。THs是酚磺基轉移酶的內源性底物，該酶的晶體結構最初由Sekura等[42]表征。已有研究證實幾種大鼠磺基轉移酶(rSULTs)和人類磺基轉移酶(hSULTs)可催化THs磺酸化[43-44]。Visser等[33]對大鼠及人肝細胞溶質、重組rSULT1C1和hSULT1A1的碘甲腺原氨酸磺基轉移酶活性進行了初步表征，發現上述酶催化不同THs磺酸化的順序為3,3’-二碘甲腺原氨酸(3,3’-diiodothyronine, 3,3’-T2) > T3 ≈ 3,3’,5’-三碘甲狀腺原氨酸(3,3’,5’-triiodothyronine, rT3) > T4，說明T3和T4的脫碘產物3,3’-T2是SULTs活性最強的底物。人體中已鑒定出8種可以催化THs磺酸化的SULTs同工酶，包括SULT1A1、SULT1A3、SULT1A5、SULT1B1、SULT1B2、SULT1C1、SULT1E1和SULT2A1[31, 33]，其中SULT1A1具有最廣泛的特異性，對PAPS和碘甲狀腺原氨酸的親和力最高[45-46]。

Butt和Stapleton[31]測定了OH-PBDEs等溴代阻燃劑和鹵代酚對人肝細胞質SULTs催化轉化3,3’-T2的半數最大抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)數據，結果顯示，所研究的OH-PBDEs和鹵代酚化合物均對3,3’-T2的催化磺酸化表現出抑制效應，其中2,4,6-三鹵代酚的抑制效應最強，且IC50值處于nmol·L-1水平；鄰位(ortho)和對位(para)-OH取代的OH-PBDEs會增強對SULTs催化活性的抑制；Br取代數目越多的OH-PBDEs，分子的空間位阻越大，會降低其抑制作用；對于不同鹵素取代的化合物而言，2,4,6-三氟酚(2,4,6-trifluorophenol, 2,4,6-TFP)、2,4,6-三氯酚(2,4,6-trichlorophenol, 2,4,6-TCP)和2,4,6-三溴酚(2,4,6-tribromophenol, 2,4,6-TBP)顯示大致相等的抑制效應，2,4,6-三碘酚(2,4,6-triiodophenol, 2,4,6-TIP)表現出較低的抑制效應；鹵代雙酚A化合物相對抑制效應順序為：3,3’,5,5’-四氯雙酚A(3,3’,5,5’-tetrachlorobisphenol A, TCBPA) ≈ TBBPA > 4,4’-(六氟異亞丙基)-雙酚(4,4’-(hexafluoroisopropylidene)-diphenol, BPA AF) > 3,3’,5,5’-四碘雙酚A(3,3’,5,5’-tetraiodobisphenol A, TIBPA)。此外，通過構建OH-PBDEs化合物IC50值的定量結構-活性關系(QSAR)模型，發現IC50值與化合物羥基基團的酸堿解離常數(pKa)存在正相關關系，pKa值越小的OH-PBDEs具有越強的干擾效應，表明可電離化合物與SULTs的相互作用也可能具有形態依賴性。

Leonetti等[47]進一步選取PBDEs、OH-PBDEs和2,4,6-TBP等溴代阻燃劑，研究其對人胎盤絨膜癌細胞(BeWo)中SULTs催化THs磺酸化活性的影響，發現2,4,6-TBP、3-OH BDE47和6-OH BDE47均顯示SULTs活性抑制，且2,4,6-TBP和3-OH BDE47的抑制效應最強；質譜法檢測得到了3-OH BDE47的磺酸化代謝物，證明3-OH BDE47可以作為底物與THs競爭結合SULTs并進行磺酸化。para-OH取代的OH-PBDEs結構上更類似于3,3’-T2，使得OH-PBDEs抑制活性增強。然而3-OH BDE47的暴露可檢測到其磺酸化產物的存在，表明3-OH BDE47能夠更好地進入SULTs結合口袋，并且與活性位點相互作用，從而允許-OH的硫酸化。

以上2項研究結果均顯示，分子中-OH的存在對該類外源性化合物抑制SULTs催化3,3’-T2磺酸化起到重要作用，3-OH BDE47比6-OH BDE47更能有效抑制SULTs的活性。2項研究使用了不同組織來源和類型的SULTs，可能會有不同的SULTs表達水平，并且抑制作用的分子機制有待進一步闡述。

除hSULTs外，某些rSULTs也可催化THs磺酸化。已有研究證實SULT1B1[48]和SULT1C1[49-50]可催化碘甲狀腺原氨酸磺酸化，且SULT1C1僅在雄性大鼠肝臟中表達，而SULT1B1的表達與性別無關，但尚未證實大鼠SULT1A1能否催化THs磺酸化[33]。Schuur等[6]以125I標記的3,3’-T2為底物，以大鼠肝細胞溶質作為SULTs的來源，研究多氯聯苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)、二苯并對二惡英(dibenzo-p-dioins, PCDDs)和二苯并呋喃(dibenzofurans, PCDFs)及其羥基化代謝物對SULTs催化磺酸化活性的抑制作用，發現化合物抑制3,3’-T2磺酸化活性的最重要的結構特征是分子中有羥基基團；此外，鹵素取代模式對3,3’-T2磺基轉移酶的抑制也有影響，BPA衍生物只有被溴或氯取代時才抑制3,3’-T2的磺酸化。

Schuur等[51]使用大鼠肝細胞溶質的體外實驗結果表明，OH-PCBs抑制SULTs活性的IC50值在nmol·L-1范圍內；對位或間位羥基取代是該活性抑制的重要結構要求；OH-PCBs對T2的磺基轉移酶抑制活性與T3相似，再次表明T2可以用作T3的模型，作為碘代甲腺原氨酸磺基轉移酶抑制劑表征的底物。進一步研究發現：以雌性大鼠肝細胞溶質為SULTs的來源，測得OH-PCBs的IC50值與使用雄性大鼠肝細胞溶質、大鼠SULT1C1和人SULT1A1的IC50值相似[32]。

2.2 鹵代有機污染物對THs脫碘酶的抑制效應

除磺基轉移酶外，DIs也對THs的代謝起到重要作用。THs通過DIs在外周組織中代謝。DIs是含有硒代半胱氨酸的蛋白質，催化THs在體內的脫碘代謝，是調節THs內穩態的重要因素[52]。T4脫碘形成rT3(內環脫碘，inner ring deiodination, IRD)及T3(外環脫碘，outer ring deiodination, ORD)，T3和rT3可進一步脫碘形成3,3’-T2[29,52](圖3)。目前，已鑒定出3種DIs(DI-1, DI-2和DI-3)具有外環和/或內環脫碘活性，且在THs生物活性的組織特異性調節中起重要作用。另外，THs的酚羥基基團可以與葡糖醛酸和磺酸鹽結合，并且磺酸鹽綴合物更容易脫碘，從而引發激素的不可逆降解。In vivo實驗已經證實T4磺酸化將內環脫碘水平提高約200倍，形成rT3磺酸鹽[53]。

Butt等[30]采用光譜測定法研究特定鹵素對DIs抑制的作用，選用氟、氯、溴和碘取代的2,4,6-三鹵代苯酚和BPA衍生物、BDE99及OH-PBDEs等進行詳細分析。研究發現，所有的BPA衍生物對T3和3,3’-T2的形成都顯示出一定的抑制效應，抑制強度為TBBPA>TCBPA>TIBPA>BPA AF，其中TBBPA

圖3 DIs(DI-1, DI-2和DI-3)催化THs區域選擇性脫碘注：DIs表示脫碘酶；rT3表示3,3’,5’-三碘甲狀腺原氨酸；ORD表示外環脫碘；IRD表示內環脫碘；DI-1可催化ORD和IRD，DI-2僅催化ORD，DI-3僅催化IRD。Fig. 3 Regioselective deiodinations of thyroid hormones by three DIs (DI-1, DI-2, and DI-3)Note: DIs stands for deiodinases; rT3 stands for 3,3’,5’-triiodothyronine; ORD stands for outer ring deiodination; IRD stands for inner ring deiodination; DI-1 can catalyze the ORD and IRD; DI-2 only catalyzes the ORD; DI-3 only catalyzes the IRD.

是最有效的DIs抑制劑。對于2,4,6-三鹵苯酚而言，隨著鹵素分子量的增加，其抑制強度相應增加，2,4,6-TIP > 2,4,6-TBP > 2,4,6-TCP > 2,4,6-TFP。研究還發現，與抑制磺基轉移酶活性相似，化合物分子中羥基基團的存在也對DIs的抑制效應具有重要作用。值得一提的是，5-OH BDE47和4’-OH BDE101未觀察到DIs抑制效應，5’-OH BDE99不抑制rT3的形成，原因可能是這些化合物對DI-1的抑制機制與其他化合物不同，但具體的分子機制目前尚不清楚，需要進一步的研究。

Roberts等[54]在PBDEs及其羥基代謝產物對體外培養的人膠質細胞DI-2活性的破壞研究中發現，其抑制活性為3-OH BDE47 > 5’-OH BDE99 > BDE99，而BDE47不能抑制DI-2的活性。Butt等[30]的研究顯示，5’-OH BDE99能夠同時抑制人肝微粒體中的DI-1和DI-2的活性，并且對DI-2的活性抑制能力更強，IC50值分別為400 nmol·L-1(DI-1)和(16.6 ± 1.1) μmol·L-1(DI-2)。

此外，Szabo等[55]研究了DE-71(商業化五溴二苯醚混合物)對雄性大鼠不同發育時間點THs代謝相關基因的影響。研究發現，暴露于DE-71的大鼠雄性幼仔DI-1活性降低：幼仔出生4 d后，DI-1活性降低60%；幼仔出生21 d后，DI-1活性降低70%。然而，該DE-71含有低水平的溴化二惡英和二苯并呋喃，需要進一步研究確定暴露于純化的多溴二苯醚同源物的DI-1活性變化情況。

3 環境計算化學方法在甲狀腺激素酶代謝抑制作用研究中的應用(Application of environmental computational chemistry methods in the study on the inhibition of thyroid hormones metabolism)

體內(in vivo)或體外(in vitro)實驗是獲取化學物質潛在干擾效應的有效途徑。然而，考慮到使用人體組織所涉及的復雜性，且研究中存在眾多混合變量，而這些變量不易控制，對實驗結果有影響；另外，由于分子水平作用機理研究的必要性，計算化學方法正在發揮越來越重要的作用[56-57]。環境計算化學，使用計算化學方法結合計算機模擬技術，不依賴于儀器設備與化學試劑，基于一定的實驗，在分子水平上對體系進行精細的理論研究，能深入了解有機污染物與受體之間的作用方式和結合過程等，具有實驗研究不可替代的優勢，在生物酶催化有機物代謝、有機污染物的遷移轉化等領域得到了廣泛應用。在污染物的毒性作用機理和環境行為的分子機制方面，通過環境計算化學方法，不僅可以揭示其在生物體內與生物大分子的作用機制，也為深入解釋實驗現象提供幫助。目前，分子對接技術、量子化學計算等方法已經廣泛用于模擬HOCs與TR[57-59]和TTR[21,60]的相互作用，為深入理解HOCs對THs抑制作用的機理做出了重要貢獻。近年來，研究人員逐漸使用環境計算化學方法在HOCs抑制SULTs與DIs催化活性的分子機制方面進行了初步探索，取得了一定進展。

Butt和Stapleton[31]采用分子對接技術研究了OH-PBDEs和SULT1A1之間的潛在相互作用，揭示了OH-PBDEs分子在SULT1A1活性中心的位置和取向以及氫鍵的形成。結果顯示，在酶活性位點處，3,3’-T2與SULT1A1殘基Lys 106和His 108的—OH形成氫鍵相互作用，且與PAPS輔因子相鄰，以利于接下來的磺酸化反應。所有對位取代的OH-PBDEs會在相似位置與Lys 106和His 108形成氫鍵作用，表明由于結構的相似性，OH-PBDEs可能會與3,3’-T2競爭結合SULT1A1。

多個研究顯示，HOCs羥基代謝產物中羥基基團的存在對SULTs和DIs的代謝活性具有重要影響[6,30-31,47,54]。羥基基團在生理(pH = 7.0～7.4)條件下會發生解離，且Yang等[60]采用量子力學耦合分子力學(quantum mechanical/molecular mechanical, QM/MM)方法研究羥基解離對酚類化合物與人運甲狀腺素蛋白(hTTR)的結合作用的影響時發現，陰離子酚類化合物與hTTR的結合強于它們的中性形式，說明分子解離對甲狀腺激素干擾效應具有重要影響，實驗時分子解離效應不應被忽略。

近期，我們課題組使用了17個具有較低Br原子數取代的OH-PBDEs，首次進行了系統的計算模擬，揭示了OH-PBDEs與hSULT1A1可能的結合模式和抑制機理。分子對接結果表明，大多數OH-PBDEs會與SULT1A1的2個殘基Lys 106和His 108形成氫鍵，并且中性OH-PBDEs與其陰離子對應物顯示出相似的結合能。進一步使用QM/MM方法模擬了OH-PBDEs與SULT1A1的相互作用，基于計算結果首次提出了包括質子轉移和磺酸化2個步驟的SULT1A1代謝OH-PBDEs的分子機制，特別是含有3個和少于3個Br原子的OH-PBDEs可以作為SULT1A1的底物被酶催化形成磺酸化產物，其他OH-PBDEs可能僅與SULT1A1形成三元死結復合物從而抑制酶活性。此外，計算結果揭示了SULT1A1抑制的重要結構需求，不同—OH取代位置的OH-PBDE的抑制活性順序為ortho-OH BDE > meta-OH BDE > para-OH BDE。同時，OH-PBDEs中Br原子的空間位阻效應也會影響磺酸化反應過程，Br個數越多，越不利于磺酸化反應。

Marsan和Bayse[61]使用密度泛函理論(density functional theory, DFT)研究了THs衍生物和PBDEs/OH-BDEs與DIs活性位點的甲基硒酸鹽的鹵鍵(halogen bonding, XB)相互作用的強度。研究發現，XB作用的強度取決于鹵素的位置、環上鹵原子的數目以及羥基與XB位點的接近程度。無論是從它們的相互作用能還是C—Br鍵的活化方面來看，PBDEs/OH-PBDEs可以競爭性地結合活性位點硒代半胱氨酸(Sec170)，與MeSe-形成弱的XB相互作用，抑制THs脫碘代謝。高溴化PBDEs/OH-BDEs可能會發生脫溴，并具有與THs脫碘相似的作用能；相對于醚基，XB相互作用往往在鄰位和間位最有利，而在對位則較弱。

4 總結與展望(Summary and prospect)

作為THs干擾效應的重要機制，HOCs對THs代謝過程中相關酶的抑制作用正引起越來越多的關注。總結國內外研究進展發現，雖然相關工作已陸續開展，尚有許多科學問題未解決，例如：HOCs抑制SULTs與DIs活性的分子機制如何？HOCs是僅通過競爭結合位點來抑制THs活性，還是作為底物與酶反應，從而使THs活性受到抑制？不同鹵素種類、取代位置和數量等結構因素對酶活性抑制作用的影響如何？這些問題均需進一步研究探討；此外，已有研究發現分子中—OH的存在是HOCs抑制甲狀腺激素酶代謝活性的重要分子結構特征，但是羥基解離是否會對相關酶代謝的抑制產生影響，尚未有直接研究，需要進一步探索。在開展實驗研究的基礎上，結合理論計算化學方法進行分子模擬，將會從分子水平上揭示該類化合物對THs相關酶代謝過程抑制的機制，闡明導致甲狀腺激素干擾效應的分子起始事件(molecular initiating events, MIEs)，進一步服務于化合物的有害結局路徑(adverse outcome pathway, AOP)研究和健康風險評價。