十溴二苯乙烷對部分血糖內分泌干擾的計算機輔助理論研究

張天慶，楊秀榕，曾凡剛，張嚴,*

1. 中央民族大學生命與環境科學學院，北京 100081 2. 中國人民大學環境學院，北京 100872

十溴二苯乙烷(decabromodiphenyl ethane, DBDPE)是一種高效、環保的溴代阻燃劑，長期以來被人們認為難以進入環境以及生物體內并產生蓄積。然而，在2003年，Kierkegaard等[1]首次從下水道淤泥中檢測出DBDPE。隨后一些調查表明DBDPE已廣泛分布在水、空氣和土壤中[2-7]。何明靖等[7]通過對鹵系阻燃劑在東江魚體中的生物富集研究發現DBDPE在東江魚體內的富集能力較強，余樂洹等[8]在我國北京地區的紅隼體內發現DBDPE的存在，任子賀等[9]在對水生和陸生生物體中鹵系阻燃劑的差異性富集研究中，發現DBDPE在鯰魚和家鴿中存在，綜合以上以及其他的調查研究可知，DBDPE已經廣泛存在于生物體內。另外，有研究表明DBDPE已進入食物鏈中[10-11]。Wang等[12]在對中國北京室內塵埃中溴系阻燃劑研究中發現，DBDPE已經成為主要的溴系阻燃劑，并且DBDPE的中值水平不僅比其他新型溴系阻燃劑高出幾個數量級，而且比3種傳統溴系阻燃劑高出3～27倍。另外，還有研究表明人會通過呼吸、飲食等方式攝入DBDPE[13]。目前，DBDPE使用量逐年增長，在環境和生物體內的蓄積程度呈上升趨勢，而且帶來的健康風險性較高，因此部分學者對其展開了毒理學和流行病學研究。

Jin等[14]使用斑馬魚作為體內模型評價了DBDPE的毒理學效應，結果顯示，在短期暴露于不同濃度DBDPE污染的沉積物時，斑馬魚的死亡率和畸形率均未受影響，但是DBDPE對斑馬魚幼魚具有低神經毒性，該研究結果揭示了DBDPE在實際環境中的潛在風險。韓倩等[15]通過DBDPE對草魚幼魚肝臟和肌肉組織氧化應激效應的影響研究發現，DBDPE暴露影響草魚幼魚肝臟組織的抗氧化防御系統，可以誘導草魚幼魚產生氧化應激效應。Sun等[16]對BALB/c小鼠進行不同劑量的DBDPE灌胃給藥，30 d后，處死小鼠，取血、肝臟和甲狀腺，分離肝微粒體，測定血糖、胰島素和甲狀腺激素水平，結果表明，DBDPE除了可引起一定程度的肝臟損傷和肝功能不全外，還具有內分泌干擾活性，而且DBDPE的內分泌干擾活性會影響血糖代謝水平，但目前其作用機制尚未得出。為了探究其具體機制，縮短研究時間，降低研究成本，本文采用計算機輔助研究的方法對DBDPE影響血糖的代謝機制進行探究，為后續的實驗研究提供理論依據。

當前已進行的體內外研究和流行病學研究結果顯示，內分泌干擾物(EDCs)可通過干擾生物體內分泌過程來影響機體的生理過程，其發揮干擾作用時，一是直接作用于機體內受體，干擾機體對外源性化學物質的代謝，進而引起機體本身的代謝紊亂；二是直接作用于機體特異性代謝受體，形成同型二聚體或異二聚體，進而與特定的靶基因結合，干擾下游基因的表達，進而干擾胰島素等激素水平，從而影響機體的正常代謝[17]。機體的內分泌通路中與血糖相關的有芳香烴受體介導、雌激素、孕激素、甲狀腺激素和雄激素等內分泌通路[18-21]，因此，本文采用上述通路所提及的與血糖相關的受體進行研究，以探究出DBDPE是否與這些受體結合而發揮干擾內分泌作用而影響機體正常代謝，進而影響機體血糖代謝。具體過程是將DBDPE與雌激素受體(estrogen receptors, ERs)包括ERα和ERβ、孕激素受體(progesterone receptor, PR)、甲狀腺激素受體(thyroid hormone receptor, TR)包括TRα和TRβ、雄激素受體(androgen receptor, AR)、芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor, AhR)進行分子對接實驗(圖1)。另外，基于DBDPE類似物(均為EDCs)分子的三維結構以及Richards[22]和Chen等[24]提供的這些分子的EC50(根據實驗要求將該活性數值轉換為-logEC50)，采用比較分子力場分析法(CoMFA)構建3D-QSAR模型，CoMFA是構建3D-QSAR模型的主要方法之一，由于其預測能力強，模型形象直觀而受到廣泛應用[23,25]。在進行實驗時，首先綜合考慮CHARMM力場和靜電場等對這些分子進行場疊合，再對能量網格電位進行濾波，去除高度相關的描述符，之后使用剩余的描述符來建立偏最小二乘(PLS)模型，即3D-QSAR模型，以此預測未知內分泌干擾物的干擾活性，這為實驗研究提供了理論依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

DBDPE及其類似物的結構數據來源于PubChem數據庫，分子對接實驗所需的全部受體結構來源于PDB蛋白質晶體結構數據庫，DBDPE類似物的活性數據來源于Richards[22]和Chen等[24]等的研究。所有分子對接計算以及構建3D-QSAR模型均在寶德RR2510N計算機工作站完成，所用軟件采用美國Accelrys公司研發的Discovery Studio(DS)3.5分子設計軟件包，計算中選用的各項參數除特別說明外均使用缺省值。

圖1 實驗所需受體結構與十溴二苯乙烷(DBDPE)結構注：Erα為雌激素受體α，來源于文獻[26]；Erβ為雌激素受體β，來源于文獻[27]；PR為孕激素受體，來源于文獻[28]；TRα為甲狀腺激素受體α，來源于文獻[29]；TRβ為甲狀腺激素受體β，來源于文獻[30]；AhR為芳香烴受體，來源于文獻[31]；AR為雄激素受體，來源于文獻[32]。Fig. 1 Receptor structure and decabromodiphenyl ethane (DBDPE) structure in receptor-ligand interactionsNote: ERα is estrogen receptor α and refers to literature [26]; ERβ is estrogen receptor β and refers to literature [27]; PR is progesterone receptor and refers to literature [28]; TRα is thyroid hormone receptor α and refers to literature [29]; TRβ is thyroid hormone receptor β and refers to literature [30]; AhR is aryl hydrocarbon receptor and refers to literature [31]; AR is androgen receptor and refers to literature [32].

1.2 實驗方法

1.2.1 分子對接實驗

本部分以ERα為例，用DS3.5軟件首先進行DBDPE與ERα的預處理，具體過程是：利用Small Molecules模塊中Prepare or Filter Ligands功能對DBDPE進行結構優化并將其定義為配體分子；點擊Chemistry進行ERα的加氫處理，在蛋白質的結構面板內刪掉水分子，利用Define and Edit Binding Site功能定義ERα為受體分子，并找到結合位點(12個)。

然后進行分子對接實驗，具體過程是：

(1)用DS3.5軟件中Receptor-Ligand Interactions模塊的Lib Dock功能進行剛性對接實驗，在調整參數時，除Max Hits to Save參數設為10(以縮短計算時間)，其余均為默認值，對接結果顯示，ERα的12個結合位點中有5個能夠與DBDPE完成剛性對接；

(2)用Receptor-Ligand Interactions模塊中的Ligand Fit功能在剛性對接得到的5個結合位點的基礎上進行半柔性對接實驗，在調整參數時，輸入的結合位點更改成能夠完成第一步對接的5個結合位點，結果只有2個結合位點能夠完成半柔性對接；

(3)用Receptor-Ligand Interactions模塊中的Flexible Docking功能在半柔性對接得到的2個結合位點的基礎上進行全柔性對接實驗，根據實驗結果的打分函數來評估ERα與DBDPE的結合情況。

1.2.2 構建3D-QSAR模型

軟件中導入DBDPE的類似物，輸入半最大效應濃度的負對數值(-logEC50)，進行預處理，再將其分為訓練集(如表1)和測試集，利用Small Molecules模塊中的Create 3D QSAR Model功能構建DBDPE類似物的3D-QSAR模型。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 分子對接結果

在剛性對接的過程中，DBDPE能夠在ERα的5個結合位點、ERβ的6個結合位點、PR的4個結合位點、TRα的2個結合位點、TRβ的1個結合位點、AR的2個結合位點以及AhR的2個結合位點處與相應受體結合。在半柔性對接的過程中，DBDPE能夠在ERα的2個結合位點，ERβ的2個結合位點，PR的3個結合位點，TRα的1個結合位點處與相應受體結合(表2)。

表1 訓練集的分子結構和活性數據Table 1 The structure and activity data of training set molecules

續表1名稱Name-logEC50結構Structure2,2’,4,4’-四氯聯苯2,2’,4,4’-Tetrachlorobiphenyl4.092,3,7,8-四氯二苯并呋喃2,3,7,8-Tetrachlorodibenzofuran8.122,3,4,5-四氯聯苯2,3,4,5-Tetrachlorobiphenyl4.853,3’,4,4’-四氯聯苯3,3’,4,4’-Tetrachlorobiphenyl7.372,3,6,8-四氯二苯并呋喃2,3,6,8-Tetrachlorodibenzofuran7.662,3,3’,4,4’-五氯聯苯2,3,3’,4,4’-Pentachlorobiphenyl5.852,2’,4,4’,5,5’-六氯聯苯2,2’,4,4’,5,5’-Hexachlorobiphenyl5.102,3,3’,4,4’,5-六氯聯苯2,3,3’,4,4’,5-Hexachlorobiphenyl6.301,2,4-三氯二苯并-對-二惡英1,2,4-Trichlorodibenzo-p-dioxin5.881,2,4,6,7,8-六氯二苯并呋喃1,2,4,6,7,8-Hexachlorodibenzofuran6.08

注：活性數據來源于文獻[22-25]；-logEC50為半最大效應濃度的負對數值。

Note: The active data are derived from the literature [22-25]; -logEC50is the negative value of the half maximum effect concentration.

表2 DBDPE與內分泌干擾物受體的剛性對接和半柔性對接結果Table 2 Lib Dock and Ligand Fit results between DBDPE and endocrine disruptor receptors

在全柔性對接實驗中，利用了多種打分函數來評估配體與受體的全柔性分子對接結果，主要參考值是配體與受體之間的相互作用能(CDOCKER interaction energy, CIE)。CIE越低表示配體與受體結合越強，對接結果越好，CIE越高則相反。DBDPE與4種受體的全柔性對接結果列于表中(表3～6)，配體與受體全柔性分子對接的相互作用如圖2～5所示(注：每種受體只列出一個對接結果最好的結合位點)。

從表3可知，CIE最高為-26.22 kJ·mol-1，最低為-43.65 kJ·mol-1，說明對接過程所需的相互作用能非常小，對接結果是合理可靠的。

選取CIE最低的構象1(結合比較穩定)，二者的相互作用二維圖如圖2所示，其中DBDPE與ERα側鏈上的520號賴氨酸、381號絲氨酸與515號精氨酸存在氫鍵相互作用(藍色箭頭表示DBDPE與側鏈上氨基酸存在氫鍵相互作用)，與520號賴氨酸存在π-陽離子相互作用(由橙色線表示)。氫鍵相互作用以及π相互作用的存在對配體與受體結合的穩定情況具有重要作用。

從表4可知，CIE最高為-32.58 kJ·mol-1，最低為-42.59 kJ·mol-1，說明對接過程所需的相互作用能非常小，對接結果是合理可靠的。

選取CIE最低的構象4(結合比較穩定)，二者的相互作用二維圖如圖3所示，其中DBDPE與ERβ側鏈上的329號精氨酸和383號蘇氨酸存在氫鍵相互作用，與464號組氨酸存在π-π相互作用，與386號精氨酸存在π-陽離子相互作用。氫鍵相互作用以及π相互作用的存在對配體與受體結合的穩定情況具有重要作用。

從表5可知，CIE最高為-40.72 kJ·mol-1，最低為-53.77 kJ·mol-1，說明對接過程所需的相互作用能非常小，對接結果是合理可靠的。

選取CIE最低的構象1(結合比較穩定)，二者的相互作用二維圖如圖4所示，其中DBDPE與PR側鏈上的777號酪氨酸、728號絲氨酸和822號賴氨酸存在氫鍵相互作用，氫鍵相互作用的存在對配體與受體結合的穩定情況具有重要作用。

從表6可知，CIE最高為-37.57 kJ·mol-1，最低為-42.78 kJ·mol-1，說明對接過程所需的相互作用能非常小，對接結果是合理可靠的。

選取CIE最低的構象1(結合比較穩定)，二者的相互作用二維圖如圖5所示：其中DBDPE與TRα側鏈的330號絲氨酸存在氫鍵相互作用，氫鍵相互作用的存在對配體與受體結合的穩定情況具有重要作用。

在分子對接實驗中，DBDPE與ERα、ERβ、PR和TRα的對接結果較好，說明DBDPE是通過與這

表3 DBDPE與ERα的全柔性對接結果Table 3 Flexible docking results between DBDPE and ERα

注：CIE表示配體與受體之間的相互作用能。

Note: CIE stands for CDOCKER interaction energy.

表4 DBDPE與ERβ的全柔性對接結果Table 4 Flexible docking results between DBDPE and ERβ

圖2 DBDPE與ERα的相互作用二維圖Fig. 2 X-Y scheme of interaction between DBDPE and ERα

圖3 DBDPE與ERβ的相互作用二維圖Fig. 3 X-Y scheme of interaction between DBDPE and ERβ

表5 DBDPE與PR的全柔性對接結果Table 5 Flexible docking results between DBDPE and PR

表6 DBDPE與TRα的全柔性對接結果Table 6 Flexible docking results between DBDPE and TRα

些受體結合而發揮內分泌干擾活性作用，進而影響血糖代謝水平，另外根據DBDPE與不同激素受體的對接結果可得出DBDPE對生物內分泌干擾在性別方面存在差異。

圖4 DBDPE與PR的相互作用二維圖Fig. 4 X-Y scheme of interaction between DBDPE and PR

圖5 DBDPE與TRα的相互作用二維圖Fig. 5 X-Y scheme of interaction between DBDPE and TRα

2.2 3D-QSAR模型

建立的模型通過訓練集的實驗值與預測值的回歸曲線(圖6)來表示，在此曲線中，橫坐標是實驗值，縱坐標是預測值，R-square值為0.989，R-square是可決系數，反映模型對樣本數據的擬合程度，范圍是0

通過測試集的測試(表7)，我們可以看到實驗值與預測值的殘差并不大，這也說明結果較好，于是我們又利用模型得到DBDPE的預測值(-LogEC50)，是5.86，與其他類似物相差較小。通過以上結果，我們得出結論：我們構建的3D-QSAR模型置信度較高。另外，本實驗所找的DBDPE類似物大多數屬于內分泌干擾物，它們通過發揮內分泌干擾活性作用影響血糖代謝水平，由于預測的值與其類似物的值較為接近，所以我們可以得出：與DBDPE類似的其他內分泌干擾物在血糖的內分泌干擾方面具有相近的作用。

圖6 訓練集的實驗值與預測值的回歸曲線Fig. 6 Regression curve of experimental value and predicted value of training molecules

圖7 外部驗證實驗的測試集的回歸曲線Fig. 7 Regression curve of test set for external validation test

綜上所述：通過DS 3.5中的分子對接功能將DBDPE與血糖內分泌代謝過程有關的受體進行對接，并利用DBDPE類似物的三維結構與活性數據構建3D-QSAR模型，最終得出如下結論：

(1)DBDPE能夠與部分血糖內分泌受體(ERα、ERβ、PR和TRα)進行全柔性對接，相互作用能很強，說明對接結果較為穩定，這表示DBDPE是通過與這些受體結合，對后續的內分泌通路產生影響，進而影響血糖代謝水平。

(2)從對接結果發現，DBDPE能夠與雌激素受體和孕激素受體結合，而不能夠與雄激素受體結合，說明DBDPE對生物內分泌的影響在性別方面有一定的差異，這與前述的Sun[16]的實驗研究結果相符。

表7 測試集的實驗值與預測值的關系Table 7 The relationship between experimental value and predicted value of the test set molecules

注：各種化合物的實驗值來源于文獻[22-25]。

Note: The experimental values of various compounds are derived from document [22-25].

(3)通過構建3D-QSAR模型，預測出類似DBDPE未知內分泌干擾物的EC50，認為對生物代謝方面的影響具有一定的相似性。

目前，國內外開展的針對DBDPE的毒理學相關研究和評價資料比較少，且研究結果之間存在一定的差異，本文的計算機輔助研究為DBDPE在內分泌干擾方面的實驗研究提供了理論依據。