低鈣飼料聯合地塞米松致大鼠骨質疏松模型的建立

董瑩瑩 王猛 郭艷 張海軍 蘇鳳艷

吉林農業大學，吉林 長春 130118

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨微結構改變為特征的一種全身性骨骼疾病[1]，該病多發于絕經后婦女及中老年人，全球的總患病率為6.6%～19.3%[2]，其中在中國調查顯示其發病率高達25%[3]。預計到2025年，中國患骨質疏松癥或骨密度低的患者將達到2.12億[4]。研究發現，骨質疏松癥主要由骨代謝紊亂引起，其中骨形成和骨吸收之間的不平衡起主要作用。新骨形成主要由成骨細胞介導，而骨吸收主要取決于破骨細胞的功能。因此，在正常骨重建的過程中，無論是促進成骨細胞增殖或誘導成骨細胞分化均可增強骨形成[5-6]。

地塞米松(dexamethasone,Dex)是一種人工合成的長效糖皮質激素，由地塞米松所引起的骨質疏松被稱為糖皮質激素性骨質疏松(glucocorticoid induced osteoporosis,GIOP)。GIOP屬于繼發性骨質疏松，其發病率僅次于原發性骨質疏松，長期高劑量的注射地塞米松會導致成骨細胞和骨細胞凋亡，因此GIOP引起了人們的關注[7]。本研究以低鈣飼料聯合地塞米松致大鼠骨質疏松的模型為研究對象，以骨密度(bone mineral density,BMD)、骨組織形態學作為主要評價指標，考察造模情況，以期獲得一種耗時短、節約成本且效果更佳的骨質疏松動物模型建模方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：3月齡雌性SD大鼠20只，由遼寧長生生物技術有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(遼)2015-0003，體重(310±10)g。

1.1.2藥品：地塞米松磷酸鈉注射液(國藥準字1137021969，辰欣藥業股份有限公司)，甲醛，生理鹽水，乙醚。

1.1.3飼料：正常飼料(北京科奧協力飼料有限公司)，鈣離子含量為1.22 %；低鈣飼料，配方見表1。

表1 低鈣飼料配方(Ca2+含量0.04%)Table 1 Low calcium feed formula (Ca2+ content 0.04%)

1.1.4儀器：OSTEOCORE-3型錐狀二維快閃式全數字雙能 X 線(DEXA)骨密度儀(法國MEDILINK 公司，中日聯誼醫院骨科提供)，LEICA RM2235切片機(德國，上海聚慕醫療器械)，760CRT雙光束紫外可見分光光度計(中國，北京京科瑞達科技有限公司)，顯微鏡及顯微拍攝系統(德國, Leica)，火焰原子吸收光譜儀(德國,耶拿公司)，馬福爐(中國，上海博訊實業有限公司)。

1.2 方法

1.2.1分組及處理：將SD 大鼠隨機分為空白對照組(正常飼料+生理鹽水)和模型組(低鈣飼料+地塞米松)，每組10只，在無菌條件下進行封閉式飼養。飼養期間允許動物自由采食、飲水，室內相對溫度為19 ℃～23 ℃，相對濕度為(40±10)%。模型組每3天注射一次地塞米松，按照1 mg/kg的給藥劑量對大鼠腿部進行肌肉注射，空白組每3天注射一次等量的生理鹽水，共6周。

1.2.2骨密度的測量：分別于給藥第4周處死4只大鼠、第6周處死6只大鼠，取其股骨組織，通過骨密度儀對其進行骨密度測量。

1.2.3骨灰分及鈣、磷含量的測定：第6周處死大鼠后將其骨組織放入馬福爐高溫加熱6 h，測定灰分含量。取少量燒好的組織加入10 mL高氯酸濃硫酸混合液(1∶5)，之后經高溫消化4 h，將消化好的溶液定容到25 mL容量瓶中備用。通過紫外分光光度進行磷的測定，通過火焰原子吸收分光光度進行鈣含量的測定。

1.2.4血清指標的檢測：取200 μL血清，在血清中加入10 mL高氯酸濃硫酸混合液(1∶5)，之后高溫消化4 h，將消化好的溶液定容到25 mL容量瓶中備用。通過紫外分光光度進行血清中磷濃度的測定，通過火焰原子吸收分光光度進行血清中鈣含量的測定。

1.2.5組織病理學觀察：將大鼠股骨組織用4%多聚甲醛液固定2 d，用5%～10%的濃硝酸溶液將骨組織脫鈣12～24 h，按常規脫水、透明、包埋、石蠟切片，厚 4～5 μm，常規 HE 染色，用顯微鏡在400倍鏡下觀察骨組織形態學變化。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 健康指標

從實驗開始，每日早上8:00對各組大鼠進行稱重，觀察大鼠的各項生命體征，并且每周稱取兩次攝水、攝食量，觀察并記錄大鼠基礎健康指標的變化情況。空白組大鼠毛發光潔，活動體態正常，模型組大鼠毛色無光澤、稀疏、四肢爪部常有斷裂。大鼠體重實驗結果顯示(圖1)，整個飼養期間模型組的體重在前3周處于下降的趨勢，之后趨于平穩。由于注射地塞米松的原因，導致模型組體內營養成分流失加速，致使體重下降，空白組的體重一直保持著持續上升的狀態；大鼠攝水實驗結果顯示(圖2)，模型組的攝水量從第2周開始下降，從第3周之后趨于平穩，由于模型組注射地塞米松的原因使大鼠的飲水量增加，因此模型組的攝水量顯著高于空白組。

2.2 骨指標

2.2.1骨密度：第4周大鼠骨密度實驗結果顯示(圖3)，模型組大鼠股骨上段和下段與空白組相比，差異無統計學意義，只有空白組股骨中段的骨密度高于模型組，且差異顯著(P<0.05)，不能證明造模成功；第6周大鼠骨密度實驗結果顯示(圖4)，模型組大鼠股骨上段、中段、下段的骨密度均顯著低于空白組(P<0.01)，從骨密度的結果可以初步確定造模成功。

圖3 地塞米松+低鈣飼料對大鼠4周骨密度的影響Fig.3 Effect of dexamethasone + low calcium diet on bone mineral density of rats at four weeks注：與空白組比較, #P< 0.05。

圖4 地塞米松+低鈣飼料對6周大鼠骨密度的影響Fig.4 Effect of dexamethasone + low calcium diet on bone mineral density of rats at six weeks注：與空白組比較, *P< 0.01。

2.2.2骨組織干重和灰重比：第6周大鼠骨組織灰分及灰重/干重實驗結果顯示(表2)，模型組的灰分顯著低于空白組(P<0.01)，且模型組灰重/干重極顯著低于空白組(P<0.01)。

表2 兩組大鼠骨組織灰重、干重Table 2 Bone tissue gray weight / dry weight of two groups rats

注：與空白組比較,*P< 0.01。

2.2.3骨組織中鈣、磷的含量：第6周時骨組織鈣、磷含量實驗結果顯示(圖5)，模型組鈣的含量顯著低于空白組(P<0.01)，模型組磷的含量顯著低于空白組(P<0.01)。

圖5 地塞米松+低鈣飼料對大鼠骨鈣磷的影響Fig.5 Effects of dexamethasone + low calcium feed on bone calcium and phosphorus in rats注：與空白組比較，*P<0.01。

2.3 血清指標

由圖6和圖7可見，造模6周時，模型組血清鈣濃度顯著高于空白組(P<0.01)；模型組血清磷濃度顯著低于空白組(P<0.01)。

圖6 地塞米松+低鈣飼料對大鼠血鈣的影響Fig.6 Effect of dexamethasone + low calcium diet on serum calcium in rats注：與空白組比較, *P<0.01。

圖7 地塞米松+低鈣飼料對大鼠血磷的影響Fig.7 Effect of dexamethasone + low calcium diet on blood phosphorus in rats注：與空白組比較, *P<0.01。

2.4 H&E染色

從大鼠的骨組織形態學可看出(圖8)，空白組的骨小梁完整;模型組的骨小梁多已斷裂，無完整的骨小梁，出現大量的脂肪細胞。

圖8 各組光鏡下觀察(×400，橢圓處為骨小梁，箭頭處為脂肪細胞)Fig.8 Each group under light microscope observation (×400), blank group diagram arrow indicates intact trabecular bone, model group diagram arrow indicates fat cell

3 討論

近年來我國骨質疏松癥的發病率迅速上升，已經成為社會關注的焦點。骨質疏松被人們稱為“無聲殺手”，因為它是在人們未察覺的情況下產生的，且這一疾病沒有根治的方法，只能通過長期服用藥物來延緩病情的發展。美國骨質疏松治療費用每年已經達到上百億美元，并且由于其高昂的防治費用及患者對家庭成員的依賴，給社會造成了沉重的負擔。骨質疏松是當今社會中老年人及婦女的多發病，目前全球發病的人數已經達到2億人[8]。骨質疏松主要分為原發性骨質疏松、繼發性骨質疏松、特發性骨質疏松，原發性骨質疏松主要是由于人們增長到一定年齡而自然產生的，繼發性骨質疏松則是由于一些外力影響所產生的，如藥物、長期臥床等[9]，特發性骨質疏松的原因尚不明確。

目前建造骨質疏松的動物實驗中多選用3月齡大鼠，常用的方法主要是去勢、維甲酸誘導法和糖皮質激素誘導法，還有采用長期飼喂低鈣飼料來誘導骨質疏松模型。但這些方法均存在缺點，大鼠去勢的方法操作困難，對環境手法等要求較高；維甲酸給藥劑量為80 mg/kg，造模時間為21 d[10]，維甲酸雖然造模時間短但價格昂貴；傳統的糖皮質激素建模大概需要60 d[11]，造模時間較長；單純的低鈣飼料造模時間需20周[12]，造模時間更長。因此本研究從節省成本、節約時間等多方面考慮采用低鈣飼料聯合地塞米松進行造模。劉和娣等[13]亦采用地帶米松+低鈣飼料法造模，但時間較長。本研究采用地塞米松+低鈣飼料(鈣含量0.004%)，造模時間縮短兩周，且操作簡單、價格低廉。

Dex廣泛用于自身免疫性疾病和炎癥治療[14]，長期使用Dex會增加骨質疏松癥甚至股骨頭壞死的風險[15]，Dex能增加脂肪細胞的生成，減少成骨細胞[16]；低鈣飼料的食用可致使動物體內的鈣含量降低，最終形成骨質疏松。Dex是一種人工合成的長效糖皮質激素，通過直接抑制骨細胞、成骨細胞活性和增加破骨細胞骨吸收兩個階段影響骨代謝，導致骨質疏松[17]。

本研究通過評估骨密度來判定是否造模成功，通過骨組織灰重和干重比、骨鈣離子和磷離子的含量、血清Ca、P濃度和骨組織形態學等指標來進一步確定大鼠的造模情況。

骨密度全稱骨骼礦物質密度，是評價骨骼強度及骨質量的一個重要指標，可以反映骨質疏松程度，是預測骨折危險性的重要依據，也是判定骨質疏松的關鍵因素[18]。結果發現，第4周模型組股骨上、中、下段骨密度與空白組相比，差異無統計學意義(P≥0.05)，說明造模未成功；第6周模型組大鼠股骨上、中、下段骨密度與空白組相比，差異有統計學意義(P≤0.05)，說明造模成功。

骨灰重/干重是反映骨礦含量的重要指標，比值越低，骨無機質的含量越低；此次研究結果顯示，模型組的灰重/干重顯著低于空白組(P≤0.05)，說明長期塞米松+低鈣飼料能降低骨中無機物質的含量，使骨代謝水平發生了改變；鈣磷代謝是影響骨代謝的重要指標，當骨中鈣含量不足時則會使血液中的鈣轉化為骨鈣磷來維持骨中的鈣磷[19-20]；血液中的鈣磷離子還保持著一定的數量關系，當其數量不在規定的范圍內則會引發骨骼疾病。本次研究結果發現第6周的血清指標中，模型組Ca的含量顯著高于空白組(P≤0.05)，模型組P的含量顯著低于空白組(P≤0.05)，說明骨吸收增加；模型組骨組織中Ca、P的含量均顯著低于空白組，說明長期的地塞米松+低鈣飼料能增強破骨細胞的形成，且能抑制成骨細胞的增殖、分化，降低成骨細胞活性，并使成骨細胞凋亡；從生化指標和骨鈣磷含量可以明顯看出模型組的骨吸收大于骨形成，說明地塞米松+低鈣飼料造模效果顯著。人骨髓間質干細胞是具有多向分化能力的細胞,在成人體內主要分化為成骨和脂肪細胞，伴隨著脂肪組織在骨髓中的含量增加,成骨細胞在骨髓中的含量會明顯減少[21]。從大鼠脛骨組織形態學可見，模型組骨小梁多已斷裂，幾乎無完整的骨小梁，且出現大量的脂肪細胞,說明體內成骨細胞減少，表明地塞米松+低鈣飼料已使骨組織顯微結構發生了改變，呈現出骨質疏松的狀態。

綜上所述，利用低鈣飼料聯合地塞米松肌肉注射方法建立大鼠骨質疏松模型切實可行，低鈣飼料聯合地塞米松的使用可以進一步加速骨丟失。此法操作簡單、周期短、費用低廉且建模效果好，是一種較好的建立骨質疏松實驗動物模型的方法。