鹽分脅迫對烤煙葉片亞細胞結構及生理生化指標的影響

馬靜，王靜，姚鵬偉，葉紅潮，余海濤，王鵬，李玉寶，葉協鋒*

1 河南農業大學煙草學院，國家煙草栽培生理生化研究基地，煙草行業煙草栽培重點實驗室，鄭州 450002；2 洛陽市煙草公司，洛陽 471000；3 湖南中煙工業有限責任公司，長沙 410000；4 湖北中煙工業有限責任公司，武漢 430000

我國鹽漬化土壤面積約3600萬hm2，占全國可利用土地面積的4.88%[1]，主要分布在東北、西北和華北地區。近年來，由于農藥的濫用及灌溉、施肥方式的不合理，造成土壤鹽漬化越來越普遍，嚴重影響了農作物的生長發育[2]。研究表明植物葉片細胞的內部結構與其耐鹽性密切相關[3-4]，尤其是葉肉細胞中葉綠體、細胞核、線粒體等細胞器的形態結構對外界環境變化較敏感。目前，相關研究主要集中在小麥、水稻等以采收籽粒為主的作物上[5]，對烤煙等以采收葉片為主的作物研究較少。

植物在長期的進化過程中，獲得了通過提高活性氧清除酶的活性來應對逆境的機制，從而保證作物的正常生長發育[6]。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）和過氧化氫酶（Catalase，CAT）是生物膜保護酶系統的重要成員。在逆境條件下，它們協同作用，從而減輕活性氧自由基對膜系統的傷害，抑制膜脂的過氧化[7-8]。其中，SOD能催化體內的歧化反應，將超氧自由基轉化為O2和H2O2，而CAT和POD則負責清除SOD分解產生的H2O2，使其分解成沒有毒害的H2O和O2[9]。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是自由基作用于脂膜發生氧化反應的產物[10]，在一定程度上能反應植物細胞膜結構受氧化的破壞程度[11]。Apel[12]等的研究表明，當植株受到鹽脅迫后，會誘導植株體內活性氧增多，造成細胞膜脂過氧化，從而影響植物正常生長。朱玉鵬[13]等研究發現，在一定鹽分濃度范圍內，冬小麥的SOD、POD活性增強，MDA含量會隨鹽濃度的增加而增加。隨著鹽濃度的升高，木薯幼苗[14]中的SOD、POD的活性先增強后減弱，CAT活性先下降后上升。

目前，植物鹽脅迫研究中大都采用NaCl或Na2SO4[15-16]，而對多種鹽混合脅迫或者不同鹽分脅迫對比研究未見報道。有研究表明，植物吸收過多的SO42-會引起植物缺鈣，使植物葉片發黃、從葉柄處脫落；吸收過多的Cl-會使植株生長停滯、葉片黃化，葉緣似燒傷狀[17]。對于烤煙來說，吸收過多硫，會使煙葉燃燒性下降，在燃燒過程中會出現惡臭味；過多的Cl-會使葉片淀粉含量增多，葉片肥厚而脆，葉面光滑，顏色不均勻[18]。本研究選取NaCl和Na2SO4兩種鹽來模擬鹽脅迫環境，比較烤煙在不同濃度的兩種鹽處理條件下，葉片抗氧化酶活性的變化以及葉綠體、線粒體和細胞核等葉肉細胞超微結構的變化特點，從解剖學角度探究兩種鹽對烤煙葉肉細胞超微結構影響的差異，并結合抗氧化酶等生理指標，探討烤煙葉肉細胞對NaCl和Na2SO4的不同反饋機制以及烤煙鹽脅迫傷害的生理響應規律，以期為烤煙的耐鹽機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2018年8月在河南農業大學實驗室內進行，供試品種為中煙100。首先用Hoagland營養液在蛭石中培育煙苗，待長至四葉一心時（苗齡為40 d），選取無病蟲害且長勢一致的健壯煙苗，分別添加100 mmol/L、200 mmol/L、400 mmol/LNaCl的 Hoagland溶液和50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/LNa2SO4的Hoagland溶液作為處理[5,19-20]，對照組為正常Hoagland營養液，每組5株，3次重復。

1.2 測定項目與方法

電鏡制樣及觀察測量：在處理3 d后，從下往上數第3片葉作為電鏡觀察材料。在葉片中部，避開主脈附近切下2 mm×2 mm左右的葉片，在0.1 mmol/L磷酸緩沖液（pH7.2）配制的2.5%戊二醛溶液中在0～4℃下固定24 h以上，之后用磷酸緩沖液清洗3次，各30 min；再用1%的鋨酸固定2 h，然后用磷酸緩沖液清洗并用梯度酒精（30%、50%、70%、90%各15 min，100%酒精2次各30 min）脫水，再用100%丙酮置換，之后用環氧樹脂812包埋（樹脂組織處理器 LEICA EM TP），用超薄切片機（LEICA EM UC7）切片后用飽和醋酸雙氧鈾水溶液染色，再用檸檬酸鉛溶液染色后用透射電子顯微鏡（JEM-1400，日本）觀察拍照。

在處理3 d后，從下往 取第3片葉中稱取0.1 g樣品加入1 mL 150 mmol/L，pH7.0的磷酸緩沖液，冰浴上研磨，8000 g、4℃離心10 min，上清液部分為酶粗提取液，用于 MDA、SOD、POD和CAT的測定。MDA、SOD、POD和CAT的測定均按照MDA、SOD、POD和CAT試劑盒（蘇州科銘，蘇州，中國）中說明書的方法操作。

2 結果與分析

2.1 NaCl和Na2SO4對烤煙葉肉細胞葉綠體超微結構的影響

正常的烤煙葉肉細胞中的葉綠體都緊貼細胞壁，長軸與細胞壁平行，呈梭型或橢圓形，且各細胞器結構清晰可見（圖1A）。用100 mmol/LNaCl處理后如圖1B所示：葉綠體排列有序，緊貼細胞壁，仍具有完整的結構，但淀粉粒較CK有所減少。中等濃度（200 mmol/L）NaCl處理后，葉綠體與細胞壁之間出現間隙，且葉綠體中的嗜鋨顆粒含量有所增多，同時基粒片層結構模糊，并出現斷裂現象。葉綠體背膜部分邊緣模糊（圖1C）。當NaCl濃度達到400 mmol/L時，葉綠體縮小，結構松散，背膜解體，失去完整性，與細胞質間不再有明顯的界限。葉綠體中的質體小球進一步增多，基粒片層松散、變形，部分基粒解體消失（圖1D）。

在50 mmol/LNa2SO4處理后，烤煙葉綠體結構仍呈梭型，形態飽滿，基粒片層排列整齊、有序，類囊體片層垛疊整齊，膜系統結構完整，且脂質球的數目和大小沒有明顯的變化，但與100 mmol/LNaCl處理相比，葉綠體中的淀粉粒含量較多（圖1E）。當Na2SO4處理濃度增高到100 mmol/L時，有部分葉綠體懸浮于細胞質中，但大部分仍緊貼細胞壁。此時葉綠體結構變長，并有斷裂現象，類囊體結構解體，與對照相比出現了更多的嗜鋨顆粒。基粒片層松散、變形，有斷裂的現象，垛疊之間出現明顯空隙，密度降低，膜邊緣模糊，同時葉綠體中的淀粉粒數量減少（圖1F）。當Na2SO4濃度達到200 mmol/L時，葉綠體由梭形進一步腫脹變為球形，失去自身的完整結構，內部的類囊體消失，破損的葉綠體充斥在細胞質中；嗜鋨顆粒明顯增多，葉綠體中鮮見淀粉粒（圖1G）。

圖1 NaCl和Na2SO4對烤煙葉肉細胞葉綠體結構的影響Fig.1 Influence of NaCl and Na2SO4 on the chloroplast structure of mesophyllcells of tobacco leaves

2.2 NaCl和Na2SO4對烤煙葉肉細胞線粒體結構的影響

由圖2A可知，未添加鹽溶液的烤煙葉肉細胞中，線粒體結構飽滿，基質豐富，雙層膜結構完整，可觀察到內膜凹陷形成的嵴。當100 mmol/LNaCl處理3天后，線粒體結構與對照無明顯差別（圖2B）。當NaCl濃度為200 mmol/L時，外膜結構完整，部分線粒體呈扁球形，但與對照相比嵴的數量減少，內膜系統可觀察到較多的嗜鋨顆粒，線粒體內部出現空泡（圖2C）。當NaCl濃度為400 mmol/L時，線粒體大部分內膜結構已經破壞，無結構清晰的嵴，內部絕大部分為空泡，出現少數外膜破裂的現象（圖2D）。

圖2 NaCl和Na2SO4對烤煙葉肉細胞線粒體結構的影響Fig.2 Influence of NaCl and Na2SO4 on mitochondrial structure of mesophyllcells of tobacco leaves

50 mmol/L Na2SO4和100 mmol/L Na2SO4處理后，與對照無明顯差別，線粒體結構完整且形態飽滿，可明顯觀察到內膜凹陷（圖2E、F）。當Na2SO4濃度達到200 mmol/L時，線粒體基質密度明顯降低，內膜幾乎完全溶解，且大部分線粒體結構瓦解（圖2G）。

圖3 NaCl和Na2SO4對烤煙葉肉細胞細胞核結構的影響Fig.3 Influence of NaCl and Na2SO4 on the nuclear structure of mesophyll cells of tobacco leaves

2.3 NaCl和Na2SO4對烤煙葉肉細胞細胞核結構的影響

對照組烤煙葉肉細胞的細胞核膜結構完整，雙層膜結構清晰可見，核仁呈圓形，結構完整，核中染色質分布均勻（圖3A）。在用100 mmol/LNaCl處理后，細胞核雙層膜結構清晰，核仁結構完整，但核仁邊緣略有模糊，核中染色質均勻分布（圖3B）。200 mmol/LNaCl處理后，細胞核雖能觀察到核膜雙層結構，但略有凹凸，核仁密度變小，且膜結構損壞，核中染色質分布不均（圖3C）。NaCl濃度升高至400 mmol/L時，核膜解體，核中的染色質高度凝縮，細胞核邊緣模糊不清，部分細胞核核膜解體，核質外溢，核仁消失（圖3D）。

50 mmol/L Na2SO4處理的葉片組織與對照相比細胞核結構無明顯變化（圖3E）。100 mmol/L Na2SO4處理下細胞核核膜結構完整，平滑，染色質分布均勻，但核仁邊緣略有模糊（圖3F）。200 mmol/L Na2SO4處理下大部分細胞核萎縮、破裂解體（圖3G）。

2.4 NaCl和Na2SO4對烤煙葉肉細胞細胞壁的影響

對不同濃度鹽分脅迫下烤煙葉肉細胞細胞壁的透射電鏡照片觀察發現，對照的細胞壁表面光滑，結構完整，與細胞膜緊密貼合。在低濃度NaCl和Na2SO4條件下，葉肉細胞細胞壁厚度減小（圖4）。200 mmol/LNaCl處理條件下，烤煙葉肉細胞細胞壁膨脹，細胞膜間隙增大。隨著NaCl濃度的升高，細胞壁表面凹凸不平，且邊緣模糊，細胞厚度有所減小。在100 mmol/LNa2SO4處理條件下，細胞壁厚度與對照相比無明顯變化。200 mmol/L Na2SO4處理條件下，細胞壁厚度降低。

圖4 NaCl和Na2SO4對烤煙葉肉細胞細胞壁的影響Fig.4 Influence of NaCl and Na2SO4 on the cell wall of mesophyll cells of tobacco leaves

2.5 NaCl和Na2SO4對烤煙葉片含水率的影響

從圖5可以看出，對照組的葉片含水率為95.00%，不同濃度NaCl處理后的含水率分別為94.13%、91.86%和83.47%；Na2SO4處理的含水率分別為94.65%、91.80%和89.58%。其中，低濃度NaCl和Na2SO4對烤煙葉片含水率影響不大，隨鹽分濃度升高，烤煙葉片含水率逐漸下降，在Na+濃度一致條件下，高濃度（400 mmol/L）NaCl處理下烤煙葉片含水率與對照相比差異最顯著。低濃度NaCl和Na2SO4處理對烤煙葉片含水率影響不大，但隨著鹽分濃度的升高，烤煙葉片含水率逐漸下降。

圖5 NaCl和Na2SO4對烤煙葉片含水率的影響Fig.5 Influence of NaCl and Na2SO4 on moisture content of tobacco leaves

2.6 NaCl和Na2SO4對烤煙葉片抗氧化系統的影響

從圖6可以看出，添加NaCl和Na2SO4溶液的煙草葉片中MDA含量、SOD、POD和CAT酶活變化趨勢相同。MDA含量、SOD和POD活性隨著鹽濃度的升高均呈現出先增加后減少的趨勢，而CAT活性是逐漸增強，且NaCl溶液處理的葉片比Na2SO4處理的MDA含量、SOD、POD和CAT活性的變化幅度更大，與對照相比差異更顯著。表明在Na+濃度相同條件下，NaCl對烤煙葉片氧化平衡影響較大，同時對細胞膜破壞程度也大。

3 討論

當植物受到鹽脅迫時，葉片組織中各細胞器容易遭到破壞，而葉綠體是對鹽分最敏感的細胞器[21-24]。在本研究中，正常培養的煙草葉片葉綠體結構完整，淀粉粒分布均勻，基粒片層清晰。在NaCl處理條件下，隨著NaCl濃度升高，葉綠體由飽滿的橢圓形逐漸變長，膜結構解體。Na2SO4處理條件下，隨著鹽濃度增加，葉綠體結構會逐漸膨脹，變成圓形，相比NaCl處理，Na2SO4對葉綠體膜結構的影響較小，且低濃度Na2SO4對葉綠體中的淀粉粒幾乎沒有影響。然而有研究指出，在野大麥[20]葉肉細胞中，隨NaCl濃度升高，葉綠體中的淀粉粒含量增多，這與本試驗研究結果相反，這可能是由于烤煙葉片和野大麥葉片的結構差異較大，對鹽分的響應不同。

線粒體是細胞能量的供給者，曾經被認為是對脅迫不敏感的細胞器[25-26]。但在本研究中，隨NaCl和Na2SO4濃度的升高，線粒體的結構都發生明顯變化，在NaCl處理條件下，線粒體內部間隙逐漸增大，膜結構破壞嚴重。在Na2SO4處理條件下，線粒體內嵴減少，膜結構也相對完整。對于烤煙葉肉細胞細胞核來說，NaCl處理會造成細胞核內核質分布不均勻，當NaCl濃度達到400 mmol/L時，細胞核的雙層膜結構遭到破壞，但當Na2SO4與NaCl處理中Na+濃度一致時，即達到200 mmol/L時，葉片中細胞核雙層膜結構依然完整。由此可以推測，隨NaCl濃度升高，可能會抑制烤煙葉片伸展，導致葉色發黃，且在Na+濃度一致的條件下，NaCl與Na2SO4相比抑制作用更明顯。

研究表明，鹽脅迫會引起植物細胞中活性氧自由基的產生及其清除系統的破壞，而細胞質膜破壞會積累較多的MDA，MDA的積累量也在一定程度上反映了耐鹽能力的強弱[27]。SOD、POD和CAT是植物應對逆境的重要的抗氧化酶，它們主要通過清除超氧陰離子自由基、過氧化氫和羥自由基來降低活性氧對細胞膜的傷害和減輕膜質過氧化[28-30]。本試驗中，在低濃度和中等濃度NaCl和Na2SO4條件下，SOD、POD、CAT活性增強，MDA積累量增多，這可能是由于在鹽的作用下，烤煙葉片中活性氧自由基、過氧化氫等積累量升高，促使烤煙產生相應的生理反應，使抗氧化酶活性增強。隨著NaCl和Na2SO4濃度進一步升高，SOD、POD活性降低，說明此時活性氧的積累量超出抗氧化酶可清除的范圍，葉片細胞受損嚴重。當Na+濃度一致時，NaCl處理的烤煙葉片內積累的MDA更多，SOD、POD、CAT活性變化也更顯著，這也從生理水平上反映出在NaCl處理下，烤煙葉肉細胞膜受傷害程度較深，表明與Na2SO4相比NaCl處理會使烤煙葉肉細胞產生更多的活性氧，對細胞質膜結構的破壞更強。

Na+和Cl-是對植物影響較大的鹽分離子，所以在鹽脅迫的研究中，如何避免Na+和Cl-毒害是當前亟需解決的問題[31]。本研究利用不同濃度的Na2SO4和NaCl對烤煙進行脅迫處理，從研究結果可以看出，NaCl對烤煙葉肉細胞的影響比Na2SO4要大，這與大多數的研究一致，均認為NaCl是主要的鹽害類型。楊春武[32]等人認為，陽離子對植物適應鹽漬環境具有重要意義，但陰離子也是維持細胞環境和細胞代謝過程的必要條件，所以不同的陰、陽離子類型對植物的作用機制不同，在本試驗中，雖然陽離子相同，且濃度一致，但由于陰離子的不同，對烤煙產生的脅迫程度有明顯的不同，包括對葉綠體、線粒體、細胞核等結構的影響均有所差異，所以對植物造成的鹽傷害與離子類型的關系，還需要進一步深入研究。

4 結論

當NaCl濃度為100 mmol/L時，葉綠體中的淀粉粒減少； NaCl濃度達到200 mmol/L時，對烤煙葉肉細胞亞細胞結構、葉肉細胞細胞壁厚度及抗氧化酶等產生顯著影響。當Na2SO4濃度為200 mmol/L時，對烤煙葉肉細胞亞細胞結構的影響顯著。在Na+濃度一致的條件下，NaCl對烤煙葉肉細胞的影響明顯高于Na2SO4，主要表現在對葉片細胞膜結構的破壞程度大，且NaCl對烤煙葉片抗氧化酶平衡系統的影響更大。