烤煙上部葉采收時SPAD值與鮮煙組織結構、生理指標及烤后煙葉內在質量的關系

孫光偉，陳振國，王玉軍，孫敬國，馮吉，于濤，李建平，覃光炯

1 湖北省煙草科學研究院，武漢 430030；2 山東農業大學，泰安 271018

烤煙優質上部葉對卷煙香味及其風格具有很大貢獻[1-2]，上部4～6片一次成熟采收技術的推廣提高了上部葉的可用性[3-4]，但烤后上部葉組織結構緊密，煙堿、蛋白質、淀粉含量較高，化學成分不協調，刺激性大，雜氣較重等問題仍影響其在卷煙配方中的使用，而造成這一現象的根本原因是成熟度不夠[5-7]。煙葉成熟的過程實質是葉片生理衰老的過程，成熟度作為煙葉質量的核心，目前主要通過眼看、手摸等感官方法判斷[8]，大量研究表明采收成熟度與葉片組織結構[9-11]、生理生化[12-16]、吸食質量及安全性[17-18]等密切相關，基于葉面顏色、主脈變白情況進行成熟度分類，主觀差異較大，缺乏客觀量化分析。

葉綠素計通過發射易被葉綠素吸收的紅光（峰值波長650 nm）和不被葉綠素吸收的近紅外光（峰值波長940 nm）來計算葉片表征葉綠素相對含量的SPAD值（Soil and Plant Analyzer Development，可譯作土壤與作物分析儀器開發，指一種測量葉綠素濃度的方法，SPAD值即采用該方法測得的葉綠素相對濃度值），實現快速、無損判定葉片葉綠素含量從而客觀反映成熟度[19-21]。本試驗設置上部葉采收不同的SPAD值，量化SPAD值與鮮煙葉組織結構、生理指標及烤后煙葉質量的關系，以期確定上部葉最佳采收成熟度，為提高上部煙葉可用性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018年在恩施州利川柏楊鎮進行，供試品種為云煙87，土壤為砂壤土，有機質2.25%，pH為5.64，速效氮91.00 mg/kg，有效磷67.92 mg/kg，速效鉀192.00 mg/kg。施肥量純氮90 kg/hm2，m(N)∶m (P2O5)∶m (K2O)=1∶1.5∶2.5，行距1.2 m，株距0.55 m。其他技術措施和田間管理按優質煙生產技術規程實施。

1.2 試驗設計

選取上部葉成熟度一致的煙田，中部葉采收結束后, 煙株留取上部六片葉片，上部四片一次成熟采收，頂部兩片棄采。在葉片的葉尖、葉中和葉基3個位置主脈兩側用SPAD-502PLUS儀（KONICA MINOLTA）讀取SPAD值，取四片葉24個點的平均值為上部葉采收的SPAD值，上部葉成熟期進行田間動態監測，按平均值在9±1.5、13±1.5、17±1.5、21±1.5、25±1.5范圍進行上部四片采收分成5類。每類選取30株掛牌采收后按照同一工藝曲線進行烘烤，各階段穩溫時間根據煙葉變化情況靈活掌握。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 生理生化指標

采收時每類隨機選取3株上部葉掛牌設為三次重復，采用美國LI-Cor 公司生產的LI-6400便攜式光合測定系統測定光合參數，人工控制CO2濃度400 μmo1?mol-1，25℃，光照強度 800 μmol?m-2?s-1，于采收當天上午10點測定，測量四片上部葉的凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）、蒸騰速率（Tr）；采后冰盒帶回用蒸餾水洗凈，擦干，在葉中部主脈一側2～3 cm處打孔，打孔取下的葉片用于生理指標測定，轉化酶（invertase，INV）、吲哚乙酸氧化酶（indoleacetic acid oxidase，IAAO）采用上海索橋生物科技有限公司試劑盒測定，硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）、超氧化物歧化 酶（superoxide dismutase，SOD）、 過 氧 化 物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）等酶活性及過氧化氫（H2O2）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。

1.3.2 鮮煙組織結構測定

剩余葉片中部主脈另一側2～3 cm處取下的樣品用FAA（70%酒精）固定液固定保存，按照常規的石蠟切片步驟，進行逐級酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋和切片，采用番紅-固綠染色，對制好的切片利用OLYMPAS顯微影像分析軟件測定葉片厚度、海綿組織厚度、柵欄組織厚度；自由水和束縛水含量、葉綠素含量的測定方法參照《植物生理學試驗指導進行》[22]。

1.3.3 常規化學成分測定

每類烤后葉片隨機選取9株，每3株12片煙葉混合為一次重復，80℃烘干至恒質量，剔除主脈和較粗的支脈，研磨粉碎過250 μm 篩保存。常規化學成分檢測采用美國API公司生產的305D型連續流動分析儀參照行業標準測定；多酚含量參照行業標準[23]測定，TSNAs含量采用液質聯用[24]測定。

感官品質鑒定：每類隨機選取B2F等級20片切絲用于感官品質鑒定，由湖北中煙工業有限責任公司技術研發中心進行感官評價，選取香氣質、香氣量、雜氣、刺激性、余味、燃燒性、灰色、濃度、勁頭等指標，參照YC/T 415—2011煙草在制品感官評價方法[25]制訂評分標準，見表1。

1.4 數據處理

采用Excel進行數據處理及作圖，SPSS19.0 進行多重比較（Duncan法）。

表1 感官評價評分標準Tab.1 Standards of evaluation of smoking sensory quality 分

2 結果與分析

2.1 不同SPAD值上部葉片光合特性

圖1為不同SPAD值上部葉片外觀及葉綠素含量，從中可以看出隨著SPAD值升高葉片葉綠素a、葉綠素b及葉綠素總量呈上升趨勢，葉片綠色程度逐漸加深；葉綠素含量（y1）與SPAD值（x）呈線性相關，y1= 0.0424x+ 0.2477（R2 = 0.9823）。

圖1 不同SPAD值上部葉片外觀及葉綠素含量Fig.1 The leaf appearance and chlorophyll content of upper leaves with different SPAD values

從表2可知，SPAD值在21±1.5時采收，上部葉凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度、蒸騰速率達到最高后開始下降趨于衰老；SPAD值低于9±1.5時采收，凈光合速率顯著降低，氣孔導度和蒸騰速率均較低，表明葉片衰老嚴重，光合作用明顯減弱。凈光合速率（y2）與采收時SPAD值呈一元二次關系，y2= -0.6957x2+ 5.6523x- 1.598（R2 = 0.9717）。

表2 不同SPAD值上部葉片的光和參數Tab.2 Photosynthetic parameter of leaves with different SPAD values

2.2 不同SPAD值上部葉片組織結構

從圖2可以看出，隨著葉片SPAD值的升高，葉片海綿組織呈降低的趨勢，柵欄組織呈上升的趨勢，可見降低采收SPAD值可改善上部葉組織結構的疏松程度；采收時SPAD值與葉片海綿組織柵欄組織的比值（y3）呈負相關，y3= -0.0094x2+ 0.0162x+ 0.8646（R2= 0.9877）。

圖2 不同SPAD值上部煙葉的組織結構Fig.2 The mesophyll structure of upper leaves with different SPAD values

2.3 不同SPAD值上部葉生理指標

2.3.1 鮮煙葉水分含量

圖3 不同SPAD值上部葉鮮煙葉水分含量Fig.3 The moisture content of upper leaves with different SPAD values

植物組織中的水分以兩種不同的狀態存在，一種是與原生質膠體緊密結合的束縛水，另一種是不與原生質膠體緊密結合而可以自由移動的自由水。從圖3中可以看出隨上部葉采收時SPAD值升高，自由水含量變化不大，束縛水含量呈下降趨勢，自由水/束縛水比值（y4）呈升高趨勢，y4= 0.3413x+ 1.6907（R2= 0.9393），上部四片采收時SPAD值低于17時，束縛水含量顯著增加，自由水/束縛水比值顯著降低，代謝減弱趨于成熟。

2.3.2 鮮煙葉碳氮代謝產物及相關酶活性

由表3可知，隨著葉片SPAD值的升高，蛋白質的含量（y5）逐漸升高，y5= 18.209x+ 115.94（R2= 0.8586）；硝酸還原酶（NR）活性逐漸升高，當SPAD值低于13±1.5時NR活性顯著降低；蔗糖含量隨著葉片SPAD值的升高逐漸降低，蔗糖轉化酶活性逐漸升高，α、β淀粉酶、總淀粉酶活性及淀粉含量均隨SPAD值的降低而呈現先升高后降低的趨勢。

表3 不同SPAD值上部煙葉碳氮代謝產物及關鍵酶活性Tab.3 Carbon and nitrogen metabolites and key enzyme activities of upper tobacco leaves with different SPAD values

2.3.3 鮮煙葉氧化脅迫生理指標

從表4中可以看出，隨著葉片SPAD值的降低，IAAO活性逐漸增加，H2O2含量、POD、SOD、CAT活性呈先降低后顯著增加的趨勢；當SPAD值低于13±1.5時POD活性、SOD活性、CAT活性、H2O2含量、MDA含量顯著增加，在9±1.5范圍內IAAO活性顯著增加，H2O2、MDA含量顯著增加，上部葉氧化脅迫加重。

表4 不同SPAD值上部煙葉氧化脅迫生理指標Tab.4 Physiological index of oxidative stress in upper tobacco leaves with different SPAD values

表5 不同SPAD值采收烤后煙葉多酚含量Tab.5 Contents of polyphenols in flue-cured tobacco leaves with different SPAD values mg/g

2.4 不同SPAD值采收對烤后上部煙葉內在品質的影響

2.4.1 對烤后煙葉多酚含量的影響

從表5可以看出隨著采收煙葉SPAD值降低，綠原酸、蕓香苷、多酚總量呈上升趨勢，多酚總量（y6）與SPAD值含量呈線性相關，y6= -1.8172x+ 28.073（R2= 0.9515）。

2.4.2 對烤后煙葉常規化學成分含量的影響

從表6烤后煙葉常規化學成分可以看出，隨著采收葉片SPAD值降低，煙堿含量（y7）顯著增加，與SPAD值含量呈線性相關，y7= -0.1723x+ 3.6577（R2= 0.8661）；還原糖、總糖呈先升高后降低的趨勢，鉀離子含量呈先降低后升高的趨勢。

表6 不同SPAD值采收烤后煙葉常規化學成分含量Tab.6 The chemical components of tobacco leaves with different SPAD values when harvesting

2.4.3 對烤后煙葉TSNAs含量的影響

從表7可以看出隨著采收SPAD值降低，NAT、NAB、TSNAs含量逐漸降低，NNK含量隨著采收SPAD值降低呈先降低后升高的趨勢。當采收SPAD值在9±1.5內TSNAs含量顯著降低，主要表現為NNN、NAT、NAB含量降低，TSNAs含量（y8）與SPAD值含量呈線性相關，y8= 38.387x+ 337.74（R2 =0.9566）。

2.4.4 對烤后煙葉感官質量的影響

從表8中可以看出，隨著采收煙葉SPAD值的降低，烤后煙葉感官評吸質量呈升高后降低的趨勢，SPAD值低于17時煙葉雜氣得到明顯改善。SPAD值在13±1.5范圍內烤后煙葉感官評吸質量最高，香氣質較好，余味較舒適；其次為SPAD值9±1.5，隨著成熟度進一步提高，香氣質、余味變差。

表7 不同SPAD值烤后煙葉TSNAs含量Tab.7 Contents of TSNAs in tobacco leaves with different SPAD values when harvesting ng/g

表8 不同SPAD值采收烤后B2F煙葉感官質量評價Tab.8 The sensory quality evaluation of tobacco leaves with different SPAD values with harvesting

3 討論

SPAD值與葉綠素含量呈線性正相關，可用于客觀判斷上部葉采收的成熟度[21]，本試驗對進入采收期的上部四片煙葉SPAD值均值在9～25范圍內進行成熟度細分，明確了上部葉采收SPAD值與鮮煙葉綠素含量、葉片含水情況、組織結構、凈光合速率、蛋白質含量及烤后煙葉煙堿、多酚、TSNA含量之間的相關性，對指導上部葉成熟采收具有重要意義，同時為機器視覺鑒別煙葉適宜采收成熟度提供支撐[26-27]。

隨著煙葉的逐漸成熟和衰老，葉色逐漸變黃，柵欄組織和海綿組織從最初的整齊排列到逐漸排列紊亂，光合色素降解加速，與光合作用等合成代謝相關蛋白多下調表達，而逆境反應及呼吸作用等分解代謝相關蛋白多上調表達[28]。本試驗結果表明隨著SPAD值降低束縛水含量升高，凈光合速率降低，但光合產物蔗糖含量呈增加的趨勢，與碳代謝關鍵酶INV活性降低有關，蔗糖水解能力減弱，光合產物得不到有效利用，淀粉酶活性先升高后降低，SPAD值17±1.5時采收糖積累代謝到達頂峰，此時采收烤后煙葉總糖、還原糖含量最高；隨著采收SPAD值進一步降低，葉片為維持細胞正常代謝淀粉開始分解，煙葉碳氮代謝減弱，POD、SOD活性，H2O2、MDA含量顯著增加，逆境脅迫增強，衰老程度加重。聶榮邦等[29]研究表明烤煙中部葉自欠熟至過熟束縛水含量漸次降低，而本試驗上部葉成熟后，隨著衰老程度加重，束縛水含量表現為逐次增加，可能與上部葉成熟后期溫度降低有關，束縛水含量增加上部葉抗逆性增強，烘烤特性表現為脫水較難，需保濕變黃。

采收SPAD值與烤后煙葉多酚、煙堿含量呈線性負相關，進一步量化了前人[14-15]的研究結論。隨著采收SPAD值降低成熟度提高，NR活性降低，煙葉氮素吸收能力降低，但總氮含量呈先降低后增加的趨勢，可能與養熟過程中土壤養分供給能力較強有關，烤后煙葉煙堿含量持續增加，可見葉片衰老后氮素利用轉向煙堿合成[30-31]，因此上部葉成熟期較低的土壤供氮能力尤為重要。采收成熟度影響亞硝酸鹽和亞硝胺的積累[32]，張樹堂等[17]研究表明不同成熟度煙葉亞硝胺含量過熟＞初熟＞適熟，而在本研究采收SPAD值范圍內，SPAD值與TSNAs含量呈線性正相關，提高采收成熟度可降低TSNAs含量，可能與本試驗設置的SPAD值9±1.5采收成熟度未達到其過熟標準有關；提高采收成熟度有利于減少變黃、定色時間，從而降低煙堿與硝酸鹽反應時間[33-34]，NNN、NAT、NAB含量降低，上部葉吸食安全性提高；NNK呈先降低后增加的趨勢，與總氮含量變化一致，有待進一步研究。

上部葉成熟特征與品種、氣候、施肥等條件息息相關，本試驗基于鄂西南煙區生態條件下的云煙87開展上部葉成熟度研究，其適宜采收成熟度范圍為SPAD值13±1.5，此時采收的上部葉感官評吸質量最高，若成熟度進一步增加煙堿含量顯著增加，香氣質、余味變差。本試驗不同SPAD值采收的煙葉在同一溫濕度條件下烘烤制得，如何對量化分類的不同成熟度煙葉進行最佳工藝匹配，進一步彰顯上部葉質量特色有待進一步研究。

4 結論

鄂西南煙區云煙87上部四片采收SPAD值均值適宜范圍為13±1.5，此時采收成熟度適宜，烤后煙葉感官質量最佳，香氣質好，雜氣較少，TSNAs含量較低。