基于碳納米材料的黃曲霉毒素電化學檢測方法研究現狀

喻理，馬飛，趙安順，白藝珍，李董，李培武

1(農業部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室，農業農村部油料及制品質量監督檢驗測試中心，農業部生物毒素檢測重點實驗室，國家農業檢測基準實驗室(生物毒素)，中國農業科學院油料作物研究所，湖北 武漢，430062)2(農業農村部科技發展中心，北京，100122)

黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌侵染食品產生的一類香豆素衍生物，目前已知的黃曲霉毒素有十幾種，最常見的有黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)、B2(aflatoxin B2, AFB2)、G1(aflatoxin G1, AFG1)、G2(aflatoxin G2, AFG2)、M1(aflatoxin M1, AFM1)、M2(aflatoxin M2, AFM2)六種，其中AFB1早在1993年就被世界衛生組織的癌癥研究機構認定為I類致癌物質。黃曲霉毒素極易污染谷物、花生、玉米、糧油、飼料等食品和農產品，嚴重危害人畜安全。

食品污染物檢測與分析是控制食品安全的重要方式，對保障食品安全發揮著重要作用。由于黃曲霉毒素具有穩定性強、不易清除、前端管控難等特點，因此，對食品和農產品中黃曲霉毒素進行檢測與分析成為了控制毒素危害的主要措施之一，也一直是科學界研究的熱點。目前，出版的黃曲霉毒素檢測分析研究文獻已經超過了2 000篇。常見的黃曲霉毒素檢測方法有薄層色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質譜法、免疫層析法和酶聯免疫吸附法等，這些方法各有利弊，如所需儀器昂貴、操作要求高、前處理復雜耗時等。電化學分析方法是繼上述方法之后發展的一種分析方法，因操作簡單、價格低廉、靈敏度高、響應快等優點，在食品檢測分析領域特別是黃曲霉毒素檢測分析中應用廣泛[1-4]。隨著納米技術的不斷發展，利用納米材料的優良物理化學性能，將其整合進電化學分析中以提升檢測靈敏度和穩定性，減少基質效應，成為近年來電化學分析研究的新趨勢。碳納米材料具有高比表面積，優異的電傳輸能力，良好的生物兼容性和易于官能化等優點，尤其受到分析研究領域科研工作者的青睞，在真菌毒素的電化學分析檢測中發揮著越來越大的作用[5-6]。本文在簡單概述了黃曲霉毒素檢測方法和碳納米材料在電化學分析應用中的主要功能作用的基礎上，對基于碳納米材料的黃曲霉毒素電化學檢測方法做了詳細介紹，并對其發展趨勢進行了展望。

1 黃曲霉毒素檢測方法

1.1 黃曲霉毒素傳統檢測方法

黃曲霉毒素是一類強致癌的生物毒素，由于其污染多種糧油作物和食品，且不易管控，世界各國均制定了嚴格的黃曲霉毒素限量標準，以保障人民的身體健康。我國國標(GB 2761—2017)規定谷物及其制品中AFB1限量在5.0～20 μg/kg，歐盟(EU)No165/2010規定堅果中AFB1的限量為2 μg/kg，黃曲霉毒素總量的限量值為4 μg/kg。日益嚴格的黃曲霉毒素限量規定，對其檢測方法提出了更高的要求和更大的挑戰。

薄層色譜法(thin-layer chromatography, TLC)是最早的黃曲霉毒素檢測方法[7]，其原理是：將黃曲霉毒素經過提取、濃縮、薄層分離后，在紫外光照射下觀察其熒光特性，以產生的熒光信號強弱來對毒素的含量進行定性分析，方法的缺點是操作過程繁瑣復雜、溶劑消耗大、對實驗人員危害大、重現性差、靈敏度低。高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)[8]和液相色譜-質譜法(liquid chromatography-mass spectrometer, LC-MS)[9]是基于色譜原理的儀器分析方法，其優點是檢出限低，一般檢出限可達μg/kg，缺點是依賴大型儀器，成本高，前處理復雜。免疫層析法(immunochromatographic assay, ICA)[10]和酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)[11]是基于抗體與檢測物發生免疫反應而建立起來的免疫分析方法，優點是操作簡單，缺點是受基質影響大，檢測靈敏度和準確性不及儀器分析方法。

由于傳統檢測方法均有局限，因此探索環境友好、方便快捷、靈敏準確的黃曲霉毒素分析方法成為眾多研究人員近年來努力的方向。

1.2 黃曲霉毒素電化學分析方法

電化學分析法是一種依據物質的電化學性質來測定物質組成及含量的分析方法。主要檢測原理是將被測物與檢測物發生的生物或化學反應所產生的信號經過換能器轉變成相應的電信號，必要時經放大器將電信號再次放大并輸出，以電信號的變化來間接分析待測物的濃度，常見檢測物質有活性氧、酶、脫氧核糖核酸、葡萄糖等[12]。電化學分析方法自上世紀五六十年代起得到了較大的發展，作為生物、化學、物理、醫學、電子技術等多學科互相滲透成長起來的交叉學科研究領域，因儀器簡單、價格低廉、易于操作(通常不需要特殊的技術以及對前處理沒有特別的要求)、靈敏度高、選擇性好、穩定性高、響應快等優點在生命、環境、食品安全等多個領域得到了廣泛應用[13-16]。1997年ANDREOU等首次將電化學分析方法用于脫脂牛奶中AFM1的檢測[17]，隨后黃曲霉毒素的電化學分析方法研究逐漸發展成為當前黃曲霉毒素檢測分析研究中最活躍的領域之一[1,4,13,18]。

根據檢測的電信號的不同，黃曲霉毒素電化學分析法可以分為電流型、電導型、電位型和阻抗型等。電流型(又稱安培型)的工作原理是在電壓一定的情況下，通過檢測待測物引發的響應電流，對待測物進行定量分析。譚蕓[19]就構建了一種電流型的檢測黃曲霉毒素的電化學分析方法：首先利用抗原抗體反應，將標記了辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)的抗體固定在電極表面，在HRP催化下，H2O2將對苯二酚氧化成對苯醌，對苯醌在電極上被還原，產生還原電流，以此來檢測黃曲霉毒素。這類檢測方法簡單，成本低，但在固定材料、標記系統和電活性物質等方面還需改進。電導型的工作原理是基于待測物與檢測物反應所引起的平行電極間電導變化來對待測物濃度進行測定的分析方法。LIU等[20]基于一種金微叉指電極和HRP建立了一種AFB1電化學免疫檢測方法，該方法通過觀察電解質電導的變化來測定AFB1的濃度。電導型分析方法易受待測物樣品中的離子強度與緩沖液電容的變化影響，導致非特異性問題。電位型(又稱電勢型)的工作原理是基于測量電位變化來對待測物進行定量分析。LAROU等[21]基于生物電識別檢測AFM1，該方法通過測量細胞膜上的電位變化來計算出待測樣品中AFM1的含量。電位型檢測方法成本低、反應快，但易受基質影響，在實際樣品的檢測中應用比電流型少。阻抗型的工作原理是以電子轉移阻抗的變化值來反映被測物的量。OWINO等[22]在一種電合成聚苯胺的平臺上構建了一種免疫阻抗響應的AFB1檢測方法，將AFB1抗體固定在由聚苯胺和聚(苯乙烯磺酸)修飾的鉑電極上，通過檢測電子轉移的情況來推導出AFB1的濃度。阻抗型檢測方法的靈敏度較高、反應快，但體系成熟度不高，是當前主流類型中研究的熱點。

雖然目前的電化學分析方法已經能夠對黃曲霉毒素進行簡便、快速、特異和靈敏的檢測與分析，但在實際應用中仍會受到如基質效應、抗體固定、信號傳輸等不成熟的因素的影響。為了能構建更靈敏、更準確、更實用的新型電化學檢測模式與方法，具有多種優良性能的納米材料特別是碳納米材料被引入到電化學分析中，并已展現出了巨大的潛在應用價值[23]。

2 碳納米材料在電化學分析中的應用

碳納米材料是指材料的三維尺度中至少有一維小于100 nm的碳材料。主要包括零維的碳量子點、富勒烯，一維的碳納米管、碳納米纖維，二維的石墨烯等及它們的衍生物。碳納米材料不僅具有納米效應，還有優異的電學性能(如較寬的電位窗口、快速的電子傳輸速度等)、強大的吸附性能、良好的化學穩定性和易于官能化的特性、良好的形狀可控性和生物相容性等，為其在電化學分析中的應用奠定了基礎[24]。

目前，碳納米材料在黃曲霉毒素電化學分析應用中的主要作用有：充當生物分子的固載基體，提高電子傳輸速度，提升界面的電催化性能，吸附目標物和穩定體系等[25]。通常，碳納米材料在電化學分析中的應用往往不僅僅局限于單一的作用與功能，大多時候是多功能的有效疊加來協同完成其對黃曲霉毒素分析性能的提升。如ARATI等[26]用納米金(gold nanoparticles, AuNPs)修飾聚(3，4-乙烯二氧噻吩)(poly(2,3-dihydrothieno-1,4-dioxin), PEDOT)-氧化石墨烯(graphene oxide, GO)的納米復合材料，構建了一種AFB1的電化學免疫分析方法。研究人員首先采用循環伏安法(cycle voltammetry, CV)和電化學阻抗譜法(electrochemical impedance spectroscopy, EIS)系統研究了被修飾的玻碳電極(glassy carbon electrode, GCE)的電催化行為，然后發現電流信號與磷酸緩沖液中的AFB1濃度在0.5～20 ng/mL和20～60 ng/mL兩個區間內呈線性關系，由此構建的檢測方法的靈敏度分別為0.989和0.397 μA/(ng/mL)，檢出限為0.109 ng/mL。該方法也被證實可以用于實際樣品檢測，在玉米的AFB1檢測分析中的檢出限為0.09 ng/mL。在這個方法的構建中GO不僅充當了抗體和納米金顆粒的固載平臺，同時為電子的快速傳輸提供了便利。GAN等[27]基于磁性氧化石墨烯萃取AFM1和抗體標記的碲化鎘(CdTe)量子點(quantum dots，QDs)-碳納米管納米(carbon nanotubes, CNTs)復合材料構建了一種超靈敏的電化學發光(electrochemiluminescent, ECL)免疫分析方法檢測牛奶中AFM1。該方法不僅利用了碳納米材料的良好吸附特性，還證明了CNTs對ECL信號的放大作用。方法原理是將GO-Fe3O4磁性復合材料作為吸附劑提取牛奶中的AFM1，再將黃曲霉毒素M1抗體(AFM1-Ab1)與CdTe QDs-CNTs復合物結合形成信號標記物，并固定在絲網印刷碳電極(screen printed carbon electrode, SPCE)上，利用抗原抗體特異性識別反應形成的免疫復合物的電化學發光信號的強度來判定AFM1的含量。經過一系列的條件優化，AFM1在1.0～1.0×105pg/mL對數與電化學發光信號呈現良好的線性關系，由此構建的分析方法檢出限為0.3 pg/mL，遠遠高于ELISA方法。由此可見，碳納米材料的多種優良特性已經被有效整合用于黃曲霉毒素的電化學分析中。

3 基于碳納米材料的黃曲霉毒素電化學檢測方法

3.1 石墨烯類納米材料在黃曲霉毒素電化學檢測分析中的應用

石墨烯(graphene, G)是由sp2雜化的碳原子組成的具有六角形蜂窩狀結構的原子級厚度的二維納米材料，是所有碳材料的基本組成單元。G具有快速的電子傳遞速率(200 000 cm2/(V·s))、優良的機械性能、高的熱導率、大的比表面積(單層石墨烯的理論比表面積達2 630 m2/g)和良好的生物相容性[28]，在電化學分析方法研究中應用廣泛。GO是石墨烯片層被不同程度氧化后產生的一類石墨烯的衍生物，其制備通常由石墨氧化而成，比G獲得更方便。GO因氧化程度不同，含氧官能團數量略有不同[29]，由氧化而引起的豐富電化學缺陷與功能基團(羥基、羧基、羰基等)使其具有很強的耦合性，很容易與電化學活性物質、生物分子等物質偶聯。含氧官能團的存在還使其具有良好的生物兼容性與親水性，保證了偶聯后的多種生物分子結構與活性不被破壞，為構建不同檢測模式的黃曲霉毒素分析方法提供了便利。SRIVASTAVA等[30]將氧化石墨烯溶液均勻分散在金(Au)電極表面構建了GO/Au電極，通過偶聯劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)與活化劑N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)成功地將黃曲霉毒素抗體(anti-AFB1)固定在電極表面，并用牛血清蛋白(bull serum albumin, BSA)封閉電極表面非特異性位點構建了BSA/anti-AFB1/GO/Au免疫復合電極。采用EIS研究了該電極在含鐵氰化鉀的磷酸緩沖溶液中的電荷轉移電阻(charge transfer resistance, Rct)與AFB1濃度的函數關系。結果表明，當AFB1在0.5～5 ng/mL，Rct與AFB1濃度呈良好的線性關系，檢出限為0.23 ng/mL。

雖然GO易于偶聯修飾，但是含氧官能團的存在也在一定程度上導致其導電性下降，限制了電信號傳輸速度。還原氧化石墨烯(reduced graphene oxide，rGO)是對GO片層的含氧官能團進行部分還原的石墨烯類納米材料，結構與GO和G類似，但與GO相比，具有更快的電子傳輸速度，因此，在黃曲霉毒素的電化學分析中應用更為廣泛。

SRIVASTAVA等[31]采用電泳沉積技術將rGO沉積在氧化銦錫(indium tin oxide, ITO)導電玻璃上，通過EDC/NHS法將黃曲霉毒素抗體(anti-AFB1)共價交聯到rGO/ITO上，并運用CV和EIS研究了其電化學行為。當AFB1質量濃度在0.125～1.5 ng/mL時，陽極峰值電流與AFB1質量濃度呈線性關系，相關系數達0.99，檢出限為0.15 ng/mL，靈敏度為68 μA/[(ng·mL-1)·cm2]。

近年來，科研人員又利用貴金屬良好的電催化能力，將貴金屬與石墨烯材料復合，建立了多種黃曲霉毒素電化學分析方法。SRIVASTAVA等[32]用金納米粒子修飾的rGO沉積在ITO玻璃上構建了Au@rGO/ITO免疫電極，通過電流響應信號來檢測AFB1，檢測范圍在0.1～12 ng/mL，檢出限達0.1 ng/mL，比僅用rGO的檢出限低。最近他們又利用水合肼將鎳納米粒子(Ni nanoparticles, Ni NPs)修飾在rGO上，再將復合材料沉積在ITO玻璃上構建了rGO-Ni NPs/ITO復合電極，用差分脈沖法(differential pulse voltammetry, DPV)檢測AFB1毒素，構建的方法在1～8 ng/mL靈敏度達129.6 μA/[(ng·mL-1)·cm2]，高靈敏度主要歸功于rGO和Ni NPs間的協同效應[33]。ALTHAGAFI等[34]將金納米點修飾的rGO納米材料沉積到ITO導電玻璃上，再將抗體固定到復合電極上，利用抗原抗體反應后導致的電流值的變化，采用CV的電化學檢測技術構建了一種超靈敏的AFB1檢測方法，檢出限可達到6.9 pg/mL，并在檢測低濃度AFB1的加標花生樣品中取得了良好效果。最近，石墨烯量子點(graphene quantum dots，GQDs)也基于上述檢測模式被用于黃曲霉毒素電化學檢測分析中。SHADJOU等[35]發明了一種AFM1電化學分析方法，該方法將石墨烯量子點、α-環糊精(α-cyclodextrin, α-CD)和銀納米粒子(silver nanoparticles, AgNPs)依次沉積到GCE上，制備了一種三元復合薄膜，通過線性掃描伏安法(linear sweep voltammetry，LSV)建立了AFM1檢測方法。在此方法中α-環糊精作為傳導介質，GQDs作為穩定劑，AgNPs作為電催化劑，共同促成了檢測信號放大的目標。在最優條件下，方法的檢測范圍為0.015～25 mmol/L，定量限為2 μmol/L，該方法可用于未經任何處理的牛奶中AFM1的檢測。SHU等[36]將四苯基卟啉鈷(cobalt tetraphenyl porphyrin, CoTPP)和鉑納米粒子(platinum nanoparticles, PtNPs)功能化的rGO與AFB1抗體復合，形成anti-AFB1/PtNPs/CoTPP/rGO復合物。利用復合物與偶聯了AFB1-BSA的納米金修飾的GCE發生免疫反應，以PtNPs/CoTPP/rGO納米復合物催化H2O2的還原產生的還原電流為電化學信號，采用差分脈沖伏安法建立了一種基于競爭型免疫分析模式的AFB1電化學分析方法，檢出限達1.5 pg/mL。

導電聚合物是近年來電化學研究的熱點之一。離子液體具有較高的電導率，常作為電解液應用于電化學分析中。除了貴金屬，導電聚合物和離子液體也常和石墨烯類納米材料一起被用于黃曲霉毒素的檢測分析中。王瑞鑫等[37]將殼聚糖(chitosan, CS)、石墨烯和1-丁基-3-甲基咪唑基四氟硼酸鹽離子液體(1-butyl-3-methyl imidazolium tetrafluoroborate ionic liquid, IL)混合溶液通過縮合反應固定在GCE上，再將AFB1抗體包埋固定，構建一種可用于快速測定食品中的AFB1的電化學免疫分析方法。運用CV和DPV法研究免疫反應對電極響應電流的影響，優化條件后，通過峰電流的降低值和AFB1濃度對數的線性關系，建立了檢測范圍在0.1～8.1 ng/mL的檢測方法，檢出限為0.04 ng/mL。并將該方法成功用于花生和玉米油樣品中AFB1的檢測中，回收率在94.73%～104.41%。WANG等[38]將還原氧化石墨烯、聚吡咯(polypyrrole, PPy)和吡咯丙酸(pyrrole propanoic acid, PPa)的復合溶液采用恒電流聚合法一步制成PPy/PPa/rGO納米復合物薄膜在GCE電極上，并通過共價偶聯將抗體固定在PPy/PPa/rGO/GCE電極表面，用于AFB1的超靈敏檢測。通過探究抗體修飾后的電極在測試待測物前后的Rct變化與待測物中AFB1濃度之間的對應關系，建立了一個靈敏的AFB1檢測方法，該方法在10 fg/mL～10 pg/mL的檢測范圍對AFB1有很好的響應。該方法不僅靈敏度低(檢出限10 fg/mL)，還具有很好的特異性，在相同濃度水平下，對AFB2、AFG1和AFG2的交叉反應率分別為5.0%，30.6%和20.1%，對嘔吐毒素和赭曲霉毒素的交叉反應率均低于1.0%。

隨著石墨烯類納米材料在黃曲霉毒素電化學分析中應用研究的不斷深入，科研人員也嘗試將貴金屬、離子液體或導電聚合物與石墨烯類納米材料三者有機結合來協同提升黃曲霉毒素電化學分析的性能。SHI等[39]用納米金修飾聚苯胺(polyaniline, PANI)/石墨烯納米復合材料，并將其固定在金電極上形成Au/PANI/G/Au電極的檢測傳感器，利用免疫反應和方波伏安法(square wave cyclic voltammetry, SWV)建立AFB1的電化學分析方法，檢測范圍在0.05～25 ng/mL，檢出限為0.034 ng/mL。ZHOU等[40]將GO、導電聚合物(2,5-di-(2-thienyl)-1-pyrrole-1-(pbenzoic acid), DPB)和金納米粒子依次電沉積到金電極表面，緊接著通過EDC/NHS將黃曲霉毒素的抗體共價偶聯在導電聚合物膜上，最后又將含殼聚糖的離子液體修飾在電極表面制備了用于食品樣品中AFB1的電化學阻抗免疫分析方法。其中，石墨烯和金納米顆粒保證了電子的快速傳輸，離子液體為抗體提供了一個溫和的微環境，電化學阻抗測試保障了檢測的高靈敏度。建立的AFB1的檢測方法在3.2×10-15～0.32×10-12mol/L具有良好線性關系，檢出限低至1.0×10-15mol/L，且對花生、大米、牛奶、面粉、大豆等食品樣品的加標回收率在96.3%～101.2%，具有良好的精密度和準確性。

石墨烯納米材料除了可以用于基于抗原抗體免疫反應的電化學檢測模式，也同樣適用于適配體(aptamer, Apt)識別黃曲霉毒素的電化學檢測模式。GOUD等[41]就基于功能化氧化石墨烯(functional graphene oxide, FGO)和適配體技術構建了一種可用于酒精飲料中AFB1的檢測方法，FGO被沉積在了絲網印刷碳電極上(screen-printed carbon electrode, SPCE)，己二胺(hexamethylenediamine, HMDA)通過EDC/NHS共價偶聯在FGO上，形成了一個空間結構，再將可識別AFB1的標記有亞甲基藍(methylene blue, MB)的適配體共價偶聯到HMDA上，通過適配體識別AFB1產生的空間結構變化導致的亞甲基藍電信號的變化來進行定量檢測。FGO在其中不僅作為固定適配體的平臺，同時能輔助電催化放大亞甲基藍電化學信號。構建的方法在0.05～6 ng/mL具有很好的線性關系，檢出限為0.05 ng/mL。

GELETA等[42]構建了一種基于還原氧化石墨烯/二硫化鉬/聚苯胺納米復合材料的黃曲霉毒素電化學分析方法，他們將合成的納米復合材料與殼聚糖混合后包覆在玻碳電極表面，然后將納米金和AFB1適配體依次修飾到電極上，利用毒素與適配體發生的空間結構變化導致的電子交換的阻滯引起的電流響應變化，通過DPV法建立了AFB1的檢測方法，檢測范圍在1.0×10-17～1.0×10-15g/mL，檢出限為2×10-18g/mL。該方法的選擇性強，并已經成功用于酒中AFB1的檢測。

KHOSHFETRAT等[43]開發了一種基于適配體技術和GO的用于牛奶中AFM1檢測的電化學發光方法。首先，硫醇化的AFM1適配體固定在金納米粒子覆蓋的磁性納米顆粒(gold-coated magnetic nanoparticles，GMNPs)上，形成Apt-GMNPs復合物。魯米諾官能化的銀納米粒子修飾的氧化石墨烯(luminol-functionalized, silver nanoparticle-decorated, graphene oxide, GO-L-AgNPs)通過GO與適配體上未配對的堿基產生的π-π作用，成功與Apt-GMNPs結合，形成Apt-GMNPs-GO-L-AgNPs復合物。當AFM1存在時，適配體與毒素反應導致GO-L-AgNPs脫離，由此導致了電化學發光信號的變化。基于上述原理作者建立了一種AFM1的分析范圍在5～150 ng/mL、檢出限為0.01 ng/mL的分析方法，該方法已經成功地用于牛奶中AFM1的檢測，且重現性可靠。

3.2 碳納米管在黃曲霉毒素電化學檢測分析中的應用

碳納米管是由層狀結構的石墨片層卷曲而成的一類碳納米材料。按照管壁片層數分類，碳納米管主要分為單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes, SWCNTs)和多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes, MWCNTs)。碳納米管中碳原子以sp2雜化為主，同時六角型網格結構存在一定程度的彎曲，形成空間拓撲結構，其中可形成一定的sp3雜化鍵，即形成的化學鍵同時具有sp2和sp3混合雜化狀態，而這些p軌道彼此交疊在碳納米管的片層外，形成高度離域化的大π鍵，碳納米管外表面的大π鍵是碳納米管與一些具有共軛性能的大分子以非共價鍵復合的化學基礎。由于共軛效應顯著，碳納米管具有一些特殊的電學性能，它既具有金屬性和半導體性，又具有較高的導電性和良好的電催化活性，因而成為一種優良的電子傳輸體，在電化學檢測分析中能大大加快電子在電活性物質之間的傳遞[44]。

利用免疫反應建立檢測模式，再利用碳納米管的優異電化學特性，科研人員開發了不少黃曲霉毒素電化學免疫分析方法。SINGH等[45]將羧基化多壁碳納米管(carboxylated multiwalled carbon nanotubes，c-MWCNTs)通過電泳技術一步沉積在ITO玻璃上制得c-MWCNTs/ITO復合電極。通過EDC和NHS將黃曲霉單克隆抗體(anti-AFB1)共價偶聯在復合電極上，并用BSA封閉其非特異性活性位點，制備了BSA/anti-AFB1/MWCNTs/ITO免疫電極。此電極的締合常數低至0.091 5 ng/mL，表明此電極對AFB1有很強的親和力。利用循環伏安技術建立分析方法，結果表明，AFB1檢測的線性范圍在0.25～1.375 ng/mL，檢出限為0.08 ng/mL，靈敏度高達95.2 μA/[(ng·mL-1)·cm2]。ZHANG等[46]設計了一種基于單壁碳納米管/殼聚糖(SWCNTs/CS)的間接競爭型AFB1電化學免疫分析方法。首先，將SWCNTs/CS納米復合物滴涂在玻碳電極表面，制得SWCNTs/CS/GCE電極；經EDC/NHS反應將AFB1-BSA固定在電極表面，用BSA封閉多余的位點。然后，利用AFB1抗體與固定在電極表面的AFB1-BSA和待測液中游離的AFB1競爭，將AFB1抗體固定在電極上之后，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)標記的二抗(AP-anti-antibody)通過與一抗反應被選擇性固定到電極表面。最后，復合電極被沉浸在含α-萘基磷酸(α-naphthyl Phosphate，α-NP)的二乙醇胺溶液中，通過堿性磷酸酶催化水解α-NP產生的電化學信號來達到間接檢測AFB1濃度的目的。差分脈沖伏安測試結果表明，在0.01～100 ng/mL，電流密度隨AFB1濃度的對數呈線性降低，檢出限低至3.5 pg/mL。在實際玉米粉樣品中對AFB1的檢出限低至13.5 pg/mL，大大低于大多數國家設置的限量標準。

碳納米管也常與具有電活性的物質(如離子液體)一起用于黃曲霉毒素的電化學檢測分析中。YU等[47]將多壁碳納米管、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽(1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate，[BMIM]PF6)離子液體和黃曲霉毒素抗體組成的復合物修飾在GCE電極表面，通過與黃曲霉毒素發生特異性免疫反應，用免疫反應前后其電子傳輸電阻與AFB1濃度的線性關系來檢測黃曲霉毒素，檢測范圍在0.1～10 ng/mL，檢出限低至0.03 ng/mL，并成功用于橄欖油中黃曲霉毒素的檢測。ZHANG等[48]將電活性物質聚二烯丙基二甲基氯化銨(poly(diallyl dimethyl ammonium chloride), PDDA)作為碳納米管的分散劑和電荷調節劑，制備出碳納米管/聚二烯丙基二甲基氯化銨/鈀金納米粒子(CNTs/PDDA/Pd-Au)復合物，將其修飾在金電極上，再將黃曲霉毒素抗體(anti-AFB1)和BSA依次固定在電極上，利用免疫反應和差分脈沖伏安法來對AFB1進行定量分析，構建的方法的檢測范圍在0.05～25 ng/mL，檢出限達0.03 ng/mL，并成功用于污染大米的檢測中。

貴金屬能與多種生物分子兼容，且有良好的電催化活性，因此，與碳納米管共同構建的黃曲霉毒素電化學分析方法也屢有報道。LI等[49]將黃曲霉毒素氧化酶(aflatoxin-oxidase, AFO)嵌入硅的溶膠-凝膠溶液中與多壁碳納米管修飾的鉑電極偶聯，形成AFO sol-gel/MWCNT/Pt電極，用于催化氧化AFB1，通過計時電流法(chronoamperometry, I-t)建立了黃曲霉毒素電化學分析方法，該方法在AFB1濃度為3.2×10-9～721×10-9mol/L呈良好線性，靈敏度為0.33×102A/[(mol·L-1)·cm2]，檢出限為1.6×10-9mol/L。WANG等[50]采用分步法構建了一種分子印跡的AFB1電化學檢測方法。首先將Au/Pt雙金屬納米粒子(Au/Pt bimetallic Nanoparticles, Au/PtNPs)電沉積在多壁碳納米管修飾的玻碳電極上，然后將鄰苯二胺(OPD)和AFB1電聚合在Au/PtNPs-MCNTs-GCE電極表面，最后用鹽酸將印跡分子AFB1去除得到MIPOPD-Au/PtNPs-MCNTs-GCE電極。通過循環伏安技術、差分脈沖伏安技術和電化學阻抗譜考察了其電化學分析的性能。由差分脈沖伏安技術建立了AFB1電化學分析方法，檢測范圍在1×10-10～1×10-5mol/L，檢出限為0.03 nmol/L，并證實該方法可應用于地溝油中AFB1的檢測。

3.3 其他碳納米材料在黃曲霉毒素電化學檢測分析中的應用

其他碳納米材料如碳納米角、介孔碳、碳量子點、碳納米球等也因為其不同的微觀結構和獨特的物理化學特性，被用于電化學分析中。如介孔碳材料具有高電導率、物理化學穩定性和高比表面積等優點，被廣泛應用于催化領域中，特別是用于電極材料和電催化劑等[51]。碳納米球具有規則的幾何外形、較高的比表面和良好的生物相容性，常被用于制備新型多酶標記物[52]，用于放大信號提升分析的靈敏度。

近年來，也有其他的碳納米材料被用于黃曲霉毒素的電化學分析檢測。MONDAL等[53]采用靜電紡絲技術和旋轉涂布技術在硅晶片表面合成了聚甲基丙烯酸甲酯(poly(methyl methacrylate), PMMA)和聚丙烯腈(polyacrylonitrile, PAN)的兩層復合膜，再經高溫炭化分解去除聚PMMA纖維，制備出內嵌在PAN無定型碳電極上的微孔孔道，然后再采用熱分解法將鉑納米粒子修飾在微孔孔道上，通過EDC/NHS將黃曲霉毒素單克隆抗體共價交聯到PtNPs/微孔碳電極表面，通過免疫反應引起的阻抗變化建立了黃曲霉毒素分析方法，檢測范圍在1.0×10-12～0.1×10-6g/mL，檢出限為1.0×10-12g/mL。微孔碳電極不僅為PtNPs的沉積和抗原抗體反應提供了一個微環境，而且使得電子傳輸速度提升，從而促進了電化學性能的提升。

XU等[54]構建了一種基于碳納米角(carbon nanohorns, CNHs)和磁性納米材料的AFB1電化學發光免疫分析方法。在磁性玻碳電極(magnetic glassy carbon electrode, MGCE)上依次修飾上CNHs和吸附了魯米諾的Fe3O4磁性纖維(luminol-functionalized Fe3O4nanofibers, L-Fe3O4-NFs)，通過共價反應將黃曲霉毒素抗體偶聯在L-Fe3O4-NFs/CNHs/MGCE復合電極，用BSA封閉非特異性位點，利用免疫反應和魯米諾產生的電化學發光信號來建立AFB1檢測方法。具有優良導電性、生物相容性、大比表面積和可變孔隙度的CNHs可以大大提升魯米諾的電化學發光信號，Fe3O4納米材料可以大量吸附信號材料魯米諾，也是固定抗體的基底，并使得抗體能大量富集到MGCE表面。建立的AFB1的分析方法檢出限可達0.02 ng/mL，檢測范圍在0.05～200 ng/mL。

4 結論與展望

食品安全與人類健康緊密相連，食品質量安全也是近年來人民和政府關注和重視的熱點問題。電化學分析方法一直是環境、農業和食品檢測領域的重要分析方法。隨著材料科學和納米技術的不斷發展，電化學分析方法的性能與效率也在不斷提高。目前，黃曲霉毒素電化學檢測方法雖然較傳統的酶聯免疫吸附法和色譜法具有很多優勢，但仍有很大的發展空間。

表1 碳納米材料在黃曲霉毒素電化學分析中的應用Table 1 Applications of carbon nanomaterials in analysis of aflatoxins with electrochemical techniques

注：電極材料和檢測方法中的英文縮寫均在正文中有注釋。

(1)檢測通量有待提高。目前大多數方法只能測定單一組分，這顯然限制了其實際應用，發展可以同時檢測多種黃曲霉毒素或生物毒素的方法，對保障食品安全意義重大。

(2)實用、便攜、可重復使用、快速的檢測方法及分析裝置還有待進一步研究。目前，大部分用于黃曲霉毒素檢測的電化學傳感裝置仍處于實驗室研究階段，很難像商業化試劑盒或血糖儀那樣方便快捷的對樣品進行實時檢測。同時，大部分建立的黃曲霉毒素分析方法都是基于磷酸緩沖溶液中的毒素，對實際樣品的檢測效果就會受基質干擾而大打折扣，或實用性不強。因此，改進方法的實用性也將是未來科學研究努力的方向之一。

(3)研發新檢測模式。現有方法的檢測模式有許多，如識別技術有免疫方法、適配體技術、分子印跡等，碳納米材料的功能使用上有利于吸附特性、結構特性、電學特性、光學特性等，目前的研究已經在多檢測模式融合和碳納米材料的多用途利用方面進行了不少大膽的嘗試，相信這也將成為黃曲霉毒素電化學分析研究下一步的發展方向。采取多種檢測模式聯用技術有望在利用二者或多者間的協同作用，提升黃曲霉毒素的檢測與分析性能。表1匯總了近年來碳納米材料在黃曲霉毒素電化學分析中的應用情況。

(4)研發新材料。利用納米材料，特別是碳納米管、石墨烯、納米金和磁性納米粒子等，構建復合材料用于黃曲霉毒素檢測的文獻呈現逐年增加的趨勢。因此，要想繼續提升分析檢測的靈敏度和準確度，還須從材料入手，探索具有更強親和力和分子識別能力的識別材料以及可以放大電化學信號的信標材料。