海洋藻類來源ACE IPs的酶法制備及評價模型的研究進展

陳勝軍，蔡苗苗，楊賢慶，楊少玲，李春生

1(中國水產科學研究院南海水產研究所，國家水產品加工技術研發中心，農業農村部水產品加工重點實驗室，廣東 廣州， 510300)2(上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 3(江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心，江蘇 連云港，222005)

目前，高血壓已經成為世界范圍內心、腦血管疾病發病和死亡的主要危險因素，常常還伴有肥胖、糖尿病及其他心、腦血管疾病等并發癥。國務院新聞辦發布的《中國居民營養與慢性病狀況報告(2015)》[1]內容顯示,2012年全國18歲及以上的成人高血壓患病率達25.2%。隨著國家經濟發展和人民生活水平的提高，預防和控制高血壓刻不容緩。血管緊張素轉換酶抑制肽(angiotensin converting enzyme inhibitory peptides，ACE IPs)，又稱降血壓肽(antihypertensive peptides)，是一類能夠降低血壓的小分子肽的統稱。研究表明，降血壓肽適用于高血壓伴心肌梗死和輕度腎功能損害的患者，具有降血壓效果，且不會影響病人血糖和血脂的正常代謝[2]。其中，化學合成的降血壓肽易引發咳嗽、喉嚨腫痛等副作用，因此該類藥物的使用率降低。研究人員針對于無副作用，且不影響正常血壓的食源性降血壓肽做了大量研究。目前研究者們已在球等金鞭藻[3]、羅非魚[4]、綠豆[5]、番茄[6]、核桃[7]、面粉[8]、菜籽[9]等各類食物中制備出了降血壓肽。

與陸生食源蛋白質不同，海洋藻類(marine algae)來源的蛋白質具有特殊的蛋白質組成和氨基酸序列，且海洋藻類中還富含氨基酸類、糖類等多種生物活性物質，因此被賦予多種功能活性，如抗氧化、抗病毒、降血壓等[10-12]。全世界已知藻類有3萬多種，可分為12門，其中有11門海生種類，目前研究利用較多的有紅藻類、褐藻類、綠藻類、藍藻類等。近年來，世界海藻養殖產量逐年增長，聯合國糧農組織“2018年世界漁業和水產養殖狀況”報告指出：2016年世界海藻養殖總量達3 120萬t，而我國作為海藻養殖大國，同年海藻養殖總量占世界海藻養殖總量的47.9%。研究表明，海洋藻類可以為人類提供豐富的優質蛋白質，且海藻蛋白質中氨基酸組成良好，是制備降血壓肽的良好來源。本文對海洋藻類ACE IPs的酶法制備及其降血壓活性的評價模型進行了綜述，以期為海洋藻類開發利用提供參考。

1 作用機制

血管緊張素轉換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)通過鋅離子、氫鍵和帶正電荷的殘基結合位點等活性位點作用于血壓調節系統種的血管緊張素(angiotensin，Ang)和舒緩激肽(bradykinin，BK)，最終達到調節機體血壓的目的。在腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)中，腎素促進Ang轉化為Ang Ⅰ，而ACE酶切Ang Ⅰ的C端His-Leu，使其轉化為Ang Ⅱ，刺激腎臟分泌鹽皮質激素醛固酮，引起腎小管中K+排泄、Na+和Cl-再吸收，造成鈉儲留，還會引起交感神經活動，促使小動脈和毛細血管平滑肌收縮，導致血壓升高[13]。在激肽釋放酶-激肽系統(kallikrein-kinin system，KKS)中，激肽源由激肽釋放酶催化轉變為BK，BK可促進前列環素I2合成，舒張血管，最終起到降血壓作用[14]。然而，ACE會酶切BK的C-端Phe-Arg，使其失活為緩釋肽，導致KKS系統無法正常調節機體內血壓。

食源性ACE IPs被應用于高血壓的治療中，主要是基于其可以抑制ACE的活性或使其失活，阻止Ang Ⅱ的形成，并避免BK失活，從而快速有效地使血壓降低。最常見的ACE IPs類型是抑制劑類，包括競爭性、非競爭性、反競爭性8種抑制類型。在已有研究中，海洋藻類來源的ACE IPs大部分表現為非競爭性抑制類型，少數表現為競爭性抑制類型。有研究認為，ACE IPs可能是通過芳香側鏈與ACE活性位點相結合從而抑制其活性[15]。但目前海洋藻類來源ACE IPs的相關研究較少，其對ACE活性位點的具體抑制原理尚不明確，有待深入研究。

2 ACE抑制肽的酶法制備

酶解法因其具有安全環保，條件溫和、高效、專一、副產物少等優點而成為海洋藻類來源ACE IPs的最常用的制備方法。酶解法一般可分為單酶水解法和復合酶水解法。

2.1 單酶水解法

由于作用方式不同，蛋白酶可分為外切蛋白酶和內切蛋白酶；外切蛋白酶從肽鏈的任意一端開始作用，酶切蛋白后產生單個氨基酸；內切蛋白酶的酶切位點位于肽鏈內側，作用后產生肽段[16]。過多游離氨基酸影響ACE抑制活性，在ACE IPs的制備中更多地選用內切蛋白酶為商業用酶，如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶等。比較單酶水解海洋藻類蛋白源制備ACE IPs的相關研究，分析酶的切割位點及酶解產物活性的關系如表1所示。

堿性蛋白酶與胰蛋白酶的活性位點十分廣泛，作用后產生的肽段中C端含Pro和Tyr、Met等疏水性氨基酸，且由于胰蛋白酶的活性部位含絲氨酸殘基，通常酶切蛋白后產生C末端帶正電荷的氨基酸，如酶切球等金鞭藻蛋白獲得C端為Lys的肽段Tyr-Met-Gly-Leu-Asp-Leu-Lys[3]。由于胃蛋白酶的活性部位含2個羧基，其特異性酶切位點偏向于R2為苯丙氨酸殘基的部位，其作用后產生的肽段的C端氨基酸為Pro或其他疏水性氨基酸，N端氨基酸為疏水性氨基酸或芳香族氨基酸。以上結構均符合ACE IPs的結構模型假說[17]，該假說認為N端區域含疏水性氨基酸、中間部位含帶正電荷的氨基酸殘基和C端含芳香族氨基酸的肽段具有較高ACE抑制活性。也有研究認為，N端含有疏水氨基酸，C端三肽序列中含有Trp，可能有助于提高ACE的抑制活性[18]，而MINORU等[19]使用蛋白酶S水解裙帶菜蛋白得到的4種活性較高的肽段C端氨基酸均為Trp，為該理論供了證據。

表1 海洋藻類蛋白源ACE IPsTable 1 ACE inhibitory peptides derived from marine algae proteins

注：“—”表示所引文獻的研究中未描述抑制類型。

原料蛋白的一級結構未知性和蛋白酶的酶切位點差異性共同造成了ACE IPs的結構和活性的差異。一般來說，蛋白的水解程度不同，得到的肽段長短、氨基酸組成、排序方式和ACE抑制活性也不盡相同。在SAMARAKOON等[21]的研究中，采用胃蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶分別水解眼點擬微綠球藻蛋白，產物ACE抑制活性從高到低。SHEIH等[22]酶解制備小球藻蛋白源ACE IPs時，胃蛋白酶和堿性蛋白酶的水解產物ACE抑制率高于風味蛋白酶和木瓜蛋白酶。

2.2 復合酶水解法

復合酶水解法制備ACE IPs常采用2種或多種酶酶解，可能會因酶切位點交叉而獲得新的高活性肽段，彌補單酶水解的不足，提高制備效率和肽段質量。采用復合酶解法水解蛋白質時，可同時加入不同蛋白酶進行水解，但酶解條件不同的2種酶共同加入時可能會相互干擾，降低制備效率。雷桂潔等[30]將胰蛋白酶分別組合6種不同蛋白酶同時水解紫菜勻漿，水解效果均明顯弱于胰蛋白酶單獨水解的效果。另外，也可進行順序水解，此時酶的加入順序也會影響蛋白水解度和產物ACE抑制率，且蛋白被水解程度與水解產物ACE抑制活性的強弱并不成正相關。眼點擬微綠球藻蛋白副產物經堿性蛋白酶和胰蛋白酶依次水解后水解度為(64.3±19)%，ACE抑制率為(35.6±3.0)%，而調換兩酶順序后水解度降低至(48.3±0.5)%，但ACE抑制率卻提高至(38.1±1.8)%[31]。這可能是由于堿性蛋白酶是絲氨酸內切酶，肽段經胰蛋白酶作用后，堿性蛋白酶可作用的特異性位點減少了，也可能是堿性蛋白酶將胰蛋白酶酶解產生的有活性的肽段進一步酶解后導致其活性喪失。

3 評價模型

多肽的實際降血壓效果對其是否能作為天然降血壓肽應用于醫藥及保健品行業十分關鍵，因此，有必要對其降血壓效果進行評估測定。目前常用評價方法包括體外化學法、細胞生物法和體內動物實驗法。

3.1 體外化學法

3.1.1 評價原理

ACE IPs的體外活性測定是基于分子水平的評價方式。與Ang Ⅰ結構相似的模擬物能與ACE反應，并生成具有特征吸收峰的馬尿酸(hippuric acid，Hip)或N-(3-[2-呋喃]丙烯)-苯丙氨酸(N-3(2-furyl) acryloyl)-(phenylalanine,FAP)。反應式如下：

馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(N-Hippuryl-His-Leu，HHL)+ ACE→組氨酰-亮氨酸+Hip；

馬尿酰-雙甘肽(Hippuryl-glycine-glycosyl，HGG)+ ACE→甘氨酰-甘氨酸+Hip；

N-(3-[2-呋喃]丙烯)-苯丙氨肽(FAPGG)+ ACE→甘氨酰-甘氨酸+FAP。

基于以上原理，根據Hip或FAP含量變化即可判斷ACE抑制活性的強弱。在酶解蛋白的步驟中，一般以水解度為響應值，以ACE抑制率為指標來考察酶對蛋白的水解效果。但抑制率會受抑制劑濃度的影響而發生變化，因此，在水解產物的分離純化過程中應采用半數抑制濃度(IC50)來準確分析ACE抑制活性。IC50越低表示肽的ACE抑制活性越強。

3.1.2 測定方法

一般采用體外化學法來初步判斷多肽的ACE抑制活性。ACE抑制活性的測定方法主要有分光光度法、高效液相色譜法、毛細管電泳法等，其他方法如薄層色譜法、熒光分光光度法等較為少見。紫外分光光度法由CUSHMAN和CHEUNG等[32]創立，經研究優化后沿用至今。CAO等[29]用分光光度法測定FAP在340 nm波長處的吸光度值，得出龍須菜蛋白源ACE IPs的ACE抑制率IC50為0.255 g/L-1。但分光光度法操作步驟繁瑣、耗時長，且Hip中易混有HHL，容易產生較大誤差。為降低試驗操作要求、提高檢測效率，有學者建立了高效液相色譜法，此方法中降低的Hip或FAP的峰面積百分比可反映ACE抑制率。LIN等[33]采用高效液相色譜法不僅能很好分地離HHL和馬尿酸，還準確得出胃蛋白酶、風味蛋白酶和堿性蛋白酶等酶水解小葉蕨藻蛋白的產物ACE抑制率IC50分別為0.20、29.74和31.71 g/L。長期實踐證明高效液相色譜法靈敏度高、檢測效率高，能定量測定ACE抑制率IC50，但檢測過程中需要重復大量ACE抑制反應，且難以實現高通量和快速篩選大量水解產物的ACE抑制活性。毛細管電泳法能彌補這種不足，且能在較短時間內分析和收集系統數據，實現ACE抑制活性測定和樣品篩選的全自動化。HE等[34]使用4種不同蛋白酶水解12種海洋蛋白材料，采用毛細管電泳法快速測得了48種水解產物的ACE抑制率IC50。

3.2 細胞生物法

以往研究中通過構建人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)或人胚胎肺成纖維細胞系(MRC-5)模型，檢驗ACE IPs的細胞毒性，評估其是否具有用于未來治療高血壓的潛力。一般采用MTT法通過評估線粒體性能預測代謝能力，檢測相對細胞活力，考察ACE抑制肽對人臍靜脈內皮細胞存活率的影響。QIAN等[27]分別用濃度為18.75～150 μmol/L的肽段Leu-Val-Thr-Val-Met處理MRC-5細胞，檢測細胞活力在94.7%～102.4%，存活率高。此外，考慮到NO是血壓的調節劑，其濃度升高可導致血管周圍的平滑肌細胞松弛而降低血壓，且細胞內NO分泌異常時容易引起動脈粥樣硬化的形成，試驗中還會采用硝酸還原酶法檢測細胞培養液中NO的水平，研究ACE IPs對細胞系中NO產生量的影響。若肽段的存在會引起細胞內NO生成量下降或細胞活力下降，則表明該肽段存在細胞毒性。SAMARAKOON等[25]從眼點擬微綠球藻中獲得的ACE IPs可顯著提高HUVECs的NO生產水平，且經不同濃度肽段處理后的細胞存活率都很高。

3.3 體內動物實驗法

在體外環境中被證明具有ACE抑制活性的肽并不一定能在體內環境中發揮實際降血壓作用。經口服攝入后，多肽的生物利用率是影響其體內活性的重要因素，為了使ACE IPs在體內發揮降血壓作用，它們應完整到達作用部位，因此采用體內動物實驗法驗證其在機體內的降血壓活性是十分必要的。一般體內動物實驗法可分為動物試驗法和臨床試驗法。

3.3.1 動物試驗法

天然海藻來源ACE IPs具有良好的臨床應用前景，能否在機體內部發揮實際降血壓功能成為其應用的限制條件，需經過動物和臨床試驗來驗證。動物試驗選擇自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)模型，進行短期或長期給藥試驗。給藥方式包括口服給藥和皮下注射兩種，不同給藥方式實驗組都需要以卡托普利、伊那普利等降壓藥物為陽性對照組，并設置無劑量對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組等實驗組。為檢驗肽對血壓正常的大鼠是否產生不良影響，還應同時對同源正常血壓的京都Wister大鼠(wistar kyoto rats，WKY)進行給藥試驗，試驗包括口服空白組和口服肽組，或皮下注射空白組和皮下注射肽組。通過比較給藥前后不同時間點大鼠血壓(收縮壓)變化情況來評價肽的降血壓功能。在王茵等[35]的動物實驗中，SHR和WKY口服卡托普利后血壓均顯著下降，而紫菜降血壓肽僅對SHR有降壓作用。KO等[18]從橢圓小球藻中制備得到的ACE IPs能明顯降低SHR收縮壓，且降壓活性維持6 h后收縮壓回升至正常水平。利用裙帶菜蛋白源的小肽Tyr-His、Lys-Tyr、Phe-Tyr和Ile-Tyr對SHR喂食(10 mg/(d·kg體重)) 1周后,收縮壓在第1周分別顯著降低了34、26、34和25mmHg，降壓效果均可持續3～8周[36]。

3.3.2 臨床試驗法

只有人類臨床試驗結果才可作為宣稱肽具有實際安全性的證據，基于這一點，ACE IPs在投入降壓藥物的生產應用前必須通過臨床研究來探索其療效程度和劑量范圍，并確認不良反應。探索性試驗和確證性試驗過程中需考慮對肽進行有效性和安全性評價，評價指標包括血壓變化、對靶器官的保護或損傷作用、對心血管并發癥的影響等。另外，合理選擇試驗人群、設計試驗和研究周期、分析聯合用藥情況等都是臨床試驗中需要特別注意的問題。但鑒于臨床試驗開展難度大，且關于海藻來源ACE IPs的活性研究還未成熟，海藻降血壓肽的相關研究還未進入臨床階段。目前已有牦牛乳酪蛋白降血壓肽[37]、大豆低聚肽[38]、醋豆降壓肽[39]等食源性降血壓肽的臨床研究情況已被公布，且目前沒有出現負面報道。

4 展望

海洋藻類富含優質蛋白，其資源未被充分開發和利用，因此有待對海藻資源進行高效利用，并探索海藻蛋白源ACE IPs對ACE活性的抑制原理及其體內消化吸收機制。部分研究者運用分子對接模擬方式來確定食源性ACE IPs在ACE酶的活性位點內的結合方式，預測肽的一級結構并評估ACE IPs活性[40-42]。但分子對接等研究是基于配體連接酶活性位點的競爭性結合機制，非競爭性ACE IPs并不適合該模型，其抑制機制與結構之間的關系尚不清楚。在ACE IPs制備中，酶工程得到了廣泛應用，但由于海洋藻類蛋白的特殊性，導致陸生酶制劑無法高效水解海洋藻類蛋白質，因此需要開發和篩選適用于酶解海洋藻類蛋白的高效蛋白酶原。另外，由于ACE IPs存在分離純化工藝繁瑣、產量低等問題，因此ACE IPs的生產難以形成產業鏈。為解決這一難題，已有學者利用BIOPEP、Pepsite2和PeptideRanker等數據庫，將計算機模擬分析應用于模擬復合酶水解蛋白[25,34]、電子篩選ACE抑制肽和電子模擬肽的消化環境穩定性[35,37]等方面。雖然相關數據庫也需要進一步探索和完善，但計算機模擬方式在ACE IPs的研究中應用前景可觀，可能推動實現ACE IPs的大規模生產進程。