馬氏珠母貝金黃殼色選育群體植核后差異表達免疫基因篩選

王 哲，王姿曼，郝瑞娟，李俊輝，鄧岳文,2

馬氏珠母貝金黃殼色選育群體植核后差異表達免疫基因篩選

王 哲1，王姿曼1，郝瑞娟1，李俊輝1，鄧岳文1,2

（1. 廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088 2. 廣東省珍珠養殖與加工工程技術研究中心，廣東 湛江 524088）

篩選（）金黃殼色選育群體植核后免疫相關基因與代謝通路。利用轉錄組對植核前后馬氏珠母貝的血細胞進行轉錄組建庫及測序分析。分別獲得61.78×106和62.68×106個高質量轉錄組數據，且映射到參考基因組的平均映射率分別為70.16%和67.82%。與植核前相比，植核后分別有2 925個和3 097個基因顯著上調和下調（差異倍數≥2, 校正后≤0.001），其中包括免疫相關基因凝集素、Toll樣受體，熱休克蛋白等。對差異基因進行GO分類分析，分為基因的分子功能、細胞組分、生物過程3個大類，并細分為11個子類別，其中結合和催化功能的基因較多。KEGG分類分析差異基因，可將基因參與的KEGG代謝通路分為6個分支，細胞過程、環境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病（僅限動物）、代謝、有機系統。KEGG富集結果顯示，差異表達基因顯著富集到免疫相關通路胞質DNA感應途徑、白細胞跨內皮遷移等免疫通路。

馬氏珠母貝；金黃殼色選育群體；轉錄組；免疫相關基因

馬氏珠母貝（）是重要的海水育珠貝。在其育珠時需在受體貝體內植入珠核與外套膜小片（供體貝），植入后，外套膜小片與受體貝結締組織形成珍珠囊并分泌珍珠質形成珍珠[1-2]。研究發現，育珠貝的貝齡、植核季節、術前處理方法、術后處理方法和育珠模式等均影響珍珠產生[3-10]。植核過程是一種移植耐受應激反應[1]，對于珍珠的產量和質量有很大影響[11]，但相關機制研究相對較少。

隨著高通量測序技術的發展，對珍珠貝植核免疫反應組學研究漸增[12-13]。雷倩楠[14]利用RNA-seq技術對馬氏珠母貝植核育珠后不同時間血細胞進行轉錄組分析，發現在植核育珠后第10天差異表達基因最多，不同時期差異表達基因包括溶菌酶、清道夫受體、甘露糖受體等。Wang等[12]利用iTRAQ結合LC-MS/MS技術分析馬氏珠母貝植核后0、10、20、30 d的血細胞蛋白，共獲得相關蛋白2 702個，其中與免疫相關的差異蛋白包括纖維蛋白溶酶原、干擾素誘導蛋白、腫瘤壞死因子等。祁曉翔等[15]對三角帆蚌（）植核后不同時期的外套膜和內臟團進行轉錄組分析，篩選出58個與鈣代謝相關的基因。Wei等[13]對植核后0、48 h的馬氏珠母貝血細胞進行轉錄組分析，發現移植后48 h，血細胞中白細胞介素受體和Toll樣受體的表達水平顯著增加，誘導珍珠貝免疫應答反應。Wei等[16]對珠母貝（）同種異體移植組和異種移植組在0、6、12、24、48、72、96 h血細胞進行轉錄組分析，鑒定到諸多與氧化還原反應、MAPK信號通路和凋亡相關的基因。通過分析組學數據，發現與植核相關免疫基因及其調控機理[17-18]，如田榮榮發現，膽堿可免疫調節基因通過調控NF-κB信號通路參與調控機體的免疫反應等[19]。上述研究為深入了解珍珠貝植核免疫耐受機制提供了豐富的基礎資料，但對于不同選育群體免疫耐受機制的研究較少。王哲等[20]研究表明，馬氏珠母貝金黃殼色群體在植核后免疫酶活力較佳，且育珠性狀優于對照養殖群體；另外，研究發現，馬氏珠母貝植核3 d后在血細胞轉錄水平及血清免疫酶活均出現明顯變化[21]。本研究利用轉錄組測序檢測馬氏珠母貝金黃殼色選育群體植核前后差異表達的免疫基因，以期為殼色品系培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

為本課題組選育的金黃殼色第4代群體[22]，貝齡1.5齡，殼長5.5 ~ 6.0 cm。植核手術時，每個受體貝植入1粒規格為5.5 mm珠核。以同批次進行術前處理未植核的個體為對照組，植核3 d后的貝體為實驗組，以2 mL注射器從貝體閉殼肌抽取血淋巴為樣品，以3 500 r/min、4℃條件離心5 min，棄上清，得血細胞，加1 mL Trizol，于液氮中速凍，- 80℃下保存，用于轉錄組測序分析。每3個個體合為一個樣，且每個轉錄組進行3個平行測定。

1.2 RNA 提取及文庫構建

利用Trizol 法對血細胞提取總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳及核酸定量儀（NamoDrop 2000, Therino scientific）檢測RNA的完整性及純度。用帶有OligodT的磁珠富集有polyA尾巴的mRNA；用DNA探針雜交rRNA去除rRNA，RNaseH選擇性消化DNA/RNA雜交鏈，再用DNaseI消化，去除DNA探針，純化后得所需RNA。用打斷buffer把獲得的RNA片段化，用隨機的N6引物進行反轉錄，再合成cDNA二鏈形成雙鏈DNA。把合成的雙鏈DNA末端補平并5′端磷酸化，3′端形成突出一個“A”的黏末端，再連接一個3′端有凸出“T”的鼓泡狀的接頭。連接產物通過特異的引物進行PCR擴增。PCR產物熱變性成單鏈，再用一段橋式引物將單鏈DNA環化，得到單鏈環狀DNA文庫。利用BGISEQ-500進行上機測序。

1.3 轉錄組數據分析

測序所得原始數據稱為原始序列讀數。利用過濾軟件SOAPnuke（v1.5.2）去除包含接頭的序列讀數，去除未知堿基N含量大于5%序列，去除低質量序列 (定義質量值低于10的堿基占該序列總堿基數的比例大于20%的序列為低質量序列)。過濾后獲得干凈序列讀數。利用 HISAT (v2.0.4) 將干凈序列比對到參考基因組序列[23]（http://gigadb.org/dataset/ view/id/100240/File_page/11）。使用Bowtie2 (v2.25) 將干凈序列比對到參考基因序列，對比對結果使用RSEM (v1.2.12) 計算基因和轉錄本的表達水平。

1.4 差異表達基因分析

本研究利用DEGseq方法[24]檢測差異表達基因（Differentially Expressed Gene，DEG）。定義差異倍數為兩倍以上且值≤0.001的基因為顯著差異表達基因。根據GO注釋及分類，將差異基因進行功能分類，并對值進行FDR (False Discovery Rate) 校正，FDR≤0.01視為顯著。根據 KEGG、KEGG PATHWAY注釋結果，將差異基因進行KEGG分類及通路富集分類，同時利用R軟件（phyper函數）進行富集分析，并對值進行FDR校正，FDR≤0.01的通路視為顯著富集。

2 結果

2.1 總RNA質量檢測分析

馬氏珠母貝金黃殼色群體植核前后3 d時的血細胞檢測結果顯示，提取的總RNA經Agilent 2000檢測，每個樣品的濃度均大于200 ng/μL，RIN均大于7.0，檢驗結果為合格（表1），說明RNA 符合建庫要求，可進行轉錄組測序。

表1 植核前后個體RNA檢測結果

2.2 轉錄組數據整體評價

利用BGISEQ-500平臺分別對馬氏珠母貝金黃殼色群體植核前后提取的cDNA進行測序，分別獲得（61.78±0.608）×106和（62.68±0.025）×106的高質量Reads，并映射到馬氏珠母貝基因組（表 2）。轉錄組的質量分析表明，20分別為98.4％、98.23％，30分別為91.34％、91.13％。基因被映射到馬氏珠母貝基因組，植核前轉錄組平均映射率為70.16％，植核后為67.82％（表2）。因此，轉錄組結果的測序質量良好，說明隨后的轉錄組分析結果是可靠的。

2.3 差異表達基因分析

比較馬氏珠母貝金黃殼色群體植核前后的轉錄組數據，在兩組之間鑒定出6 022個差異表達的基因（差異倍數2，校正后≤0.001）。與植核前轉錄組相比，金黃殼色群體植核后有2 925個上調基因和3 097個下調基因。其中包括非特異性免疫相關基因凝集素（CTL）、Toll樣受體（TLR）、補體分子（C1q）、乙酰膽堿受體（nAchR）、應激蛋白熱休克蛋白（HSP70、HSP90）等（表3）。

表2 轉錄組測序數據統計

表3 植核前后轉錄組差異表達部分免疫相關基因

2.4 差異基因的GO和KEGG注釋

差異基因的GO富集分析表明，GO總共有3個分類，分別描述基因的分子功能（molecular function，1 716個）、細胞組分(cellular component，2 616個)、生物過程（biological process，1 913個）。在分子功能類型中包含11個子類別，其中結合（binding，755個）和催化活性（catalytic activity，539個）的基因較多。在細胞組分功能類型中包含16個子類別，細胞（cell，443個）、細胞部分（cell part，430個）、膜（membrane，554個）和膜部分（membrane part，519個）相關基因較多。涉及生物過程功能的差異基因包括25個子類別，主要生命過程是細胞過程（cellular process，542個）、代謝過程（metabolic process，421個）等（圖1）。

根據 KEGG 注釋結果以及分類，將差異基因進行KEGG通路分類分析。將基因參與的KEGG代謝通路分為6個分支：細胞過程（Cellular processes，1 045個)、環境信息處理（Environmental information processing，1 244個）、遺傳信息處理（Genetic information processing，671個）、人類疾病（Human disease，2 844個）（僅限動物）、代謝（Metabolism，1 802個）、有機系統（Organismal systems，2 479個）。在細胞工程中包含4個子類別，其中細胞群落-真核生物（Cellular community-eukaryotes，324個）相關基因較多。環境信息處理包含3個子類別，其中信號傳遞過程（Signaling molecules and interaction，846個）基因較多。遺傳信息處理包括4個子類別，其中折疊、排列和降解過程（Folding, sorting and degradation，221個）的基因較多。疾病包括11個子類別，其中癌癥（Cancer: Overview，651個）、病毒感染（infections diseases: Viral，497個）基因較多。代謝過程包括12個子類別，有機系統包括10個子類別，其中免疫系統（immune system，615個）和內分泌系統（Endocrine system，567個）基因較多（圖2）。

圖1 差異基因GO分類

KEGG數據庫富集結果由R 軟件中的 phyper 函數進行，對金黃殼色群體植核前后差異表達基因進行KEGG通路富集分析，結果顯示，差異表達基因富集到了333條特定的代謝通路，其中前20條顯著富集的代謝通路如圖3，主要包括胞質DNA傳感通路（Cytosolic DNA-sensing pathway）、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝（Cysteine and methionine metabolism）、碳代謝（Carbon metabolism）和白細胞跨內遷移（Leukocyte transendothelial migration）等通路。其中參與先天性免疫的包括胞質DNA傳感通路，白細胞跨內遷移、趨化因子信號通路（Chemokine signaling pathway），Toll 樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）等。

圖2 差異基因KEGG Pathway分類結果

圖3 差異基因KEGG Pathway富集分析

3 討論

在珍珠貝有核珍珠植核育珠過程中，供體貝的外套膜小片及珠核植入受體貝時將引起育珠貝的免疫排斥反應。該過程會導致育珠貝吐核甚至死亡，僅部分育珠貝可適應植核和小片，逐漸形成珍珠囊，分泌珍珠質形成珍珠[1]。因此，研究植核育珠前后基因表達的組學差異，對提高珍珠貝的留核率和降低死亡率有重要意義。本研究比較馬氏珠母貝金黃殼色群體植核前后血細胞的轉錄組變化，從mRNA水平解析植核手術對于育珠貝在基因表達方面的影響。植核前后轉錄組數據分析的質控結果顯示，植核前后轉錄組的20分別為97.85%和97.78%，30分別為90%和89.77%，說明轉錄測序質量較好，滿足后續的分析要求。

比較馬氏珠母貝金黃殼色群體植核前后的轉錄組數據，鑒定出6 101個差異表達基因：植核后有3 432個基因較植核前顯著上調，2 669個基因顯著下調，說明受體貝貝體植核時受到強烈刺激，導致機體大量基因發生變化以應對植核手術，這與雷倩楠[14]的結果相似。雷倩楠[14]對馬氏珠母貝植核后不同時期血細胞轉錄組分析發現，與植核前相比，植核后5、10、15、20、60 d分別有3 345、6 846、4 636、4 167、4 716、6 679個差異基因。對植核前后轉錄組分析獲得的差異表達基因，發現許多與非特異性免疫相關基因，包括凝集素、Toll樣受體、HSP70蛋白等發生顯著變化，說明這些基因在植核后的免疫反應中發揮了作用。

凝集素是一類糖結合蛋白，廣泛存在于雙殼貝類中，并誘導機體摧毀病原物并激活免疫反應[25-29]。Fisher等[26]研究發現，牡蠣、蛤等貝類體內的凝集素可凝集多種脊椎動物的紅細胞。Tunkijjanukij等[30]從馬貽貝（）血淋巴中得到一種可特異性結合脂多糖（LPS）的凝集素，該凝集素經純化后對多種海洋細菌均表現出抗菌活性。C-型凝集素（CTL）作為凝集素的一種，在貝類免疫防御中發揮重要作用，主要功能有促進機體對入侵異物的識別和吞噬，凝集細菌和抵抗病毒感染、防止病原蔓延，激活免疫系統等[31]。本研究中，在植核前后的表達有顯著性差異（差異倍數大于2，且、均小于0.01），進一步表明該基因對貝體受傷后免疫機能的調控作用。

熱休克蛋白參與多種免疫應答及調節細胞凋亡，以應對環境壓力[32]。Gao等[35]發現，在感染弧菌（）6 h后，海灣扇貝（表達水平達到峰值，48 h后恢復到正常水平。Wei等[16]用大珠母貝（）外套膜做小片，對植核后的馬氏珠母貝進行轉錄組測序分析，發現在植核0 ~ 9 h時顯著高表達。Wang等[12]用iTRAQ技術比較馬氏珠母貝植核后4個時期血細胞蛋白變化，發現熱休克蛋白等諸多免疫相關蛋白發生顯著變化以應對植核手術。本研究亦發現，金黃殼色群體植核后3 d，和均發生上調，以應對植核手術對貝體的刺激。

TLR4 可參與植核移植反應，且TLR4高表達出現在植核后2 d[17]。研究發現，馬氏珠母貝Toll-like 受體基因PmTLR6在植核后5和10 d表達水平無顯著性變化，15和20 d表達量呈上升趨勢，于30 d達到最大值，約為空白對照組（0 d）的5倍，說明PmTLR6可能在馬氏珠母貝免疫防御反應中擔任著重要角色[36]。Wei等[13]對植核后不同時期血細胞轉錄組研究發現，TLR在植核后48 h顯著高表達。本研究中，TLR在植核后3 d，多個TLR基因發生上調，參與植核育珠手術后的免疫應答，同時存在一些TLR發生顯著下調，因此TLR基因應對植核手術的具體機制仍需進一步研究。

在雙殼類中，TLR/NF-κB信號通路負責促進免疫應答的信號轉導[37]。TLRs識別配體可激活關鍵轉錄因子并與MyD88相互作用，從而釋放白細胞介素（ILS）、抗菌肽、溶菌酶和其他抗病原體感染的免疫基因。NFκB通路是一種細胞內信號通路，在雙殼類中，MyD88能激活轉錄因子，從而誘導細菌和病毒感染的急性時相反應并控制促炎特性、效應分子和細胞因子的表達[38-40]。本研究中，植核后NF-κB信號通路被顯著富集，并且基因在植核前后差異顯著說明TLR/NF-κB信號通路在植核后免疫反應過程中發揮重要作用。該結果與Wei等[13]的轉錄組分析結果相一致。

4 結語

本研究利用轉錄組對金黃殼色群體植核前后育珠貝的血細胞進行轉錄組分析，發現植核后有2 925個基因顯著上調，有3 097個基因顯著下調，其中包括免疫相關基因凝集素、Toll樣受體、熱休克蛋白等。對差異基因進行KEGG富集分析發現，免疫相關通路細胞DNA傳感途徑，白細胞跨內皮遷移等參與金黃殼色群體的植核育珠免疫反應。本研究為殼色育珠提供參考資料。

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Screening of Immune Related Genes of Yellow Colored Line ofAfter Nucleus Insertion Operation by Transcriptome Analysis

WANG Zhe1, WANG Zi-man1, HAO Rui-juan1, LI Jun-hui1, DENG Yue-wen1,2

（1.,,524088,2.,524088,）

To investigate the immune-related genes and metabolic pathways of yellow colored line ofafter nuclear insertion operation.The cDNAs were used to construct the transciptome for the analyis of the blood cells of the cultivar before and after nucleus insertion operation.61.78 × 106and 62.68 × 106high quality Reads were obtained respectively and the average mapping rates to the reference genome were 70.16% and 67.82%, respectively. Compared with that before nuclear insertion, 2925 and 3097 genes were significantly up-regulated and down-regulated (Fold Change≥2 and Adjustedvalue≤0.001), including immune-related genes, such as lectin, Toll-like receptor, heat shock protein and so on. The differential genes were classified by GO and divided into three categories: molecular function, cell component and biological process. They were subdivided into 11 subcategories, among which there were more genes with binding and catalytic functions. KEGG classification analysis of differential genes showed that genes-involved KEGG metabolic pathway can be divided into six branches: cellular processes, environmental information processing, genetic information processing, and human disease (animals only), metabolism and organismal systems. The results of KEGG enrichment showed that Cytosolic DNA-sensing pathway, Leukocyte transendothelial migration was significantly enriched in immune related pathway.

; Yellow colored line; Transcriptome; immune-related genes

Q78

A

1673-9159（2019）06-0009-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.06.002

2019-03-21

國家貝類產業體系專項（CARS-049）；廣東省科技廳項目（2017A030303076）

王哲（1989―），女，碩士研究生，研究方向為水產無脊椎動物生物學。Email:2262891416@qq.com

鄧岳文（1975―），男，博士，教授，珍珠貝遺傳育種與養殖。Email: dengyw@gdou.edu.cn

王哲，王姿曼，郝瑞娟，等. 馬氏珠母貝金黃殼色選育群體植核后差異表達免疫基因篩選[J]. 廣東海洋大學學報，2019，39（6）：9-16.

（責任編輯：劉慶穎）