自發性高血壓大鼠心肌組織骨形成蛋白和激活素的跨膜抑制劑、轉化生長因子β1表達情況及其與心房顫動易感性的關系研究

梁宇明，何燕

骨形成蛋白和激活素的跨膜抑制劑（BAMBI）是一種高度保守的跨膜蛋白，廣泛存在于心肌細胞，與轉化生長因子β（TGF-β）的表達密切相關。研究表明，BAMBI是TGF-β信號通路的偽受體，可負調節TGF-β信號傳導，進而抑制TGF-β的表達［1］，而TGF-β與器官纖維化關系密切，是公認的器官纖維化治療靶標［2］。VILLAR等［3］研究結果顯示，心臟壓力超負荷患者心臟組織中BAMBI表達水平高于正常人群；動物實驗表明，心臟壓力超負荷小鼠心肌組織中BAMBI表達上調，并可通過抑制TGF-β的表達而調節細胞外基質，維持血流動力學負荷“平衡”，進而保護心臟功能。高血壓可使心臟處于壓力超負荷狀態，導致心肌纖維化，進而增加心房顫動發生風險，BAMBI可通過負調節心肌組織中TGF-β的表達而在一定程度上減輕壓力超負荷狀態下的心肌纖維化［4］。本研究旨在觀察自發性高血壓大鼠心肌組織BAMBI、TGF-β1表達情況，并分析其與心房顫動易感性的關系，以期為高血壓并心房顫動的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2018年8月—2019年4月，選取8只14周齡清潔級Wistar大鼠作為對照組，8只14周齡清潔級自發性高血壓大鼠作為觀察組，體質量300～350 g，均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。兩組大鼠均飼養至22周齡，飼養環境如下：溫度16～25 ℃，每籠4只大鼠，以普通干飼料喂養，不限飲水，光照-黑暗每12 h交替1次。

本研究創新點

精準調控轉化生長因子β（TGF-β）的表達可能降低直接下調TGF-β表達所致不良反應發生率，本研究以TGF-β的負反饋調節因子—心肌組織骨形成蛋白和激活素的跨膜抑制劑（BAMBI）為切入點，初步探討了自發性高血壓大鼠心肌組織BAMBI、TGF-β1表達情況及其與心房顫動易感性的關系研究，有可能成為臨床防治高血壓并心房顫動的新思路。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 無水乙醇和二甲苯（國藥集團化學試劑有限公司生產），檸檬酸（pH值為6.0）抗原修復液、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、蘇木素染液、蘇木素分化液、蘇木素返藍液及DAB顯色試劑（品牌：Servicebio，武漢賽維爾生物科技有限公司生產），BAMBI一抗、TGF-β1一抗及山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（Abcam公司生產）。

1.2.2 主要儀器 智能無創血壓計（北京軟隆生物技術有限公司生產，型號：BP-2010A），生物信號采集儀器（安徽正華生物儀器設備有限公司生產，型號：MD3000），彩色多普勒B超儀（意大利百勝公司生產，型號：MyLabSeven），脫水機（武漢俊杰電子有限公司生產，型號：JJ-12J），包埋機（武漢俊杰電子有限公司生產，型號：JB-P5），病理切片機（上海徠卡儀器有限公司生產，型號：RM2016），脫色搖床（品牌：Servicebio，武漢賽維爾生物科技有限公司生產，型號：TSY-B），渦旋混合器（品牌：Servicebio，武漢賽維爾生物科技有限公司生產，型號：MX-F），免疫組化筆（Gene Tech公司生產，型號：GT1001），顯微鏡（CIC公司生產，型號：XSP-C204）。

1.3 觀察指標

1.3.1 體質量、收縮壓（SBP）及心率 飼養至22周齡時檢測兩組大鼠體質量；采用智能無創血壓計檢測大鼠SBP及心率，檢測時間固定為9:00～14:00，每只大鼠在安靜狀態下檢測3次并取平均值，其中Wistar大鼠SBP≤140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）、自發性高血壓大鼠SBP≥160 mm Hg為滿足實驗要求。

1.3.2 左心結構指標及左心室射血分數（LVEF） 飼養至22周齡時，兩組大鼠均采用10%水合氯醛行腹腔注射誘導麻醉，剔除頸部、胸部毛，采用彩色多普勒B超儀于左胸骨旁取左心長軸和左心室乳頭肌短軸切面檢測左心房前后徑、左心室舒張末期內徑（LVEDD）、左心室收縮末期內徑（LVESD）及LVEF。

1.3.3 心房顫動誘發情況 完成彩色多普勒B超儀檢查后進行心房顫動誘發試驗：取大鼠左側胸部備皮，仰臥位固定于實驗臺，采用MD3000生物信號采集處理系統記錄其Ⅱ導聯心電圖，具體如下：首先將食管電極（頭端設計有2個直徑為1 mm的環狀電極，兩個電極之間間隔2 mm）順著食管方向插入，調搏電極尾端接入生物信號采集處理系統以捕獲食管心電圖；然后將食管電極定位于左心房位置，撤掉電極尾端食管心電圖感應器并接入正負電極夾，連接生物信號采集處理系統并選擇電刺激模式，按下刺激按鈕，采用脈沖波開始起搏大鼠左心房；電刺激參數：脈沖波電壓2 V，電流50 Hz，每次刺激時間為30 s，間隔5 min后行下一次刺激，重復3次。心房顫動誘發成功的標志為大鼠體表心電圖P波消失，代以典型的f波、RR間期不等［5］。

1.3.4 心肌纖維化情況 飼養至22周齡時處死所有大鼠并取出心臟，采用Masson染色法觀察大鼠心肌纖維化情況，具體如下：心臟組織經10%中性甲醛溶液固定后常規石蠟包埋，切片，厚度為4～5 μm，蘇木素染色5～10 min，Masson復合染色5～10 min，苯胺藍液復染5 min，1%冰醋酸水處理1 min，95%乙醇多次脫水，封片。在光學顯微鏡下觀察心肌組織病理學改變，其中藍色部分代表心肌纖維化。

1.3.5 BAMBI、TGF-β1表達情況 將石蠟切片常規脫蠟至水化，采用免疫組化染色法定性、定量觀察心肌組織BAMBI、TGF-β1表達情況，具體如下：（1）抗原修復：采用檸檬酸抗原修復液將切片進行抗原修復，自然冷卻后將玻片置于PBS中并在脫色搖床上晃動洗滌3次，5 min/次；（2）阻斷內源性過氧化物酶：切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min，將玻片置于PBS（pH值為7.4）中并在脫色搖床上晃動洗滌3次，5 min/次；（3）血清封閉；（4）加BAMBI或TGF-β1一抗；（5）加山羊抗兔IgG二抗；（6）加DAB顯示試劑顯色；（7）復染細胞核：蘇木素復染約3 min后自來水沖洗，蘇木素分化液分化數秒后自來水沖洗，蘇木素返藍液返藍后流水沖洗；（8）脫水封片；（9）顯微鏡鏡檢；（10）蘇木素復染，細胞核為藍色，BAMBI、TGF-β1陽性表達為棕黃色。之后采用Image J軟件定量分析心肌組織BAMBI、TGF-β1相對表達量，具體如下：（1）打開需要測量平均光密度的圖片；（2）圖片反色；（3）校正光密度；（4）選擇測量單位；（5）選擇測量項目；（6）選擇測量閾值；（7）點擊Measure進行測量，讀出平均光密度值即為BAMBI、TGF-β1相對表達量。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據處理，體質量、SBP、心率、BAMBI及TGF-β1相對表達量為符合正態分布的計量資料，以（x ±s）表示，采用兩獨立樣本t檢驗；自發性高血壓大鼠心肌組織BAMBI、TGF-β1相對表達量間的相關性分析采用Pearson相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體質量、SBP及心率 兩組大鼠體質量和心率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；觀察組大鼠SBP高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.2 左心結構指標及LVEF 觀察組大鼠左心房前后徑、LVESD大于對照組，LVEF低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組大鼠LVEDD比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表2、圖1）。

表1 兩組大鼠體質量、SBP及心率比較（x±s）Table 1 Comparison of body mass，SBP and heart rate between the two groups

表2 兩組大鼠左心結構指標及LVEF比較（x±s）Table 2 Comparison of indicators of left ventricular structure and LVEF between the two groups

2.3 心房顫動誘發成功率 對照組大鼠心房顫動誘發成功率為37.5%（9/24），觀察組大鼠為70.8%（17/24）；觀察組大鼠心房顫動誘發成功率高于對照組，差異有統計學意義（χ2=5.371，P＜0.05）。原發性高血壓大鼠心房顫動誘發成功心電圖表現見圖2。

2.4 心肌纖維化情況 Masson染色結果顯示，觀察組大鼠心肌纖維化程度重于對照組，見圖3。

圖1 彩色多普勒B超儀檢測結果Figure 1 Color Doppler B-mode ultrasound examination results

圖2 原發性高血壓大鼠心房顫動誘發成功心電圖表現Figure 2 ECG performance in SHR with successful induction of atrial fibrillation

圖3 兩組大鼠心肌組織病理學改變（Masson染色，×200，高清彩圖掃本文OSID碼）Figure 3 Pathological changes of myocardial tissue in the two groups

2.5 BAMBI、TGF-β1相對表達量 觀察組大鼠心肌組織BAMBI、TGF-β1相對表達量高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表3、圖4）。

2.6 相關性分析 Pearson相關分析結果顯示，自發性高血壓大鼠心肌組織BAMBI、TGF-β1相對表達量間無直線相關關系（r=0.185，P=0.661，見圖5）。

表3 兩組大鼠心肌組織BAMBI、TGF-β1相對表達量比較（x±s）Table 3 Comparison of relative expression quantity of BAMBI and TGF-β1 in myocardial tissue between the two groups

圖5 自發性高血壓大鼠心肌組織BAMBI、TGF-β1相對表達量間相關性的散點圖Figure 5 Scatter plot for correlation between relative expression quantity of BAMBI and TGF-β1 in myocardial tissue in SHR

圖4 兩組大鼠心肌組織BAMBI、TGF-β1表達情況（免疫組化染色，×200，高清彩圖掃本文OSID碼）Figure 4 Expressions of BAMBI and TGF-β1 in myocardial tissue in the two groups

3 討論

心房顫動是臨床常見且危害較大的心律失常類型之一，具有較高的病死率［6］。目前國內外研究均表明，高血壓是心房顫動的重要危險因素之一［7-8］；心房顫動可導致缺血性腦卒中發生風險升高5倍［9］，而高血壓繼發的心房顫動可導致心腦血管事件發生風險明顯升高［10］，因此探究高血壓繼發心房顫動的具體機制對高血壓并心房顫動的防治至關重要。

本研究結果顯示，觀察組大鼠左心房前后徑、LVESD大于對照組，心房顫動誘發成功率高于對照組，纖維化程度重于對照組，提示自發性高血壓大鼠心房顫動易感性增加，分析其原因可能如下：高血壓導致心臟長期處于壓力超負荷狀態，左心室心肌肥厚及順應性、舒張功能下降，進而使左心房壓力負荷增加及左心房擴大，壓力負荷持續存在可進一步引起左心房重構尤其是左心房心肌纖維化，而左心房重構是心房顫動的病理基礎，因此左心房纖維化程度越重則心房顫動發生風險越高［11-12］。本研究結果顯示，兩組大鼠LVEF雖均在參考范圍，但觀察組大鼠LVEF低于對照組，提示自發性高血壓大鼠左心室結構改變在一定程度上影響了左心室收縮功能。本研究結果還顯示，兩組大鼠LVEDD比較無統計學差異，提示22周齡自發性高血壓大鼠尚未進展至收縮功能失代償期。

TGF-β是一個分泌型多肽信號分子，屬于TGF-β超家族成員，共包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4及TGF-β5五種亞型［13］。目前在哺乳動物中僅發現TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三種亞型，其中TGF-β1在體細胞系中占比最高、分布最廣泛、生物活性最強［14-15］。既往研究表明，自發性高血壓大鼠左心房組織TGF-β1表達上調［16］；周飛等［17］研究表明，血清TGF-β1水平可預測陣發性心房顫動進展。本研究結果顯示，觀察組大鼠心肌組織TGF-β1相對表達量高于對照組，推測自發性高血壓大鼠血壓持續升高導致心肌組織TGF-β1表達上調，進而促進心肌纖維化、左心房重構并增加心房顫動易感性。

ZHAO等［18］經快速心房起搏構建持續性心房顫動兔模型，結果表明，氯沙坦可通過抑制TGF-β/Smads信號通路而減輕心肌纖維化，降低心房顫動誘發成功率。張飛龍等［16］研究發現，螺內酯可降低自發性高血壓大鼠左心房TGF-β1的表達，減輕心肌纖維化程度，進而降低心房顫動發生率。GIANNETTA等［19］研究發現，西地那非能有效降低糖尿病心肌病患者血TGF-β水平，改善患者左心室收縮功能。因此，通過調控TGF-β1表達而干預心肌纖維化成為近年臨床研究熱點；但BIERIE等［20］研究表明，直接下調TGF-β的表達可引發較多不良反應，分析其原因可能與未精準調控TGF-β的表達有關。

BAMBI是TGF-β的負反饋調節因子，在心臟壓力超負荷狀態下，心肌組織BAMBI表達上調，并通過下調TGF-β1的表達而減輕心肌纖維化，進而保護心臟功能［3］。本研究初步探討了自發性高血壓大鼠心肌組織BAMBI表達情況及其與TGF-β1表達的關系，結果顯示，觀察組大鼠心肌組織BAMBI相對表達量高于對照組，提示自發性高血壓大鼠壓力負荷引起心肌組織TGF-β1表達上調的同時亦上調了BAMBI的表達，但BAMBI可抑制TGF-β1的表達，進而在一定程度上拮抗TGF-β1表達上調所致的心房顫動易感性增加。因此，調控自發性高血壓大鼠心肌組織BAMBI的表達可能實現對TGF-β1表達的精準調控，進而降低心房顫動易感性。

本研究Pearson相關分析結果顯示，自發性高血壓大鼠心肌組織BAMBI和TGF-β1相對表達量間無直線相關關系，分析其原因可能與BAMBI的表達還受到其他因子調控有關。劉鐵成等［21］研究表明，TGF-β1可預測復律后心房顫動恢復情況；但夏時?。?2］研究表明，血清TGF-β1水平對心房顫動射頻消融術后復發的預測價值有限。因此，應進一步尋求對心房顫動預測價值較高的臨床指標。VILLAR等［3］研究表明，壓力超負荷情況下心肌組織BAMBI表達上調，因此其可能較TGF-β1能更敏感地預測心房顫動的發生發展。

綜上所述，22周齡自發性高血壓大鼠心肌組織BAMBI和TGF-β1表達上調，其中TGF-β1表達上調可導致心肌纖維化加重，左心房重構，進而增加心房顫動易感性；而BAMBI表達上調可在一定程度上拮抗自發性高血壓大鼠因TGF-β1表達上調所致心房顫動易感性增加，可能成為臨床防治高血壓并心房顫動的新思路。但本研究未對BAMBI的表達進行干預，下一步將利用病毒轉染技術沉默和過表達BAMBI而探究BAMBI對TGF-β信號通路的影響，以進一步驗證本研究結果結論。

作者貢獻：梁宇明進行文章的構思與設計，研究的實施與可行性分析，數據收集、整理、分析，結果分析與解釋，負責撰寫論文；何燕負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。