香薷乙醇提取物對禽傳染性支氣管炎病毒增殖的影響

(長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025) (長江大學農學院，湖北 荊州 434025)

由禽傳染性支氣管炎病毒(Avianinfectiousbronchitisvirus,IBV)引起的禽傳染性支氣管炎(Avianinfectiousbronchitis,IB)是一種高接觸性、急性的呼吸道傳染病,可導致不同日齡的雞發生不同程度的疾病[1]。IBV基因組RNA轉錄的不連續性以及RNA酶的不完全校對機制，使該病毒易于發生基因突變，導致該病毒的基因型、血清型復雜，各血清型之間僅有部分或者完全沒有交叉保護的作用[2]。因此，給該病的防控帶來了很大的困難，同時會造成養雞產業重大經濟損失[3]。中藥方劑是目前治療IB的重要手段之一。劉振湘[4]、劉鵬飛[5]、王海花等[6]應用中藥方劑治療雞傳染性支氣管炎，結果表明所使用的復方中草藥對于禽傳染性支氣管炎的治療有一定的作用。下面，筆者初步探討了香薷(Elsholtzia ciliata (Thunb.)Hyland.)的體外抗病毒方式，以期為抗IBV的中草藥開發和研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥物的準備

香薷購自湖北省荊州市第一人民醫院中藥房。將購來的香薷磨成粉末狀稱重，用一定體積的80%乙醇靜置浸泡7d以上，再用0.22μm直徑過濾器過濾除菌，樣品4℃保存備用。

1.1.2 供試病毒及細胞

試驗所用病毒為IBV-3ab-luc，是利用反向遺傳學技術在IBV的全基因組序列上采用熒光素酶luciferase的基因序列替代IBV的非功能基因3ab片段，使其能夠成功侵染人類細胞系(H1299)，且其致病力和遺傳穩定性均與IBV相近。該病毒能夠在感染細胞后，在其增殖過程中融合表達熒光素酶。

H1299細胞(人肺癌細胞系)由新加坡南洋理工大學生物學院病毒實驗室贈予。

1.1.3 儀器與試劑

主要試劑：二甲基亞砜(DMSO，天津市天力化學試劑有限公司)、MTT(4,5-二甲基噻唑-2,5二苯基四唑溴化物，北京索萊寶科技有限公司)、TRIZOL(賽默飛世爾科技有限公司)。

主要儀器：熒光檢測器(Promega公司)、PCR儀(BIO-RAD公司)、細胞培養箱(SAN-YONG公司)。

1.1.4 PCR擴增及引物序列

試驗過程中應用的檢測細胞因子表達量引物如表1所示。

表1 RT-PCR引物序列

1.2 試驗方法

1.2.1 香薷乙醇提取物作用于H1299細胞的最大無毒濃度的測定

將所制得的香薷乙醇提取物用80%乙醇作溶劑進行倍比稀釋，得到5個濃度梯度，分別為0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875g/mL。在12孔板中用DMEM培養基培養H1299細胞，當細胞覆蓋達到80%左右時，每孔加入稀釋好的香薷乙醇提取物6μL，每個濃度3個重復，同時設置空白對照，放入細胞培養箱培養。培養24h后，去掉上清，重新加入不含FBS的DMEM培養基1mL，每孔200μL培養基加入20μL MTT，濃度為5mg/mL，放入培養箱中培養。培養4h后，吸出上清液，每孔加入500μL DMSO，待形成的甲臜(Formazan)充分溶解于DMSO后，用酶標儀在550nm波長處測出每孔光密度值。

1.2.2 不同處理方式下香薷乙醇提取物對IBV增殖的影響試驗

病毒感染采用3種方式進行處理。

方式1：在12孔板中培養H1299細胞，待H1299細胞達到80%左右時，再加入實驗測得的最大無毒濃度的香薷乙醇提取物6μL，然后放入培養箱中培養。培養24h后去掉每孔上清，重新加入不含FBS的DMEM培養液1mL，再加入IBV-3ab-luc 100μL感染。感染24h后按照文獻[7]的方法檢測熒光值。

方式2：在12孔板中培養H1299細胞，待細胞覆蓋度達到100%時，去掉上清，加入不含FBS的DMEM培養液1mL，加入100μL IBV-3ab-luc感染細胞，感染16h后，加入最大無毒濃度的香薷乙醇提取物6μL，再進行培養。培養24h后按照文獻[7]的方法檢測熒光值。

方式3：在12孔板中培養H1299細胞，待細胞覆蓋度達到95%以上時，去掉上清，加入不含FBS的DMEM培養液1mL，在EP管中將100μL IBV-3ab-luc與6μL香薷乙醇提取物在室溫環境中充分混合，再進行感染。感染24h后按照文獻[7]的方法檢測熒光值。

每種方式3次重復，同時設置對照組。

將對照組的熒光值與各處理的熒光值的比值(N)的數量級數lgN作為抑制效力參考指標，N值越大表明抑制效力越強[8]。

1)不同濃度的香薷乙醇提取物對IBV增殖的影響 將香薷乙醇提取物用80%乙醇梯度稀釋為0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875g/mL 5個不同的濃度，采用上述方式3進行處理，每組3個重復，感染24h后按文獻[7]的方法檢測熒光值。

2)不同培養時間下香薷乙醇提取物對IBV增殖的影響 在12孔板中培養H1299細胞，待細胞長滿后采用上述方式3進行處理，加入100μL IBV-3ab-luc和6μL 香薷乙醇提取物混合物，做3個重復，設置時間梯度，分別培養4、8、12、16、24h后去除上清，取適量PBS清洗每孔，再加入100μL RLB用槍頭充分刮下細胞后凍融一次并檢測不同培養時間下的熒光值，以反映病毒的增殖情況。每組梯度設置對照，培養不同時間后檢測熒光值。

1.2.3 香薷乙醇提取物對感染IBV的細胞內抗病毒基因表達量的影響試驗

在6孔板中培養H1299細胞，待細胞長滿后，去除上清，加入不含FBS的DMEM培養液2mL，再接入200μL IBV-3ab-luc，37℃培養24h，作為對照。另外一個6孔板上培養H1299細胞，待細胞覆蓋達到95%以上時，去除上清，加入不含FBS的DMEM培養液2mL，采用上述方式3進行處理，在EP管中將100μL IBV-3ab-luc與6μL香薷乙醇提取物在室溫環境中充分混合，再接入200μL IBV-3ab-luc進行感染，在37℃培養箱中培養24h。按照文獻[9]的方法提取總RNA后進行RT-PCR，將PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳并檢測擴增結果。

2 結果與分析

2.1 香薷乙醇提取物作用于H1299細胞的最大無毒濃度的確定

注：CK為未加藥的空白對照; ns表示與對照組比較P>0.05，** 表示P<0.01。 圖1 不同濃度香薷乙醇提取物處理細胞后的光密度

圖1結果表明，當提取物濃度為0.01875、0.0375、0.075、0.15g/mL時，其光密度與對照組相比較差異不顯著(P>0.05)，表明各濃度提取物對細胞生長無抑制作用。當提取物濃度為0.3g/mL其光密度值小于其他提取物濃度的光密度值，且差異顯著(P<0.05)，表明該濃度提取物對細胞的生長存在抑制作用，因此將提取物濃度0.3g/mL確定為香薷乙醇提取物作用于H1299細胞的最大無毒濃度。

2.2 不同處理方式下香薷乙醇提取物對IBV增殖的影響

表2結果表明，3種病毒感染方式下香薷乙醇提取物對病毒增殖都有不同程度的抑制效果。方式1和方式2對病毒增殖有抑制效果，方式3對病毒增殖的抑制效果最顯著。

表2 香薷乙醇提取物不同處理方式下IBV-3ab-luc增殖量的熒光值

注：比值(N)為對照組的熒光值與各處理的熒光值的比值。

2.2.1 不同濃度香薷乙醇提取物對IBV增殖的影響

圖2結果表明，采用方式3處理，當香薰提取物濃度為0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875g/mL時，這5種濃度的藥物對細胞的生長均有顯著抑制作用。藥物濃度越高，檢測到的熒光值越低，說明藥物對病毒的增殖的抑制作用越明顯；反之，檢測到的熒光值越高，說明藥物對病毒的增殖的抑制作用越不明顯。因此，香薷乙醇提取物抑制IBV增殖的效果與其濃度成正相關關系。

2.2.2 不同培養時間下香薷乙醇提取物對IBV增殖的影響

圖3結果表明，采用香薷乙醇提取物與病毒混合感作處理，隨著培養時間的延長，藥物對IBV增殖的抑制效果越顯著，說明香薷乙醇提取物對IBV增殖的抑制作用與作用時間呈正相關關系。

注：CK為未加藥的空白對照;*** 表示與 注: CK為未加藥的空白對照,0.3g/mL代表加藥濃度為 對照組比較,P<0.001。 0.3g/mL。*** 表示與對照組比較， P<0.001。 圖2 不同濃度香薷乙醇提取物處理病毒 圖3 不同培養時間下香薷乙醇提取物處理病毒 感染細胞后IBV-3ab-luc的熒光值 感染細胞后IBV-3ab-luc的熒光值

2.3 香薷乙醇提取物對感染IBV的細胞內抗病毒基因表達量的影響

由圖4和圖5可以看出，在病毒感染方式3下，香薷乙醇提取物能夠促進感染IBV細胞抗病毒基因的表達，從而抑制IBV在細胞內的增殖。

注： 2、5分別為IBV侵染細胞后SOCS3、STAT1的表達；3、6分別為用香薷乙醇提取物處理病毒感染的細胞后，細胞內抗病毒基因SOCS3、STAT1的表達；1、4為陽性對照。圖4 不同處理下的H1299細胞中SOCS3、STAT1的表達

3 討論

傳統疫苗的廣泛使用并未使IB得到有效控制，主要原因是不同基因型或血清型毒株的存在和新變異毒株的不斷出現，而現有的疫苗大多只對同型毒株提供有效的交叉保護而對異型毒株的保護效果差，甚至完全無效。使用化學合成的抗病毒藥物防治IB，在抑制或殺滅病毒時，往往給宿主細胞造成一定程度的損傷，同時還存在易產生耐藥性和發生藥物殘留等缺點。現代醫學證實，許多中草藥不僅具有抑制、消除炎癥的功效，還能有效修復受損組織，發揮鎮痛、解毒之功效，同時有助于機體增強抗應激能力，促進腎上腺皮質活動，強化腦垂體功能，因而可利用中草藥來防治雞傳染性支氣管炎[10]。我國有著豐富的植物資源，藥用植物種類豐富，而現代藥理學研究表明，植物中含有豐富的抗病毒成分，是抗病毒研究的好材料。

注： 2、5分別為IBV侵染細胞后IFN-β、OASL的表達；3、6分別為用香薷乙醇提取物處理病毒感染的細胞后，細胞內抗病毒基因IFN-β、OASL的表達；1、4為陽性對照。 圖5 不同處理下的H1299細胞中IFN-β、OASL的表達

香薷是一種應用較多的中藥，屬唇形科香薷屬的一年生草本植物。其性溫、味辛，具有解熱、消炎、解痙、鎮痛、增強免疫等優良作用[11]。從香薷中提取鑒定的包括揮發油在內的成分，總共達到了100多種，其中主要的化合物成分是黃酮和香豆素[12]。黃酮類化合物具有抗菌抗炎、抗病毒、抗氧化、抗癌以及增強免疫力的作用[13]。應國紅等[14，15]，以乙型肝炎病毒(HBV)為對象，研究發現香薷水提取物對其有明顯的抑制作用，后來通過應用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)的方法，又發現其對乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)也有明顯的抑制作用。本研究發現香薷乙醇提取物的3種處理方式均能對IBV在細胞內的增殖起到一定的抑制作用，以香薷乙醇提取物與病毒混合感作后加入對IBV的抑制效果最明顯。濃度梯度試驗結果表明，香薷乙醇提取物對IBV的抑制效果與其濃度成正比，濃度越高，對抑制IBV增殖的效果越明顯。時間梯度試驗結果表明，藥物對IBV增殖的抑制效果有一定的時間依賴性，隨之藥物處理時間的增加，對IBV的抑制效果越明顯。

IBV感染細胞后會誘導產生抗體，同時也會激活細胞毒T細胞介導的細胞免疫應答，IBV也可通過調控多條信號通道促進病毒的復制，從而引起免疫逃避作用[16,17]。為了進一步了解香薷抗IBV的作用機制，本研究通過RT-PCR的方法，檢測了香薷乙醇提取物處理IBV感染的細胞后3種抗病毒基因SOCS3、OASL、STAT1的表達量，與對照組相比，使用香薷乙醇提取物處理感染IBV的細胞后，細胞內抗病毒基因SOCS3、OASL、STAT1的表達量均有提升。SOCS3、OASL、STAT1為干擾素信號轉導過程中重要的細胞因子。干擾素是一類糖蛋白，它具有高度的種屬特異性，具有抗病毒、調節免疫及抗腫瘤作用，在宿主抗病毒應答中具有重要作用，它能夠激活細胞中多種信號傳導途徑，從而發揮各種生物學功能，其中JAK-STAT途徑為抗病毒過程中最主要的途徑，它還可通過調節宿主獲得性免疫功能，間接清除病毒[18]。本研究結果說明香薷乙醇提取物可以通過調控干擾素途徑，增強抗病毒免疫反應，從而抑制病毒的增殖。香薷的成分比較復雜，且不同的有效成分會作用于不同的靶點和不同的環節從而產生多種藥理作用，但香薷對IBV的抑制作用是其中具體哪一種或哪幾種有效成分發揮抗病毒作用以及如何發揮抗病毒作用，還有待進一步研究。