不同比例n-6和n-3多不飽和脂肪酸調控NT-proBNP和hFABP保護急性心肌梗死后的心肌損傷

呂珩　鮑麗剛

[摘要] 目的 探討不同比例的n-6和n-3多不飽和脂肪酸對急性心肌梗死大鼠心肌細胞的保護作用。 方法 采用連續注射異丙基腎上腺素的方法構建急性心梗大鼠模型。通過酶聯免疫法檢測大鼠血清中NT-proBNP、hFABP和cTnI的水平;TTC和TUNEL染色評估心肌梗死面積和心肌細胞凋亡程度。Western blot和QPCR檢測心梗標記基因和凋亡因子的表達。通過向心臟注射干擾NT-proBNP、hFABP、cTnI的慢病毒，進一步檢測AMI心肌細胞的凋亡情況。 結果 日糧中添加n-6/n-3多不飽和脂肪酸比例1∶5和1∶10導致AMI大鼠在心梗發生后0、4、8和12 h的NT-proBNP、hFABP和cTnI水平、心梗面積和心肌細胞凋亡均明顯低于基礎日糧飼喂的AMI大鼠;且1∶10比例的n-6/n-3多不飽和脂肪酸抑制效果最為明顯。干擾AMI大鼠心肌NT-proBNP和hFABP導致cTnI、Bax表達降低，Bcl-2表達升高。 結論 日糧添加1∶10比例的n-6/n-3多不飽和脂肪酸能有效緩解急性心肌梗死的發生，且NT-proBNP和hFABP的表達水平是參與心梗后心肌細胞凋亡的重要因子。

[關鍵詞] n-6多不飽和脂肪酸;n-3多不飽和脂肪酸;急性心肌梗死;細胞凋亡

[中圖分類號] R542.22 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2019）25-0042-06

Different ratios of n-6 and n-3 polyunsaturated fatty acids regulating NT-proBNP and hFABP to protect myocardial injury after acute myocardial infarction

LV Heng ? BAO Ligang

Department of Cardiology， Zhejiang Provincal Tongde Hospital， Hangzhou ? 310000， China

[Abstract] Objective To investigate the protective effects of different proportions of n-6 and n-3 polyunsaturated fatty acids on cardiomyocytes in rats with acute myocardial infarction. Methods Acute myocardial infarction rat modelswere constructed by continuous injection of isoproterenol. The levels of NT-proBNP， hFABP and cTnI in rat serum were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）. The myocardial infarct size and cardiomyocyte apoptosis were assessed by TTC and TUNEL staining. Western blot and QPCR were used to detect the expression of myocardial infarction marker gene and apoptotic factor. Apoptosis of AMI cardiomyocytes was further detected by injecting a lentivirus that interferes with NT-proBNP， hFABP， and cTnI into the heart. Results When dietary supplementation of n-6/n-3 polyunsaturated fatty acids was 1：5 and 1：10， the NT-proBNP， hFABP， cTnI levels， infarction size， and myocardial apoptosis were significantly lower than those of basal diet-fed AMI rats at 0， 4， 8 and 12 h after myocardial infarction， and the 1：10 ratio of n-6/n-3 polyunsaturated fatty acids was the most effective. Interfering with myocardial NT-proBNP and hFABP in AMI rats resulted in decreased expression of cTnI and Bax， and increased expression of Bcl-2. Conclusion Dietary supplementation of 1：10 ratio of n-6/n-3 polyunsaturated fatty acids can effectively alleviate the occurrence of acute myocardial infarction， and the expression levels of NT-proBNP and hFABP are important factors involved in cardiomyocyte apoptosis after myocardial infarction.

[Key words] n-6 polyunsaturated fatty acid; n-3 polyunsaturated fatty acid; Acute myocardial infarction; Apoptosis

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是冠狀動脈急性、持續性缺血缺氧所引起的心肌壞死，伴有血清心肌酶活性增高及進行性心電圖變化，可并發心律失常、休克或心力衰竭，常可危及生命。盡管早期溶栓、經皮冠狀動脈介入治療和冠狀動脈旁路移植術能夠降低AMI的死亡率[1，2]，但存活者仍不可避免地經歷由氧化應激和心肌細胞凋亡介導的左心室重構[3-7]，因此抑制心肌的氧化應激反應或心肌細胞的凋亡進程對緩解AMI發生后左心室重構和心肌損傷非常重要。

膳食調節是治療心血管疾病的重要方式之一，臨床研究發現膳食中補充n-3多不飽和脂肪酸（n-3 PUFA）對心肌梗死、心律失常等心血管疾病的防治有著顯著效果[8-12]。n-3多不飽和脂肪酸作為輔助治療，在心肌梗死后3個月能夠顯著降低原發性綜合征（死亡、非致命性心肌梗死和非致命性卒中）和次要臨床終點（全因死亡率、心臟猝死、心血管死亡）的風險[13]。生物體內的n-3多不飽和脂肪酸（n-3 PUFA）能夠與n-6多不飽和脂肪酸（n-6 PUFA）相互作用，并競爭或協同地調節生物學進程。大部分由n-3脂肪酸形成的二十碳烷類化合物具有抗炎癥作用，而由n-6脂肪酸衍生的二十碳烷類化合物則能夠促炎癥反應[14-16]。因此，平衡膳食中n-6/n-3 PUFA的比例對防治心血管疾病中的作用可能比單純攝入n-3 PUFA更為重要。

本研究發現急性心肌梗死大鼠的膳食中添加比例為1∶5和1∶10的n-6/n-3 PUFA能夠顯著降低血清中心肌梗死標志物NT-proBNP、hFABP和cTnI的水平，減少梗死面積，并抑制心肌細胞凋亡的發生，且日糧中n-6/n-3 PUFA比例1∶10的效果最為明顯，證明膳食中添加1∶10比例n-6/n-3 PUFA對治療急性心肌梗死和保護心梗后的心肌細胞有著良好效果，這為臨床上急性心肌梗死的防治提供一定的理論依據。

1 資料與方法

1.1一般材料

健康成年雄性SD大鼠40只，鼠齡7周左右，體重200～250 g，購自廣州賽業生物公司。鹽酸異丙基腎上腺素注射液（規格：2 mg/支）和戊巴比妥鈉（規格：5 mg/支）購自上海禾豐制藥公司。三苯基四氮唑（TTC）購自美國Sigma公司。兔抗大鼠NT-proBNP、hFABP、cTnI、Bcl-2、Bax和GAPDH抗體購自proteintech公司，RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天公司，ECL顯色液購自Thermo公司，RNA提取試劑盒和逆轉錄cDNA試劑盒購自promega公司，干擾NT-proBNP、hFABP、cTnI的慢病毒載體及其陰性對照購自上海吉瑪公司，細胞凋亡檢測試劑盒夠自Roche公司，酶聯免疫試劑盒購自日本Hitachi公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與處理 ?將40只大鼠隨機分為四組，每組10只，分別為假手術組（sham）、急性心肌梗死組（AMI）、n-6/n-3比例1∶5的AMI組和n-6/n-3比例1∶10的AMI組。制備模型前，各組大鼠均飼養2周，其中sham組以基礎日糧飼喂，AMI組大鼠的日糧中添加不同比例的玉米油、亞麻籽油、橄欖油和黃油，以保證n-6和n-3多不飽和脂肪酸的比例為1∶5和1∶10，四種油的比重見表1。

表1 ? 四種油在混合油中的不同比例（%）

1.2.2 動物模型制備 ?采用15 mg/kg的鹽酸異丙基腎上腺素注射大鼠腹腔，連續注射2 d后制成急性心肌梗死大鼠模型（AMI），假手術組（sham）注射等量生理鹽水。

1.2.3 血流動力學檢測 ?制備成功后采用3%的戊巴比妥鈉麻醉sham組和AMI組大鼠，并切開氣管，將左心室腔與壓力換能器和生物信號采集與處理系統連接，并導入血流動力學檢測系統，記錄左心室壓力（LVP），分別獲取左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張末壓（LVEDP）、頸總動脈收縮壓（SBP）和舒張壓（DBP）檢測結果，同時將LVP電信號同步輸入微分器，計算 LVP上升和下降的最大速率（±dp/dtmax）。

1.2.4 酶聯免疫法檢測AMI各指標 ?AMI造模成功后，每隔4 h抽取大鼠靜脈血，放置4℃冰箱1 h后，3000 rmp離心3～5 min以分離血清。分離后的血清采用酶聯免疫試劑盒檢測心梗后的各項指標：N端前腦鈉肽（NT-proBNP）、心型脂肪酸結合蛋白（hFABP）和心肌肌鈣蛋白（cTnI）的水平。

1.2.5 HE染色 ?取AMI大鼠心臟組織，經4%多聚甲醛固定24 h、流水沖洗24 h后脫水和切片。采用二甲苯脫蠟，經乙醇梯度水化，采用蘇木素染色和0.5%鹽酸酒精分色，后經梯度乙醇和二甲苯脫水后封片和鏡下觀察。

1.2.6 心臟梗死面積檢測 ?用三苯基四氮唑（TTC）染色法測定AMI大鼠的梗死面積。大鼠處死后摘除心臟，并切成1.0 mm的厚截面。將切片與1% TTC在37℃磷酸鹽溶液中混合孵育10 min后，用Image-Pro Plus 6.0軟件測定梗死組織的面積（TTC陰性染色面積）。

1.2.7 TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡 ?取假手術組和AMI組大鼠心肌梗死后12 h的心肌組織，放入4%多聚甲醛固定24 h后制做冰凍切片。檢測前，將組織切片置于染色缸中，用二甲苯洗2次，每次5 min。用無水乙醇洗2次，每次3 min。用95%和75%乙醇各洗1次，每次3 min。PBS洗5 min后加入蛋白酶K溶液（20 μg/mL），于室溫水解15 min，去除組織蛋白。用蒸餾水洗4次，每次2 min。采用TUNEL法檢測心臟組織的細胞凋亡過程，定量結果采用TUNEL陽性心肌細胞核占總細胞核的百分比表示。

1.2.8 實時定量QPCR檢測 ?采用promega公司的RNA小提試劑盒提取各組大鼠心臟組織的總RNA。將提取的總RNA逆轉錄成cDNA后，熒光定量PCR檢測NT-proBNP、hFABP、cTnI、Bcl-2、Bax的表達水平。各檢測基因的QPCR引物見表2。QPCR結果采用2-△△Ct法計算相對表達量。

表2 ? 實時定量QPCR引物

1.2.9 Western blot檢測 ?各組大鼠于梗死后的12 h處死，于冰上取出心臟組織約100 mg，加入RIPA蛋白裂解液并研磨至液態，至4℃離心機以12000 rpm離心10 min，吸取上清加入4倍體積的SDS loading buffer，混勻后放入100℃水浴5 min。取30 μg的蛋白裂解液加入8% SDS-PAGE凝膠中分別以60 V和100 V電壓進行蛋白濃縮和分離，然后轉至PVDF膜，以10%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入抗體，4℃過夜孵育后，ECL發光液顯色。

1.2.10 大鼠心臟組織的慢病毒注射 ?采用1 mL注射器向大鼠心梗組織處分別注射500 μL干擾NT-proBNP、hFABP和cTnI的慢病毒載體，注射3 d后，提取心梗組織的RNA和蛋白，檢測NT-proBNP、hFABP、cTnI及凋亡相關因子Bcl-2和Bax的表達水平。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 6.05軟件統計分析實驗數據，單因素方差分析One-Way ANOVA和Student's t檢驗進行差異比較分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 急性心肌梗死大鼠模型的建立及鑒定

異丙腎上腺素連續注射2 d后，檢測AMI組和sham組大鼠得到血流動力學和心梗各項指標的變化。如表3、4所示，AMI大鼠的左心室收縮壓（LVSP）、頸總動脈收縮壓（SBP）和舒張壓（DBP）以及LVP上升和下降最大速率±dp/dtmax較sham組明顯降低，左心室舒張末壓（LVEDP）和心率則明顯升高（P<0.01）;心梗的3項指標NT-proBNP、hFABP和cTnI在AMI大鼠血清中的水平明顯高于sham組（P<0.01）;HE染色顯示sham組大鼠心肌細胞呈梭形、纖維狀、規則排列，而梗死心肌細胞腫脹、排列紊亂，出現斷裂，部分斷裂心肌細胞間隙見炎癥細胞浸潤， TTC染色可見紅色的正常心肌和呈白色的梗死心肌部位，見封三圖1。

表4 ? 急性心肌梗死大鼠血清中各項指標檢測（x±s）

注：與假手術組（sham）比較，**P<0.01

2.2 四組大鼠不同比例的n-6和n-3多不飽和脂肪酸對心梗NT-proBNP、hFABP和cTnI水平比較

基于hFABP是心梗的早期標志物，心梗發生的24 h之后會回復至正常水平，而NT-proBNP和cTnI在心梗發生后的0～12 h處于上升階段且12～24 h能達到高峰[17-20]，因此抽取大鼠心梗后0～12 h的血液檢測血清中NT-proBNP、hFABP和cTnI的變化水平，結果發現心梗發生后的0、4、8和12 h，這3項指標在以基礎日糧飼喂的AMI大鼠血清中的水平明顯高于假手術組（P<0.01），而日糧中添加n-6和n-3多不飽和脂肪酸比例為1∶5和1∶10的AMI大鼠，其NT-proBNP、hFABP和cTnI水平則明顯低于AMI組，其中多不飽和脂肪酸添加比例為1∶10的AMI大鼠的這3項指標降低更明顯，見表5～7。TTC染色四組大鼠并計算梗死面積，結果顯示日糧中添加1∶5和1∶10比例的n-6和n-3多不飽和脂肪酸導致AMI大鼠心肌梗死面積明顯小于基礎日糧飼喂的AMI大鼠，且添加比例為1∶10的AMI大鼠的梗死面積最小（P<0.01），見表8。

2.3 四組大鼠不同比例的n-6和n-3多不飽和脂肪酸對心梗后心肌細胞凋亡及心肌中NT-proBNP、hFABP和cTnI表達的比較

以上實驗數據表明n-6和n-3多不飽和脂肪酸能夠緩解AMI大鼠的心肌梗死癥狀，為證實其對梗死心肌的保護作用，采用TUNEL染色檢測AMI大鼠心肌細胞的凋亡情況。結果顯示，心梗發生后以基礎日糧飼喂的AMI大鼠心肌細胞的凋亡數目明顯高于sham組，而日糧中添加1∶5和1∶10比例的n-6和n-3多不飽和脂肪酸導致AMI大鼠心肌細胞凋亡個數明顯少于基礎日糧飼喂的AMI大鼠，且添加比例為1∶10的AMI大鼠的細胞凋亡數最少（P<0.01），見封三圖2a和表9。Western blot和QPCR實驗檢測心肌中NT-proBNP、hFABP和cTnI以及凋亡相關因子Bcl-2和Bax的表達，結果顯示AMI大鼠心肌組織中NT-proBNP、hFABP、cTnI和Bax的表達水平明顯高于假手術組，而Bcl-2的表達則明顯低于假手術組（P<0.01），證明心梗導致的NT-proBNP、hFABP、cTnI水平升高伴隨著心肌細胞凋亡進程。相比基礎日糧飼喂的AMI組大鼠，日糧中添加n-6和n-3多不飽和脂肪酸能夠明顯降低AMI大鼠的NT-proBNP、hFABP、cTnI、Bax的表達和升高Bcl-2的表達，表明n-6和n-3多不飽和脂肪酸對心肌細胞凋亡的抑制作用;其中，與日糧中n-6和n-3多不飽和脂肪酸添加比例1∶5的AMI大鼠相比，添加比例1∶10導致AMI大鼠心肌組織中NT-proBNP、hFABP、cTnI、Bax的表達降低和Bcl-2表達升高的更為顯著，表明日糧中n-3多不飽和脂肪酸的比例增加能夠更進一步降低心梗大鼠心肌中NT-proBNP、hFABP、cTnI的表達和抑制心肌凋亡過程，以保護受損的心肌組織，見封三圖2b和表10。

2.4 四組大鼠NT-proBNP和hFABP對心肌細胞凋亡的比較

以上實驗數據提示心梗大鼠的心肌細胞中NT-proBNP、hFABP和cTnI的表達可能與細胞凋亡進程相關。本實驗通過向AMI大鼠心臟組織注射穩定干擾NT-proBNP、hFABP和cTnI的慢病毒載體，并采用Western blot和QPCR技術檢測NT-proBNP、hFABP和cTnI的表達對凋亡因子的影響。結果發現，干擾NT-proBNP、hFABP和cTnI均會抑制Bax和提高Bcl-2的表達（P<0.01），表明NT-proBNP、hFABP和cTnI是心肌細胞凋亡的上游調節因子;干擾NT-proBNP、hFABP亦會抑制cTnI的表達（P<0.01），而干擾cTnI則對NT-proBNP和hFABP的表達無影響，表明NT-proBNP、hFABP和cTnI參與心肌梗死引起的細胞凋亡途徑，而NT-proBNP、hFABP能夠調節cTnI的表達，提示NT-proBNP和hFABP是參與心肌梗死引起的細胞凋亡途徑的主要因子。見封三圖3及表11。

3 討論

n-3和n-6多不飽和脂肪酸均與降低心血管疾病風險密切相關，飲食中的n-3多不飽和脂肪酸多來源于魚類和一些植物，而n-6多不飽和脂肪酸則主要來源于植物油和堅果。研究發現，降低n-6和n-3多不飽和脂肪酸的比例能夠減少血清中膽固醇含量，比例低于1：1更有利于心血管疾病患者抗炎、抗氧化應激和增強脂質代謝等[21-24]。本研究通過對急性心肌梗死（AMI）大鼠飼喂不同比例的n-6和n-3多不飽和脂肪酸和檢測血清中心梗指標的變化，發現1∶5和1∶10比例的n-6和n-3多不飽和脂肪酸能夠有效降低急性心肌梗死（AMI）大鼠血清中NT-proBNP、hFABP、cTnI的水平以及減少心機梗死面積，表明低比例的n-6和n-3多不飽和脂肪具有減輕急性心梗的功效。

心肌細胞凋亡是急性心肌梗死發生早期細胞丟失的主要原因之一，高鳳蘭[25]發現冠心病心臟性猝死患者的梗死心肌細胞凋亡受到Bcl-2和Bax的共同調節;成伶俐[26]構建家兔急性心肌梗死模型，并發現Bcl-2陽性表達的心肌細胞個數與細胞凋亡個數呈負相關，Bax陽性表達的心肌細胞個數則與細胞凋亡數呈負相關，其機制可能是Bcl-2與Bax結合形成異源二聚體，從而終止凋亡進程。本研究通過TUNEL染色發現AMI大鼠的心肌細胞凋亡指數明顯高于sham組，而日糧中添加1∶5和1∶10比例的n-6和n-3多不飽和脂肪酸能夠減輕AMI大鼠心肌細胞的凋亡程度，且1：10比例的n-6和n-3多不飽和脂肪酸效果最為明顯。進一步通過QPCR和Western blot證實低比例的n-6和n-3多不飽和脂肪酸能夠提高凋亡抑制因子Bcl-2和抑制凋亡促進因子Bax在AMI大鼠心肌中的表達水平，這些結果表明低比例的n-6和n-3多不飽和脂肪酸能夠通過抑制心肌細胞凋亡途徑從而減輕AMI大鼠的急性心梗。

研究發現，hFABP是影響胚胎癌細胞凋亡及線粒體損傷的主要因子[27]，cTnI是檢測心肌細胞凋亡的特異性標志物[28]，提示hFABP 和cTnI作為心梗標記物不僅能夠監測心梗發生，亦是參與細胞凋亡途徑的重要因子。Deng J等[29]發現BNP預處理心肌缺血大鼠能夠抑制因缺血再灌注導致的心肌細胞凋亡，而與BNP同為心梗標記物的NT-proBNP，其對于急性心肌梗死后細胞凋亡的影響卻鮮少報道。本研究發現AMI大鼠血清和心臟組織中NT-proBNP、hFABP、cTnI的水平均明顯高于sham組，而n-6和n-3多不飽和脂肪酸在抑制AMI大鼠心肌細胞凋亡同時也降低了NT-proBNP、hFABP、cTnI在心臟中的表達，表明三者的表達水平可能與心肌細胞凋亡的發生密切相關。為此，本研究采用向AMI大鼠心臟組織注射干擾NT-proBNP、hFABP、cTnI的慢病毒載體，并通過QPCR和western blot檢測凋亡相關因子的表達，結果發現干擾NT-proBNP、hFABP、cTnI均能導致Bcl-2表達升高和Bax表達降低，而干擾NT-proBNP和hFABP能夠抑制cTnI的表達，cTnI的干擾則對NT-proBNP和hFABP的表達水平無明顯影響，表明NT-proBNP和hFABP可能作為上游因子參與急性心梗后的心肌細胞凋亡過程。

綜上所述，本研究發現日糧中低比例的n-6和n-3多不飽和脂肪酸能夠明顯降低NT-proBNP、hFABP、cTnI在血清和心臟組織中的水平并抑制心肌細胞凋亡，進而減輕急性心梗后的心肌細胞損傷。

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（收稿日期：2018-09-27）