PD-L1分子的表達與卵巢漿液性腺癌患者發(fā)病風險及臨床預后關系的研究

劉霞 蔡云朗

1.東南大學，江蘇南京 210000；2.泰州市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇泰州 225300；3.東南大學附屬中大醫(yī)院，江蘇南京 210009

卵巢漿液性腺癌(HGSOC)是上皮性卵巢癌(EOC)的主要組織學亞型。其是一個預后差的腫瘤，5年生存率約40%，這是由于診斷時已是晚期以及產(chǎn)生對化療的耐藥性[1]。近年來，研究[2]報道，腫瘤組織的微環(huán)境中具有大量腫瘤相關巨噬細胞（TAM），其在介導腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸方面具有重要作用。同時，TAM在細胞表型上與巨噬細胞 （M2）相似且高表達CD68分子，因此CD68分子的表達對判斷腫瘤患者發(fā)病風險和預后具有一定指導作用。程序性死亡1(PD-1)通路已經(jīng)成為腫瘤中的強大免疫調(diào)節(jié)機制。通過對其研究可以更加清楚地了解它的生理調(diào)節(jié)作用、預后意義和治療潛力。最近幾項研究顯示，由于PD-L1在腫瘤細胞上的表達與腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）的相互作用在腫瘤微環(huán)境中對患者預后有顯著影響[3]。因此，該研究2010年1月—2017年6月期間選擇49例經(jīng)手術切除的原發(fā)性HGSOC標本，并進行臨床病理特征、預后及預測相關性方面研究。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集于泰州市人民醫(yī)院婦科就診的卵巢漿液性腺癌患者49例，卵巢良性疾病患者8例。依據(jù)病史、體格檢查、影像學檢查、術中所見及術后病理結果確定診斷。卵巢漿液性腺癌患者年齡平均為51.8歲，中位年齡50歲。8例卵巢良性患者年齡平均為41歲，中位年齡42歲。所有病例術前均未接受放療、化療和激素治療。

1.2 免疫組織化學法

采用免疫組織化學法檢測卵巢癌和良性組織中PD-L1、CD68分子的表達水平。所有手術切除標本經(jīng)4%福爾馬林固定，石蠟包埋，3～4 μm連續(xù)切片。方法如下：石蠟切片，65℃烤片1 h，脫蠟，檸檬酸組織修復液高壓熱修復2 min，PBS沖洗 5 min 3次；3%H2O2室溫孵育5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min 2次。5%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10 min，傾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1 h。PBS沖洗，5 min 3次。滴加適量生物素標記二抗工作液，37℃孵育30min。PBS沖洗，5 min 3次。滴加適量DAB顯色劑，鏡下觀察，顯色3～10 min，即用自來水沖洗終止顯色，脫水，透明，封片。

1.3 實驗結果判定

應用日本奧林巴斯電子顯微鏡進行圖像采集。目的細胞出現(xiàn)棕黃色或是黃褐色顆粒為陽性染色，PDL1染色判斷：顯微鏡下觀察每個樣本，隨機選擇5～6個高倍視野。從每個樣本的染色強度和染色陽性的腫瘤細胞比例進行評估。染色強度分為：0（陰性），1（弱陽性），2（中等陽性），3（強陽性），共 4 個級別，最終評級標準：0（陰性），+（1～2），++（3～4）和+++（5～7）。統(tǒng)計學分析時，0不表達，+低表達，++中表達，+++高表達。CD68染色結果判斷，方法同上。

1.4 隨訪

對所有患者進行隨機回訪，隨訪0.2～8年，隨訪時間中位數(shù)是4年，截止時間為2018年6月。評價復發(fā)的指標為無疾病進展生存時間（PFS），即手術切除病灶后復查時出現(xiàn)卵巢癌腫瘤標記物 CA125升高、影像學檢查異常、腹水等復發(fā)指征；評價生存預后的指標為總生存時間（OS），即從手術切除病灶后至死亡的時間。如患者未及時復診則予以書信、電話通知。

1.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，PDL1分子和CD68分子與臨床病理參數(shù)的相關關系使用Chi-square檢驗進行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CD68分子在卵巢癌和良性組織中的表達情況

CD68在良性組織中表達如圖1，CD68分子幾乎不表達；CD68分子在腫瘤組織中表達，其中低表達16例、中表達和高表達33例。

選取3張CD68分子在腫瘤細胞上表達的圖片如圖 2、3、4，分別是：低表達、中表達和高表達。

圖1 陰性

圖2 低陽性

圖3 中陽性

圖4 強陽性

2.2 PD-L1分子在卵巢癌和良性組織中的表達情況

PD-L1分子在良性組織中表達如圖5，PD-L1分子不表達；PD-L1分子在腫瘤組織中表達，其中陰性表達及低表達35例、中表達和高表達14例。選取兩張PD-L1分子在腫瘤細胞上表達的圖片如圖6、7，分別是：低表達和中表達。

圖5 陰性

圖6 弱陽性

圖7 中陽性

2.3 PD-L1分子與腫瘤患者預后生存年數(shù)的關系

PD-L1分子表達與腫瘤患者預后生存年數(shù)呈負相關（P＜0.05），如圖 8。

圖8 PD-L1分子與患者生存年數(shù)之間的關系

3 討論

卵巢惡性腫瘤又稱卵巢癌，是女性生殖器官常見的腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第3位。但因卵巢癌致死率高，卻占各類婦科腫瘤的首位，對婦女生命造成嚴重威脅。近些年流行病學統(tǒng)計顯示其發(fā)病率及死亡率均呈上升和年輕化趨勢[4]。盡管手術及化療等治療手段不斷改進，但5年生存率僅從37%上升至46%，雖然早期卵巢癌患者的生存率會大大得到提升，然而做到早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷卻難以實現(xiàn)，其原因主要包括：疾病的發(fā)生、發(fā)展機制及病因尚不清楚；缺乏特異性的腫瘤標記物；相關免疫學和分子生物學機制研究尚未完善等[5-6]。近年來，由于醫(yī)學的發(fā)展和研究的深入，人們對卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程有了全新的認識。大量的研究[7]表明，機體的免疫調(diào)節(jié)在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。包括免疫細胞的凋亡、免疫活性物質(zhì)的分泌異常、炎癥因子的分泌異常、免疫細胞的功能失調(diào)等，從而誘發(fā)卵巢癌的進一步的發(fā)展[8]。

PD-L1分子和CD68分子作為免疫細胞表達分子在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中起著重要作用。PDL1是大小為40kD的跨膜蛋白，其在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達均可被調(diào)控。在轉(zhuǎn)錄水平，細胞信號中的PI3K因子和STAT3轉(zhuǎn)錄因子的活化均對PD-L1分子的轉(zhuǎn)錄起著關鍵作用。NF-κB是PD-L1啟動子中的重要元件，因此通過作用NF-κB可以起到抑制PD-L1表達的作用。在翻譯水平，PTEN基因的改變導致下游相關基因發(fā)生變化進而改變PD-L1分子的翻譯。 該研究結果顯示，CD68分子和PD-L1分子在卵巢癌組織中的表達率和表達強度明顯強于卵巢良性組織，因此，說明了卵巢癌中腫瘤相關巨噬細胞的高表達以及PD-L1分子的表達在卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展中承擔著重要的作用。同時，該研究發(fā)現(xiàn)PD-L1分子的表達與卵巢癌患者預后生存年數(shù)呈負相關，因此，說明了PD-L1分子的表達在卵巢癌預后及生存方面起著重要的作用。目前已有文獻報道了CD68和PD-L1等相關分子在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，但是相關具體的分子機制尚未清楚，因此，針對CD68和PD-L1分子的作用還需要更深入的研究。

綜上所述，根據(jù)PD-L1分子在卵巢癌中的表達及預后生存的關系，提示該分子的表達可以作為判斷卵巢漿液性腺癌患者發(fā)病風險及臨床預后的重要指標。