c-Myc基因在櫛孔扇貝年周期發育性腺中的表達特征?

楊丹丹， 鄧 春， 楊乾坤， 秦貞奎， 張志峰

(中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003)

c-Myc(cell-Myc)是一種原癌基因，屬于骨髓細胞瘤癌基因(myelocytomatosisviraloncogene，Myc)家族成員。該家族蛋白的羧基端均具有高度保守的螺旋-轉角-螺旋(helix-turn-helix，HLH)和亮氨酸拉鏈(leucine zipper，LZ)組成的結構域[1-2]。在人(Homosapiens)和小鼠(Musmusculus)中，c-MYC作為重要的轉錄因子在促進細胞增殖、抑制細胞分化和調控腫瘤發生中發揮作用[1，3]。c-MYC通過調節細胞周期中G1/S的過渡促進細胞增殖，并且高水平的c-MYC可間接拮抗細胞周期抑制因子的活性來激活細胞周期[4-5]。正常細胞中，c-Myc通常呈低水平表達；當生物體內的細胞發生染色體轉位、基因重排或擴增時會引起DNA損傷，此時c-Myc基因將被激活，其編碼的蛋白高水平合成，并導致腫瘤的形成[6-7]。此外，c-MYC更是一種誘導性多能干細胞的重編程因子[8]，具有促進染色體解聚，加快細胞增殖，抑制細胞衰老的作用[9-10]。

性腺發育及配子發生是生命繁衍的基礎，其受多種因素的精密調控，涉及眾多基因的有序參與。c-Myc基因在性腺發育中的研究，目前僅見在文昌雞(Gallusgallus)中的報道，發現其參與調控文昌雞的卵巢早期發育及成熟過程[11]。在貝類中，已有報道揭示c-Myc具有廣泛的組織分布特點[12-16]，并以性腺中的表達水平最高[14-15]。然而，其在貝類性腺中的細胞學定位和相關功能，迄今尚不清楚。本研究以重要經濟貝類——櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)為研究對象，采用RACE技術克隆其全長cDNA序列，采用定量PCR技術，分析其在櫛孔扇貝不同發育時期性腺中的表達動力學特征，原位雜交和免疫組織化學手段，揭示了c-MycmRNA及其蛋白在其配子發生過程中的細胞學定位。研究旨在為開展櫛孔扇貝c-Myc基因的功能及探究貝類性腺發育及配子發生相關過程的分子機制提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

櫛孔扇貝購自青島臺東南山市場，產地為青島沙子口。將不同季節購買的二齡性成熟的櫛孔扇貝在實驗室中暫養3 d后，選取活力良好的個體(殼高(63.9±4.1) mm)，解剖取其性腺，剔除其中的消化管并剪成小塊。一部分在液氮中速凍后置于-80 ℃ 冰箱中保存，用于總RNA提取；另一部分使用4%多聚甲醛(溶于0.01 mol/L的 PBS 中，pH=7.4)4 ℃ 固定 22 h，于梯度甲醇(25%、50%、75%和無水甲醇，0.01 mol/L PBS 配制，pH=7.4)中脫水后， 置于-30 ℃ 冰箱中保存，用于原位雜交及免疫組織化學實驗。

按照廖承義等[17]、Liu等[18]所描述的櫛孔扇貝性腺組織學特征，將櫛孔扇貝性腺劃分為4個發育時期，休止期、增殖期、生長期和成熟期。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA提取和RACE cDNA第一鏈合成 采用異硫氰酸胍法提取櫛孔扇貝成熟期精巢的總RNA，使用RNase-free DNase I消除基因組DNA，紫外光分光光度計和1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量。使用SMARTTM-RACE cDNA Amplification Kit(Clontech，美國)并按照操作指南合成RACE cDNA第一鏈。

1.2.2 目的片段全長cDNA克隆及序列分析 根據櫛孔扇貝轉錄組(NCBI Sequence Read Archive數據庫序列號： SRX218546，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRX218546/)c-MyccDNA序列片段設計RACE特異引物，5’RACE：GTTGAGTC CGTTTGCCCCCCTCACA和3’RACE：GTACGCG GGGAGACTT GCGAAGTGG。以成熟期精巢cDNA為模板，用SMARTTM-RACE cDNA Amplification Kit(Clontech，美國)分別進行5’-和3’-RACE擴增。PCR產物經電泳檢測、連接到pMD18-T載體后，轉化到大腸桿菌DH5ɑ中，挑取單菌落，送往華大基因進行測序。

使用SeqMan軟件將5’-RACE和3’-RACE片段進行拼接，最終獲得櫛孔扇貝c-Myc全長cDNA序列。使用NCBI中BLAST功能程序分析目的蛋白序列與其他物種c-MYC蛋白序列的一致性。使用Clustal X 2.0和DNAMAN軟件對櫛孔扇貝c-Myc基因所編碼的氨基酸序列與其他12個物種已知的c-MYC氨基酸序列進行多序列比對。使用MEGA 6.0.6軟件對櫛孔扇貝c-MYC氨基酸序列與其它12個已知物種的c-MYC氨基酸序列以鄰位相接法(Neighbor Joining，NJ)構建進化樹，設置bootstrap為1 000。

1.2.3 qRT-PCR 按1.2.1的方法提取櫛孔扇貝各時期精巢及卵巢總RNA并制備cDNA模板。按照qRT-PCR實驗的MIQE指南[19]進行實驗，依據櫛孔扇貝c-Myc cDNA 全長序列設計一對特異性引物，qRT-S 5’-GGACCACCGACACCACCAG -3’ 和 qRT-A 5’-ATTTCCAGACCACATACAA-3’，擴增片段長度為206 bp(+221～+427，轉錄起始位點為+1)。以Zhou等[20]報道的櫛孔扇貝elongation factor 1 alpha (ef-1α)作為內參基因，引物為 qRT-S 5’-GAAAGCGACAGACAAGCCAC-3’ 和qRT-A 5’-GGTAAGTTCATCAGAGCGAGCA-3’。使用SYBR Premix Ex Taq kit試劑盒(大連，中國)和Roche LightCycler 480熒光定量PCR儀(Roche，瑞士)按照操作指南進行實驗。熒光定量PCR 反應條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個循環。每組設置3個生物樣本重復，每個樣本設置3個實驗重復，所得數據采用2-ΔΔct法進行分析。所有數據表示為平均值±標準誤，使用SPSS Statistic 軟件(version 18.0)中的單因素方差分析(One-Way ANOVA)和 Tukey’s HSD檢驗法進行統計分析，顯著性差異水平設為P<0.05。

1.2.4 原位雜交 根據櫛孔扇貝c-Myc全長cDNA序列設計一對引物，PCR擴增獲得了515 bp的探針序列(+2 063～+2 577)。反向引物Probe-AS：ATTTAGGTGACACTATAGAAGCG GGCAGCTTGTGGTCATTTT(下劃線為SP6啟動子序列)，正向引物Probe-S：TAATACGACTCACTATAGGGAGACA GTTGGTCTGTTAGGCATTT(下劃線為T7啟動子序列)，以成熟期精巢cDNA為模板，PCR擴增條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環；72 ℃ 5 min。回收擴增產物，并按照1.2.2的方法進行測序驗證。使用DIG RNA Labeling kit(Roche，瑞士)并按照操作指南進行體外轉錄，獲得c-MycDIG標記的RNA正義和反義探針。

取保存在甲醇中的性腺組織，常規石蠟切片法制備性腺切片，成熟期精巢切片厚度為4 μm，其余時期精巢及各時期卵巢切片為5 μm。使用c-Myc地高辛標記的正義和反義探針，按照劉曉玲[21]的方法并稍加改動進行組織原位雜交，其中蛋白酶K(2 μg/mL，37 ℃)消化10 min，1%中性紅復染。Nikon E80i 顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5免疫組織化學 根據櫛孔扇貝c-Myc全長cDNA序列設計一對引物，用以擴增其開放閱讀框(open reading frame，ORF)序列。正向引物ORF-S：GGATCCATGGTTGTACGGACGTCA(下劃線為BamHI酶切位點)，反向引物ORF-AS：CTCGAGAAAATCCCTAACTTGAAG(下劃線為XhoI酶切位點)，以櫛孔扇貝成熟期精巢cDNA為模板進行PCR擴增(94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環；72 ℃ 5 min)。將擴增產物回收后，按照1.2.2的方法進行測序驗證。將含有目的基因ORF序列的pMD-18T載體與pET-28a表達載體分別用BamHI和XhoI進行雙酶切，回收酶切產物后連接、轉化到BL21表達菌中，37 ℃倒置培養過夜。次日按照1∶100接種擴大培養，當OD值在600 nm波長下達到0.5時，加入1 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)誘導表達8 h，收集總蛋白。用8 mol/L的尿素溶解包涵體蛋白并用鎳柱純化重組蛋白，將純化后的蛋白送往上海生工制備兔抗c-MYC多克隆抗體。

通過Western blot檢測c-MYC多克隆抗體的有效性和特異性。使用動物組織蛋白提取試劑盒(CoWin，中國)提取成熟期櫛孔扇貝精巢的總蛋白，SDS-PAGE電泳后，按照正極-3層濾紙-PVDF膜-SDS-PAGE膠-3層濾紙-負極的順序依次將其放入轉膜儀(BIO-RAD，美國)中22 V電壓下轉膜20 min。按照1∶1 000的比例將c-MYC多克隆抗體稀釋于5%脫脂奶粉中，4 ℃孵育過夜，再用HRP標記的羊抗兔IgG抗體室溫孵育2 h，使用DAB顯色試劑盒(Roche，瑞士)顯色3～5 min，于凝膠成像系統中觀察并拍照。

按1.2.4的方法制備組織切片。使用制備的c-MYC蛋白的多克隆抗體，按照Ma等[22]的方法進行免疫組織化學實驗，蘇木精復染。Nikon E80i 顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果

2.1 櫛孔扇貝c-Myc全長cDNA及其序列特征

本文獲得的櫛孔扇貝c-MyccDNA全長為2 943 bp(GenBank序列號：KY765899.1)，其中開放閱讀框為1 194 bp，共編碼397個氨基酸；5’非翻譯區為103 bp，3’ 非翻譯區為1 646 bp，含有24 bp的poly(A)尾巴。BLAST分析結果顯示，櫛孔扇貝c-MYC氨基酸序列與已知的其他物種c-MYC序列均有同源性，其中與蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)一致性最高，為97%，與太平洋牡蠣(Crassostreagigas)的一致性為50%，與合浦珠母貝(Pinctadafucata)的一致性為48%，但與脊椎動物的一致性較低，例如與非洲爪蟾(Xenopuslaevis)和人(H.sapiens)的一致性均為29%。多序列比對結果顯示，該預測蛋白序列既具有MYC家族所特有的保守結構域，包括羧基末端的螺旋轉角螺旋結構域(HLH)和亮氨酸拉鏈(LZ)，同時還具有c-MYC蛋白所特有的Myc-N轉錄激活區(見圖2A)。根據系統進化樹可知，櫛孔扇貝的c-MYC蛋白首先與蝦夷扇貝、合浦珠母貝和太平洋牡蠣聚為一枝，進而與囊舌蟲(Saccoglossuskowalevskii)等作為無脊椎動物聚為一類，最后與脊椎動物聚類。櫛孔扇貝c-MYC的系統進化與經典的物種進化地位基本一致(見圖2B)。

2.2 c-Myc在櫛孔扇貝年周期發育性腺中的相對表達量分析

qRT-PCR結果表明，櫛孔扇貝c-Myc在性腺的整個年周期發育過程中均有一定水平的表達(見圖1)。在卵巢中，c-MycmRNA在休止期的水平較低，隨著性腺的發育和成熟，其表達量逐漸升高；成熟期卵巢中的c-MycmRNA水平約為休止期的2.5倍(P<0.05)。在精巢中，休止期的c-MycmRNA水平最低；發育至增殖期，其水平顯著提升至休止期的1.5倍(P<0.05)，之后，在生長期的精巢中維持該表達水平；至成熟期精巢其表達水平顯著低于增殖期和生長期(P<0.05)，但略高于休止期精巢的表達水平(見圖1)。此外，c-MycmRNA水平在生長期和成熟期的精巢和卵巢中具有顯著性差異(P<0.05)，尤其是成熟期，卵巢中的表達水平約為精巢的2倍；但在休止期和增殖期的兩性性腺中，其表達水平無顯著差異。

(所有數據均為平均值±標準誤(n=3)；休止期精巢中的c-Myc mRNA水平設為標準1，其它數值均為與其的倍數表示。不同字母表示各組數據間存在顯著性差異(P<0.05)。Data are indicated as the mean±SEM from three independent samples which are detected in duplicate. The expression level in the testes at resting stage is set as 1.00 to calibrate the relative levels in gonads at other stages. Different letters indicate significant differences from each other (P<0.05).)

2.3 櫛孔扇貝c-Myc mRNA和c-MYC蛋白在性腺中的細胞定位

原位雜交結果顯示，櫛孔扇貝c-MycmRNA在不同發育時期的精巢和卵巢中均檢測到陽性信號(見圖3 A～H和圖4 A～H)。在精巢中，c-MycmRNA主要在精原細胞和精母細胞中表達，在精細胞及成熟精子中未見陽性信號(見圖3 A～H)。在卵巢中，該陽性信號主要定位在卵原細胞和各期卵母細胞中(見圖4 A～H)。

(Myc-N結構域、HLH結構域和LZ結構域分別用方框標記。Myc-N-box, HLH box and LZ box are boxed.)

Western blot結果顯示，櫛孔扇貝重組c-MYC蛋白制備的多克隆抗體在成熟期精巢中檢測出一條特異性條帶，其分子量與櫛孔扇貝c-MYC蛋白的理論值(45 kDa)大小基本一致(見圖3 I)。使用重組c-MYC蛋白制備的多克隆抗體(見圖3 I)進行免疫組織化學檢測，結果顯示櫛孔扇貝c-MYC蛋白在不同發育時期性腺中的細胞學定位(見圖3 J～P和圖4 I～P)與原位雜交結果基本一致(見圖3 A～H和圖4 A～H)。

(A～G.反義探針的原位雜交，其中藍色為陽性信號； A.休止期；B.增殖期；D.生長期；F.成熟期；C、E和G分別為B、D和F的局部放大圖；H.正義探針的原位雜交(陰性對照)。I.Western blot檢測在櫛孔扇貝成熟期精巢提取物中出現一條特異條帶(箭頭所示)；Mar.蛋白marker；1.一抗為c-MYC蛋白多克隆抗體；2.陰性對照，一抗為免疫前血清。J～P、c-MYC多克隆抗體的免疫組織化學，其中棕色為陽性信號；J.休止期；K.增殖期；M.生長期；O.成熟期； L和N分別為K和M的局部放大圖；P.免疫前血清的免疫組織化學(陰性對照)。Sg.精原細胞；Sc.精母細胞；St.精細胞；Sz.成熟精子。標尺：μm。A～G. in situ hybridization with the antisense probe, positive signals are indicated in blue; A. resting stage; B. proliferative stage; D. growing stage; F. mature stage; C, E and G. the magnified images of B, D and F, respectively; H. in situ hybridization with sense probe (negative control). I. The specific band as shown with the arrow was detected in testis extracts by Western blot. Mar. Protein molecular weight marker; 1. the first antibody is anti-c-MYC polyclonal antibody; 2. negative control, the first antibody is preimmune serum. The arrow indicates the target band. J～P. immunohistochemistry with anti-c-MYC polyclonal antibody, positive signals are indicated in brown; J. resting stage; K. proliferative stage; M. growing stage; O. mature stage; L and N. the magnified images of K and M, respectively; P. immunohistochemistry with preimmunue serum (negative control). Sg. spermatogonium; Sc. spermatocyte; St. spermatid; Sz. spermatozoon. Scalar bar, μm.)

(A～G，反義探針的原位雜交，其中藍色為陽性信號； A：休止期；B：增殖期；D：生長期；F：成熟期；C、E和G分別為B、D和F的局部放大圖；H，正義探針的原位雜交(陰性對照)。I-P，c-MYC多克隆抗體的免疫組織化學，其中棕色為陽性信號；I，休止期；K，增殖期；M，生長期；O，成熟期；J、L和N分別為I、K和M的局部放大圖；P，免疫前血清的免疫組織化學(陰性對照)。Og：卵原細胞；Oc：卵母細胞；MO：成熟卵。標尺：μm。A～G, in situ hybridization with the antisense probe, positive signals are indicated in blue; A, resting stage; B, proliferative stage; D, growing stage; F, mature stage; C, E and G, the magnified images of B, D and F, respectively; H, in situ hybridization with sense probe (negative control). I-P, immunohistochemistry with anti-c-MYC polyclonal antibody, positive signals are indicated in brown; I, resting stage; K, proliferative stage; M, growing stage; O, mature stage; J, L and N, the magnified images of I, K and M, respectively; P, immunohistochemistry with preimmunue serum (negative control). Og, oogonium; Oc, oocyte; MO, mature oocyte. Scalar bar, μm.)

3 討論

本文通過RACE技術獲得櫛孔扇貝c-MyccDNA全長，共2 943 bp，其中ORF 1 194 bp。在該序列所推導的氨基酸序列中含有Myc家族保守的位于羧基末端的螺旋轉角螺旋結構域(HLH)和亮氨酸拉鏈(LZ)[1-2]，同時還具有c-MYC蛋白所特有的Myc-N轉錄激活區[1]。同源對比結果顯示，櫛孔扇貝c-MYC蛋白與無脊椎動物c-MYC蛋白具有較高的一致性。初步確定本研究所獲得的序列為櫛孔扇貝c-MyccDNA全長。

貝類種類繁多，生殖方式多樣，既有雌雄異體(櫛孔扇貝)也有雌雄同體(海灣扇貝)，一些物種(牡蠣等)甚至具有性逆轉特征[23]，因此研究其性腺發育、性別分化和配子發生相關基因，對于揭示其多樣的生殖方式形成機制是十分重要的。本研究采用定量PCR、原位雜交和免疫組織化學技術，確定c-Myc在櫛孔扇貝不同發育時期精巢和卵巢中均有明顯的表達(見圖2～4)。櫛孔扇貝c-MycmRNA的水平在成熟期前的精巢和卵巢中均隨著性腺發育的進程逐漸升高，但其在成熟期精巢和卵巢中的表達則呈顯著性差異，即卵巢中的表達水平顯著高于精巢(見圖2)。韓威等[11]采用qRT-PCR檢測了文昌雞母雞個體早期發育和性成熟過程中卵巢c-Myc的表達，結果顯示其在個體發育早期的卵巢(11～12周齡)中表達水平顯著高于個體性成熟啟動時期的卵巢(13周齡)(P<0.05)，后者僅為12周齡的20%。隨著卵巢發育成熟至開產期(15周齡)時，卵巢中的c-Myc表達量顯著提高(P<0.05)，并且隨著發育的進行，其表達量顯著高于個體發育早期卵巢中的表達水平(P<0.05)，這一表達特征與櫛孔扇貝不同。由于當前有關c-Myc在動物性腺發育過程中的表達特征僅見文昌雞中的報道，因此這種表達特征的規律性尚有待更多的研究數據才能定論。

在櫛孔扇貝精巢中，c-MycmRNA和c-MYC蛋白明顯的陽性信號均定位在精原細胞和精母細胞中，而在精細胞及成熟精子中未見陽性信號(見圖3)。這種差異的細胞學定位，可能暗示c-Myc基因在精子發生過程中發揮作用。在小鼠的成纖維細胞和胚胎干細胞以及人的B細胞和骨髓細胞中，研究者發現c-MYC可以通過調節細胞周期中G1/S的過渡以加速細胞增殖，并且高水平的c-MYC可間接拮抗細胞周期抑制因子p21和p27的活性，從而激活細胞周期[4-5, 24]。Wang等[25]通過在體內和體外分別敲降乳腺癌細胞中的c-MycmRNA水平，發現該細胞的增殖減緩，細胞的生長率降低50%～60%。在動物的精子發生過程中，細胞增殖主要發生在精原細胞和精母細胞中，即精原細胞通過增殖產生更多的精原細胞；初級精母細胞通過第一次減數分裂產生次級精母細胞，后者再進行一次分裂產生2個精細胞，精細胞不再分裂而直接分化為精子。根據本研究中c-Myc基因在精巢中的細胞定位特點，我們推測其可能參與櫛孔扇貝精子發生過程中的細胞增殖調控。然而，對于c-Myc基因在櫛孔扇貝卵巢中廣泛表達的意義，我們尚無法解釋，有待進一步的研究和闡釋。