對比液態(tài)氟碳脂質納米粒與全氟丙烷脂質微泡體外顯影及耐聲壓性

劉瑩瑩,徐金鋒*,謝明星,張 麗,覃小娟,項飛翔,丁 楠,楊 暢,項光亞

(1.暨南大學第二臨床醫(yī)學院 深圳市人民醫(yī)院超聲科 深圳市超聲醫(yī)學工程中心,廣東 深圳 518020；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院超聲影像診斷科 湖北省分子影像重點實驗室，湖北 武漢 430022； 3.華中科技大學同濟醫(yī)學院藥學院,湖北 武漢 430022)

分子影像學的發(fā)展給包括超聲在內的醫(yī)學影像學帶來巨大變革，也對超聲造影劑提出了更高要求。本研究嘗試制備一種脂質外膜包裹的以液態(tài)氟碳(PFOB)為核心的全新微粒型超聲造影劑，并制備同等脂質膜成分的全氟丙烷(C3F8)內核的微泡型超聲造影劑，比較二者在粒徑、電位，耐聲壓性及顯影模式等方面的異同。

1.1 制備生物素化PFOB脂質納米粒造影劑 以拉丁方設計進行優(yōu)化，通過以下步驟完成造影劑制備：①采用電子天平(Mettler-Toledo公司)按摩爾質量85∶5∶5∶5比例稱取二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dipalmitoyl phosphatidylcholine， DPPC)、生物素化磷脂酰乙醇胺(biotinyl phosphatidyl ethanolamine， Biotinyl PE)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(dipalmitoyl phosphatidylglycerole， PPPG)及膽固醇(cholesterol， CH)；DPPC為脂質外膜基本成分，Biotinyl PE為后續(xù)進行親和素橋連修飾提供連接位點，DPPG帶負電荷可調節(jié)納米粒表面電位，CH用以調節(jié)脂質外膜流動性；將試劑置于圓底燒瓶中，移至通風櫥內，于燒瓶內加入15～20 ml氯仿與甲醇混合溶液(體積比3∶1)，溶解直至澄清；②將燒瓶置于旋轉蒸發(fā)儀上，抽真空蒸發(fā)2 h(調節(jié)水浴溫度為30℃，轉速40 rot/min)，形成均勻薄膜；③稱取磷酸二氫鉀(KH2PO4)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)，加入去離子水配成0.1 g/mol的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline， PBS)，采用精密pH計(上海精科雷磁儀器廠)將pH值調節(jié)至7.0；④稱取20 ml PBS加入蒸干成膜的圓底燒瓶內，置于旋轉蒸發(fā)儀上，水化1 h(調節(jié)水浴溫度為55℃，轉速60 rot/min)，得到乳白色母液；⑤將母液移至燒杯中，以高速分散均質機(上海標本模型廠)攪拌，同時逐滴加入0.2 ml PFOB；⑥將所得混懸液置于水浴超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)中，超聲處理1 min；⑦將200 nm聚碳酸酯濾膜裝入脂質體擠出器，置于配套水浴鍋中，調節(jié)水浴溫度為55℃；將超聲處理后的母液加入脂質體擠出器內，連接氮氣瓶，打開氣壓閥門，壓力范圍穩(wěn)定在0.5～1.0 MPa，進行過膜處理，重復3次，得到生物素化PFOB脂質納米粒造影劑。

1.2 制備生物素化C3F8脂質微泡造影劑 前6步制備過程同前，步驟⑦時將超聲處理后母液加入注射器內，并將超聲細胞破碎儀(Misonix公司)探頭(頻率20 kHz，功率150 W)置于液面下1.5 cm，同時抽取氟碳氣體50 ml；于聲振過程中經(jīng)三通管由注射器底部緩慢推注氣體。選擇間斷模式，輸出功率為110 W，聲振3 s，停2 s，重復3次，得到生物素化C3F8脂質微泡造影劑。

1.3 基本理化性質測定及穩(wěn)定性評估 取適量生物素化PFOB脂質納米粒、C3F8脂質微泡，稀釋10倍后[濃度分別為(2.07±0.56)×109/ml和(3.79±0.82)×108/ml]于光學顯微鏡(Olympus公司)或透射電子顯微鏡(FEI公司)下觀察其形態(tài)，以激光粒度分析儀(Malvern公司)測定其粒徑及表面電位。加入親和素后再次觀察2種造影劑形態(tài)改變并測定其粒徑。

穩(wěn)定性評估：分別于制備后即刻及常溫下將PFOB脂質納米粒及C3F8脂質微泡放置1、3、6、12、24、48 h后抽取樣品，以血細胞計數(shù)板計算其濃度。

1.4 造影劑體外顯影效果觀察 將適量生物素化PFOB脂質納米粒、C3F8脂質微泡分別稀釋10倍后(濃度同前)置于10 ml EP管內備用。采用Siemens Acuson Sequoia 512彩色超聲診斷儀，15L8w-s高頻探頭(頻率10～14 MHz)，選擇Small Part模式、基波成像，觀察2種造影劑樣本顯影情況并采集圖像；加入0.5 mg親和素后再次觀察其顯影效果并采集圖像。

1.5 測定造影劑耐聲壓性 取生物素化PFOB脂質納米粒、C3F8脂質微泡分別稀釋10倍(濃度同前)后置于10 ml EP管內， 加入0.5 mg親和素后備用。采用Siemens Acuson Sequoia 512彩色超聲診斷儀，15L8w-s高頻探頭(頻率10～14 MHz)，調節(jié)探頭輸出功率，分別在機械指數(shù)(mechanical index， MI)0.28和0.56水平進行超聲輻照，于輻照前及輻照10、20、30 s后觀察顯影情況有無變化，采集圖像；將原始圖像轉化為JPG及AVI格式，刻錄至光盤保存。

采用Metlab 7.8軟件分析采集到的JPG圖像，將ROI設定為EP管內造影劑所在區(qū)域，測算其平均灰度值(gray scale， GS)。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 15.0軟件。計量資料以±s表示，計數(shù)資料以百分率表示。采用獨立樣本t檢驗比較2種造影劑，以配對t檢驗比較同一造影劑加入親和素前后差異；同一造影劑多個時間點間比較采用重復測量方差分析，組內進一步兩兩比較采用Bonferroni法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基本理化性質測定及加入親和素前后比較 電子顯微鏡下觀察，加入親和素前，生物素化PFOB脂質納米粒分散度良好(圖1A)，表面電位為(-43.70±7.17)mV，粒徑(173.30±48.81)nm(圖1B)；加入親和素后納米粒聚集成團(圖1C)，粒徑(1026.00±142.7)nm(圖1D)，較前明顯增大(t=-9.243,P<0.001)。光學顯微鏡下觀察，生物素化C3F8脂質微泡加入親和素前分散度良好(圖1E)，表面電位為(-13.00±5.99)mV，粒徑(868.50±126.40)nm(圖1F)；加入親和素后微泡發(fā)生聚集(圖1G)，粒徑(1446.00±221.20)nm(圖1H)，較前明顯增大(t=-6.597,P=0.003)。加入親和素前(t=16.225，P<0.001)、后(t=-5.046，P<0.001)2種造影劑間粒徑差異均有統(tǒng)計學意義。

圖1 生物素化PFOB脂質納米粒、C3F8脂質微泡加入親和素前后理化性質 A、B.生物素化PFOB脂質納米粒加入親和素前電子顯微鏡下可見粒徑均勻，分散度好(A)，粒徑分布圖示平均粒徑為173.30 nm(B)； C、D.生物素化PFOB脂質納米粒加入親和素后電子顯微鏡下可見納米粒聚集成團(C)，粒徑分布圖示平均粒徑為1026.00 nm(D)； E、F.生物素化C3F8脂質微泡加入親和素前光學顯微鏡下可見粒徑均勻，分散度好(E)，粒徑分布圖示平均粒徑為868.50 nm(F)； G、H.生物素化C3F8脂質微泡加入親和素后光學顯微鏡下可見微泡間出現(xiàn)聚集現(xiàn)象(G)，粒徑分布圖示平均粒徑為1446.00 nm(H)

圖2 PFOB脂質納米粒與C3F8脂質微泡體外穩(wěn)定性比較 A.PFOB脂質納米粒造影劑濃度隨時間變化情況； B.C3F8脂質微泡造影劑濃度隨時間變化情況 (*表示與制備后即刻比較，P<0.05)

圖3 生物素化PFOB脂質納米粒加入親和素前后CEUS表現(xiàn) A、B.生物素化PFOB脂質納米粒加入親和素前顯示為無回聲(A)，加入親和素后回聲明顯增強，顯示為密集細小的點狀強回聲(B)； C、D.生物素化C3F8脂質微泡加入親和素前顯示為密集細小點狀強回聲(C)，加入親和素后未見明顯變化，仍顯示為密集細小點狀強回聲(D)

2.2 造影劑穩(wěn)定性比較 監(jiān)測結果顯示，PFOB脂質微粒在整個觀察期間內濃度無明顯改變(圖2A)；C3F8脂質微泡制備后隨放置時間延長濃度呈減低趨勢(P<0.05)，放置6 h及以內濃度較尚未發(fā)生明顯改變，而放置12、24、48 h后濃度均較制備后即刻明顯減低(P均<0.05，圖2B)。

2.3 體外顯影效果比較 生物素化PFOB脂質納米粒加入親和素前回聲信號極低，接近無回聲(圖3A)；加入親和素后回聲明顯增強，呈密集細小的點狀強回聲(圖3B)。生物素化C3F8脂質微泡加入親和素前即有較好顯影效果，表現(xiàn)為密集細小的點狀強回聲(圖3C)，加入親和素后未見明顯變化(圖3D)。

2.4 造影劑耐聲壓性比較 PFOB脂質納米粒造影劑在低聲壓(MI=0.28)及高聲壓(MI=0.56)環(huán)境下，隨輻照時間延長，顯影強度均未見明顯改變(圖4、5，表1)。

在低聲壓(MI=0.28)環(huán)境下，隨輻照時間延長，C3F8脂質微泡顯影信號強度有減低趨勢(P<0.05,圖6、表1)，輻照10 s后顯影強度尚未見明顯改變(P>0.05)，而輻照20 s后顯影強度明顯減低(P<0.05)，輻照30 s后顯影強度進一步減低(P<0.05，圖7)；高聲壓(MI=0.56)環(huán)境下，隨輻照時間延長，其顯影信號強度亦有減低趨勢(P<0.05；圖8，表1)，輻照10 s后顯影強度即明顯減低(P<0.05)，輻照20、30 s后顯影強度均進一步減低(P均<0.05，圖9)。

表1 PFOB脂質納米粒/ C3F8脂質微泡造影劑在低聲壓及高聲壓環(huán)境下不同輻照時間顯影強度比較

圖5 高聲壓(MI=0.56)環(huán)境下PFOB脂質納米粒造影劑不同超聲輻照時間顯影情況 A～D.分別為PFOB脂質納米粒造影劑經(jīng)超聲輻照前(A)及輻照10(B)、20(C)、30 s(D)后的顯影情況

3 討論

分子影像技術需要能夠特異性反映靶組織在分子水平上病變進程的示蹤物，并能以信號增強的形式反映在可視性圖像上。在超聲分子影像領域，這種示蹤物就是靶向超聲造影劑。靶向超聲造影劑粒徑小，可穿過血管內皮間隙到達靶組織，外膜可攜載多種功能性化學基團便于表面修飾，在聲場中穩(wěn)定性更高、在循環(huán)中的半衰期更長，背景信號更低，且能與目前臨床使用的超聲成像系統(tǒng)兼容[1-2]。與傳統(tǒng)微泡型造影劑相比，本研究自制PFOB納米粒型造影劑在穿透力、顯影模式、SNR及耐聲壓性方面均具明顯優(yōu)勢。

傳統(tǒng)超聲造影劑粒徑約數(shù)微米，臨床多用以顯示整個血池系統(tǒng)的分布及完整性[3]，很難穿越血管內皮屏障，不能直接進入靶組織與靶細胞結合而反映病理進程及分子參與情況。本研究制備的PFOB脂質納米粒和C3F8脂質微泡的粒徑分別為(173.30±48.81)nm和(868.50±126.40)nm，PFOB納米脂質納米粒造影劑的粒徑更小，穿透力更強，更易穿過血管內皮屏障進入靶組織；且PFOB納米粒內核呈液態(tài)，抗剪切力能力更強。

圖6 低聲壓(MI=0.28)環(huán)境下C3F8脂質微泡造影劑不同超聲輻照時間顯影情況 A.超聲輻照前C3F8脂質微泡聲像圖； B.輻照10 s后，未見明顯微泡破壞； C.輻照20 s后，可見明顯微泡破壞； D.輻照30 s后，可見大量微泡破壞

圖7 低聲壓(MI=0.28)環(huán)境下C3F8脂質微泡造影劑不同輻照時間顯影強度比較 (*表示與輻照前比較，P<0.05；△表示與輻照10 s后比較，P<0.05；§表示與輻照20 s后比較，P<0.05)

本研究發(fā)現(xiàn)C3F8脂質微泡造影劑在游離狀態(tài)即能產生較強信號。加入親和素后，雖然粒徑測量結果與顯微鏡下觀察均證實微泡發(fā)生聚集，但與游離狀態(tài)時相比其顯影信號強度并無明顯增強，在靶向造影圖像中很難區(qū)分聚集至靶器官的微泡與循環(huán)中游離的微泡。

PFOB脂質納米粒造影劑的聲學顯影模式與傳統(tǒng)微泡型造影劑截然不同，其在游離狀態(tài)下產生的回聲信號非常微弱；加入親和素后，生物素化的PFOB納米粒信號得到明顯增強[4-5]。靶向造影時，PFOB脂質納米粒造影劑在未靶向結合至靶組織前以游離狀態(tài)存在，只產生極微弱信號；其靶向結合至靶組織并在其周圍聚集后，產生的信號明顯增強，超聲診斷的敏感度及特異度也隨之提高。

靶向造影對造影劑在血液循環(huán)中持續(xù)的時間和其在聲場中的顯影時間均有較高要求。循環(huán)時間較長是造影劑發(fā)揮靶向作用的基礎；而靶向造影過程中也需要足夠時間進行觀察及重復探察。因此，耐聲壓性是考驗靶向超聲造影劑的重要指標之一。

本研究對比觀察2種造影劑耐聲壓性能，在低聲壓及高聲壓環(huán)境下，C3F8脂質微泡接受一定時間超聲輻照后顯影強度即發(fā)生明顯下降，而PFOB脂質納米粒造影劑無論是在低聲壓環(huán)境還是高聲壓環(huán)境中的顯影強度在觀察時間內均保持穩(wěn)定。目前普遍認為MI<0.3的聲壓環(huán)境為低聲壓環(huán)境，處在這種聲場之中的微泡不易被聲能破壞，從而能夠獲得較為理想的顯影效果；而當微泡處在高聲壓環(huán)境之中，其中的氣體就會在聲壓作用下被動的發(fā)生劇烈的壓縮與膨脹，導致微泡外殼破裂，氣體逸出，喪失顯影能力[6-8]。因此，為盡可能保護微泡不受聲壓破壞，獲得較理想的顯影效果，對微泡型造影劑一般選用低能量超聲顯影模式且在長時間觀察顯影情況時需用間斷成像模式[9-10]，這在一定程度上會影響顯影過程的時間分辨率。PFOB脂質納米粒造影劑則不受此局限，其核心材料PFOB在常溫下為液態(tài)，且密度較大(1.93 g/ml)，具有良好的抗壓能力，即使在較高的聲壓環(huán)境下也不會被破壞，從而使其顯影效果得以維持。既往研究[5]報道，其在體內造影過程中顯影時間可達1～2天。

圖8 高聲壓(MI=0.56)環(huán)境下C3F8脂質微泡造影劑不同超聲輻照時間顯影情況 A.超聲輻照前C3F8脂質微泡聲像圖； B.輻照10s后即可見明顯微泡破壞； C.輻照20 s后，可見大量微泡破壞； D.輻照30 s后，可見大量微泡破壞

圖9 高聲壓(MI=0.56)環(huán)境下C3F8脂質微泡造影劑不同輻照時間顯影強度比較 (*表示與輻照前比較，P<0.05；△表示與輻照10 s后比較，P<0.05；§表示與輻照20 s后比較，P<0.05)

綜上所述，較之C3F8脂質微泡造影劑，以PFOB為核心的納米脂質納米粒造影劑粒徑更小，耐聲壓性能更好，更符合靶向超聲造影的要求。