多模態(tài)成像對間充質(zhì)干細(xì)胞移植后活體示蹤的應(yīng)用研究

胡 越，彭 燾，黃明聲，姜在波，李名安，賀 立，吳 春

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院介入科 介入放射學(xué)研究所，廣東 廣州 510630)

急、慢性肝功能損傷可由多種因素引起，嚴(yán)重威脅人類的健康，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植是具有巨大潛力的新治療策略[1-2]。相關(guān)研究[3-4]表明干細(xì)胞自我更新及多向分化的特性有助于肝損傷的修復(fù)和再生。但關(guān)于干細(xì)胞活體示蹤技術(shù)鮮見報道。為了將干細(xì)胞移植更好地應(yīng)用于臨床，研制實(shí)時、無創(chuàng)的干細(xì)胞示蹤成像技術(shù)非常重要。本課題組在之前相關(guān)研究[5]的基礎(chǔ)上將標(biāo)記熒光素酶和SPION的MSCs移植入急性肝損傷大鼠體內(nèi)，采用生成像(bioluminescence imaging , BLI)聯(lián)合MRI對移植MSCs在大鼠肝臟內(nèi)的動態(tài)改變進(jìn)行多模態(tài)示蹤，探討移植MSCs對大鼠急性肝損傷的修復(fù)功能。

1 材料與方法

1.1 動物模型 選取雌性SD大鼠90只，體質(zhì)量350～400 g。由中山大學(xué)動物中心提供，批號為SYXK(粵)2012-0081，并通過中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會許可。

1.2 儀器與材料 采用GE 1.5T MR掃描儀，活體成像系統(tǒng)由Caliper Life Science提供。聚乙二醇-聚天冬氨酸(聚乙烯亞胺)-超順磁性氧化鐵納米顆粒載體(PAI/SPION)[4]由中山大學(xué)化工學(xué)院提供；質(zhì)粒pDNA(pCMV-Luciferase2-mKate2)由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院分子影像實(shí)驗(yàn)室提供；低糖DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清由Gibco公司提供。標(biāo)記熒光素酶和SPION的大鼠骨髓MSCs[5]由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院分子影像學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 急性肝損傷大鼠模型的制備及MSCs移植 將在橄欖油中稀釋的四氯化碳溶液0.5 ml/kg體質(zhì)量注入90只大鼠腹腔建立大鼠急性肝損傷模型。建模24 h后，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛溶液(5 μl/g)進(jìn)行麻醉，無菌條件下經(jīng)腹部切口分離出腸系膜上靜脈。取50只大鼠作為實(shí)驗(yàn)組，經(jīng)腸系膜上靜脈將1 ml標(biāo)記熒光素酶和SPION的MSCs懸液(2×106/ml)緩慢移植入大鼠體內(nèi)；余40只作為對照組，經(jīng)腸系膜上靜脈注射PBS溶液。在術(shù)后1、5、9、10天分別從實(shí)驗(yàn)組和對照組各取10只大鼠(共80只)將其脫頸處死，檢測血漿中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST) 和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (alanine aminotransferase, ALT)水平，并進(jìn)行肝組織切片HE染色及免疫組織化學(xué)染色。對剩余10只實(shí)驗(yàn)組大鼠行體內(nèi)生物發(fā)光成像和MRI。

1.4 體內(nèi)生物發(fā)光成像 ①將熒光素酶底物(300 mg/kg體質(zhì)量)經(jīng)腹腔注射入大鼠體內(nèi)；②吸入異氟烷氣體麻醉大鼠，利用活體成像系統(tǒng)觀察MSCs移植前及移植后不同時間點(diǎn)(1、5、9、10天)體內(nèi)MSCs的生物發(fā)光成像并實(shí)時記錄圖片，定量分析肝區(qū)MSCs的生物發(fā)光強(qiáng)度，以photos/sec/cm2/steradian (sr) 為生物發(fā)光強(qiáng)度單位。

1.5 體內(nèi)MRI 經(jīng)腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛 (5 μl/g) 溶液麻醉大鼠。對MSCs移植前及移植后1、5、9、10天行大鼠肝臟T2*WI。參數(shù)：翻轉(zhuǎn)角20°，TR 450 ms,TE 15 ms，F(xiàn)OV 80 mm，矩陣320 ×192，層厚2.0 mm。ROI 設(shè)置為300 mm2，測量大鼠肝臟T2WI信號強(qiáng)度,計算標(biāo)準(zhǔn)化信號強(qiáng)度比值。標(biāo)準(zhǔn)化信號強(qiáng)度比值=MSCs移植后大鼠肝臟MR信號強(qiáng)度/MSCs移植前大鼠肝臟MR信號強(qiáng)度。

1.6 免疫組織化學(xué)評估 ①大鼠經(jīng)脫頸處死后切取肝臟，在4%多聚甲醛溶液中固定，隨后被石蠟包埋，經(jīng)切片機(jī)切片后置入烘焙箱烤片1 h。②將肝臟組織切片浸入二甲苯溶液3次；然后分別浸入不同濃度乙醇溶液。③PBS溶液清洗后，將切片置入檸檬酸鹽緩沖液，微波爐加熱后取出室溫下自然冷卻；滴加1% Triton溶液于腫瘤組織切片，再將切片置入過氧化氫酶阻斷劑中浸泡。④PBS溶液清洗后，滴加正常山羊血清封閉液，再滴加兔多克隆抗熒光素酶抗體(由英國Abcam公司提供)，4℃孵育過夜。⑤PBS溶液清洗后，滴加偶聯(lián)HRP的山羊抗兔抗體，用二氨基聯(lián)苯胺染色，然后依次將切片置入蘇木素溶液、不同濃度乙醇溶液和二甲苯溶液。樹脂蓋玻片封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并實(shí)時拍照。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 25.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料以±s表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)組與對照組大鼠不同時間AST、ALT水平差異；以配對t檢驗(yàn)比較MSCs移植前與移植后不同時間大鼠肝臟生物發(fā)光強(qiáng)度以及標(biāo)準(zhǔn)化MR信號強(qiáng)度差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSCs對肝功能損傷的作用 實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿和ASTALT水平隨時間延長而下降。實(shí)驗(yàn)組第5、9、10天血漿AST和ALT水平均低于同一時間點(diǎn)對照組(P均<0.05，表1)。實(shí)驗(yàn)組大鼠的肝臟組織切片呈淡染區(qū)的范圍(即損傷肝細(xì)胞)較對照組顯著減少(圖1)。

圖1 MSCs對肝損傷的作用 經(jīng)腸系膜上靜脈注射MSCs(A)或PBS溶液(B)10天后大鼠肝臟組織的變化(HE，×200)

圖2 活體生物發(fā)光成像 MSCs移植前后，急性肝損傷大鼠活體生物發(fā)光成像圖

2.2 活體生物發(fā)光成像 MSCs移植前以及移植后第1、5、9、10天的活體生物發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降。MSCs移植后第1天大鼠肝臟區(qū)域的生物發(fā)光強(qiáng)度較移植前顯著增強(qiáng)，然后隨時間進(jìn)程逐漸下降，MSCs移植后第10天，大鼠肝臟區(qū)域的生物發(fā)光強(qiáng)度幾乎檢測不到(表2)。病理示肝臟區(qū)域的紅色范圍也隨著時間進(jìn)程逐步縮小(圖2)。

2.3 MRI示蹤結(jié)果 MSCs移植后第1天，大鼠標(biāo)準(zhǔn)化MR信號強(qiáng)度顯著下降，此時大鼠肝臟于T2*WI呈顯著的陰性成像效果(即變暗征象)，直至移植后第10天，才逐漸恢復(fù)到移植前水平(表2、圖3)。

2.4 免疫組化結(jié)果 肝臟組織切片中，細(xì)胞核呈藍(lán)色，褐色表征在MSCs內(nèi)表達(dá)的熒光素酶。熒光素酶陽性的MSCs主要分布在門靜脈周圍的血竇內(nèi)。MSCs移植后，隨著大鼠肝臟生物發(fā)光強(qiáng)度的逐漸下降，熒光素酶陽性的MSCs數(shù)目亦隨時間進(jìn)程逐漸減少。MSCs移植后第10天，在肝臟組織切片中基本觀察不到褐色的熒光素酶陽性間充質(zhì)干細(xì)胞(圖4)。

3 討論

高效、無創(chuàng)活體成像示蹤技術(shù)的研制對MSCs移植治療的發(fā)展不可或缺。本課題組在之前相關(guān)研究[4]的基礎(chǔ)上成功證實(shí)了移植的MSCs對大鼠損傷肝臟具有良好的功能修復(fù)作用；并成功地將生物發(fā)光成像和MRI結(jié)合，對移植入大鼠損傷肝臟內(nèi)的MSCs進(jìn)行了實(shí)時、無創(chuàng)的多模態(tài)示蹤。

表1 2組大鼠不同時間AST、ALT水平比較(IU/L，±s)

表1 2組大鼠不同時間AST、ALT水平比較(IU/L，±s)

組別AST1天5天9天10天ALT1天5天9天10天MSCs組590.70±4.74352.03±4.08255.25±6.27223.69±1.71275.35±6.10220.11±7.7298.50±4.7947.38±2.02對照組595.17±4.07525.44±3.69505.50±5.84416.12±2.53289.54±7.14275.23±8.50259.26±4.11275.01±7.01t值-0.44-2.74-3.27-3.16-0.82-2.30-3.30-3.44P值0.67<0.05<0.01<0.050.43<0.05<0.01<0.01

圖3 MSCs體內(nèi)MRI示蹤 MSCs移植前后大鼠肝臟的T2*WI A～E.依次為MSCs移植前和移植后1、5、9、10天

圖4 MSCs移植后大鼠肝臟組織切片的原位免疫組織化學(xué)染色 A～E.依次為MSCs移植前和移植后1、5、9、10天，褐色表征MSCs內(nèi)表達(dá)的熒光素酶(×100)

表2 MSCs移植前與移植后不同時間大鼠肝臟生物發(fā)光強(qiáng)度、標(biāo)準(zhǔn)化MR信號強(qiáng)度比較

注：*：與移植前比較，P<0.05

本研究成功構(gòu)建了急性肝損傷大鼠模型。考慮到經(jīng)門靜脈注射可將更多的MSCs移植入大鼠肝臟[6]，腸系膜上靜脈的血流主要匯入門靜脈，并且腸系膜上靜脈注射相對門靜脈注射更容易操作。因此，本研究將標(biāo)記了熒光素酶和SPION的MSCs經(jīng)腸系膜上靜脈注射移植入急性肝損傷大鼠體內(nèi)。

標(biāo)記了熒光素酶和SPION的MSCs經(jīng)腸系膜上靜脈注射移植入大鼠損傷肝臟后，大鼠血漿AST和ALT水平呈時間依賴性顯著下降，表明MSCs具有修復(fù)和抑制急性肝損傷的功能 ，其中的機(jī)制可能是MSCs在凋亡過程中釋放膜微粒，后者介導(dǎo)的信號傳遞可用于修復(fù)損傷肝組織[7]，亦或是抑制成纖維細(xì)胞的增殖與α-平滑肌肌動蛋白的表達(dá)，加快基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌[8]等。

如活體生物發(fā)光成像所示，移植入大鼠損傷肝臟的MSCs表達(dá)豐富的熒光素酶，作用于熒光素酶底物產(chǎn)生大量光子，活體成像系統(tǒng)可長期監(jiān)控MSCs在大鼠損傷肝臟內(nèi)的定植情況。MSCs移植后，大鼠肝臟生物發(fā)光強(qiáng)度隨時間進(jìn)程逐漸下降，在移植后第10天基本上檢測不到。生物發(fā)光強(qiáng)度與細(xì)胞活性密切相關(guān)，因?yàn)楫a(chǎn)生光子的酶促反應(yīng)只能在活細(xì)胞中進(jìn)行。大鼠肝臟生物發(fā)光強(qiáng)度的下降或許是由于MSCs遷移出肝臟、局部缺血缺氧導(dǎo)致間充質(zhì)干細(xì)胞死亡[9]、免疫排斥反應(yīng)[10-11]、很難逃逸肝竇內(nèi)皮細(xì)胞對MSCs的殺傷[12]等。

當(dāng)標(biāo)記了熒光素酶和SPION的MSCs經(jīng)腸系膜上靜脈注射移植入急性肝損傷大鼠體內(nèi)后，經(jīng)MRI觀察到MSCs廣泛分布在大鼠損傷肝臟內(nèi)，于MR T2*WI呈現(xiàn)出顯著的低信號強(qiáng)度。連續(xù)的MRI觀察結(jié)果表明定植在大鼠損傷肝臟的MSCs可經(jīng)MR T2*WI成功示蹤，時程長達(dá)9天，這與我們之前的研究報道基本一致[13]。肝臟組織切片的原位免疫組織化學(xué)染色確認(rèn)了標(biāo)記熒光素酶和SPION的MSCs主要分布在門靜脈周圍及損傷的肝細(xì)胞區(qū)域，并且干細(xì)胞數(shù)目隨時間進(jìn)程逐漸減少。

本研究結(jié)果顯示MSCs移植后，MRI示蹤定植在肝臟MSCs的時程較生物發(fā)光成像略長。產(chǎn)生這個現(xiàn)象的潛在原因或許是在生物發(fā)光成像中，殘存的活細(xì)胞經(jīng)酶促反應(yīng)產(chǎn)生的光子穿過機(jī)體深層組織發(fā)生能量衰減和散射后，光子強(qiáng)度不足以被活體成像系統(tǒng)檢測到，而MR可斷層成像，具有不受限制的組織穿透能力，正好彌補(bǔ)了生物發(fā)光成像受組織深度影響的缺陷。同時，肝臟組織切片的原位免疫組織化學(xué)染色也證實(shí)在MSCs移植后第11天，確實(shí)有極少數(shù)MSCs存在肝臟內(nèi)。當(dāng)SPION從移植的MSCs內(nèi)排出后，SPION會被體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)選擇性吸收并參與體內(nèi)血紅蛋白的代謝過程[14]。

本研究結(jié)果顯示MSCs移植后，BLI和MRI的聯(lián)合成像成功對移植MSCs在大鼠肝臟內(nèi)的動態(tài)改變進(jìn)行了多模態(tài)示蹤。BLI具有無輻射、高敏感度和能夠追蹤移植后活體細(xì)胞生存狀態(tài)的優(yōu)點(diǎn)，但是空間分辨率較差，MR掃描可斷層成像，具有不受限制的組織穿透能力，正好彌補(bǔ)了BLI受組織深度影響的缺陷，但是對移植后活體細(xì)胞生存狀態(tài)的判斷能力差，兩者相互彌補(bǔ)，可以達(dá)到更好的體內(nèi)活體細(xì)胞的示蹤效果。

總之，本研究證實(shí)了MSCs具有修復(fù)和抑制急性肝損傷的作用，并成功的將BLI和MRI相結(jié)合，對移植入大鼠損傷肝臟內(nèi)的MSCs進(jìn)行了實(shí)時、無創(chuàng)的示蹤，在以MSCs為基礎(chǔ)的臨床治療及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力。