京海黃雞柔嫩艾美耳球蟲感染后盲腸轉錄組分析

于海亮 鄒文斌 王曉慧 林雨鑫，2 戴國俊 張濤 張跟喜 謝愷舟王金玉 施會強

（1. 揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009；2. 昆山市畜牧獸醫站，昆山 215300；3. 江蘇京海禽業集團有限公司，海門 226100）

雞球蟲病是由一種或多種球蟲侵入雞的腸道上皮細胞而引起的急性流行性寄生蟲病，其中以寄生于盲腸的柔嫩艾美爾球蟲（E. tenella）是最為嚴重的球蟲病之一［1-2］。據統計每年全球因球蟲病造成的經濟損失達30多億美元［2］。目前球蟲病的預防主要通過嚴格飼養管理、添加抗球蟲藥物和接種活蟲疫苗來實現［3］。藥物預防和活疫苗接種會造成藥物殘留和引發養殖風險，不能從根本上解決問題［4］。在分子水平上尋找與E. tenella感染相關的差異基因或主效基因，通過遺傳選育培育抗病品種將是解決這一問題的有效途徑。Chen等［5］通過轉錄組分析發現E. tenella的蘋果酸脫氫酶高表達（EtMDH）可能與E. tenella的發育和侵襲過程中的耐藥性有關。Guo等［6］通過雞E.tenella體內感染4.5 d盲腸上皮細胞感染組和非感染組的轉錄組基因芯片雜交分析發現，上調或下調的差異表達基因參與了免疫應答、細胞凋亡、免疫球蛋白的生成等過程。Xu等［7］和Zhou等［8］分別對雞盲腸微生物16S rRNA基因高變區進行高通量測序以探討盲腸微生物種類和組成。

京海黃雞是經國家遺傳資源委審定的優質肉雞新品種，具有小型、優質、早熟、抗逆等突出特點。本試驗以京海黃雞為試驗材料，采用RNA-seq技術篩選E. tenella感染和非感染組盲腸組織差異表達基因，旨為后續進一步分析差異基因在抵抗球蟲感染過程中相互作用的分子機制，以及研究與球蟲感染相關聯差異表達基因的遺傳標記，培育球蟲病抗性新品種或新品系提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

隨機選擇體重接近的健康半同胞1日齡京海黃雞母雛雞（購自江蘇省海門京海黃雞資源場）12只，在無球蟲環境中用無抗飼料隔離籠養至30日齡。試雞經糞便檢測均無球蟲卵囊感染后，飼養于經汽油噴燈火焰消毒的無球蟲單籠中，隨機均分為2組，感染組每只雞經口注射2.5萬個E. tenella孢子化卵囊，對照組則接種等量生理鹽水。感染后第7天，選取感染組盲腸病變記分最高的3只雞以及對照組3個個體。按照Trizol RNA提取試劑盒說明書，分別提取6個樣品的總RNA，感染組記為JS1-JS3，非感染組記為JC1-JC3。經濃度、純度、完整性檢測合格，且無降解、無污染的總RNA用于轉錄組測序。

用于感染的E. tenella孢子化卵囊由揚州大學獸醫學院寄生蟲教研室，經非球蟲疫苗免疫的健康雞體內傳代一次后收集獲得（方法參考戴國俊等［9］），于4℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 cDNA文庫構建及Illumina測序 檢測合格的6個盲腸組織總RNA送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司（干冰保存）進行文庫構建及轉錄組測序。通過帶有Oligo（dT）的磁珠富集、純化mRNA。以mRNA為模板合成cDNA。按照標準的Illumina 建庫流程對每個測序樣本的cDNA構建小片段測序文庫。采用2×100 pair-end模式在Illumina HiSeq2000測序平臺進行測序。

1.2.2 原始數據處理與分析 測序得到的原始圖像數據文件經堿基識別分析轉化為原始測序序列（Raw reads）。為了保證數據分析的精準度，測定Q20、GC含量和重復序列水平等質量參數，去除帶接頭、低質量、N（N表示無法確定堿基信息）比例大于10%的測序序列（Reads）后得到的序列（Clean reads）用于后續分析。從基因組網站下載（ftp：//ftp.ensembl.org/pub/release-75/fasta/gallus gallus/dna/）參考基因組和基因注釋模型。運用Bowtie v2.0.6軟件構建參考基因組指數［10］，并用TopHat v2.0.9軟件［11］將上述clean reads比對到參考基因組。采用HTSeq軟件統計各樣品定位到基因組的reads的數量［12］。

1.2.3 差異表達基因的篩選 差異基因的表達量通過RPKM（Reads per kilo bases per million reads）均一化處理后，用DESeq2軟件篩選感染和對照組的差異表達基因［13］，篩選的標準為：FC（fold change）≥2 且padj（校正后的P值）＜ 0.05。P值的矯正參考 Benjamini-Hochberg 所建方法［14］。

1.2.4 差異表達基因的GO和KEGG富集分析 采用GOseq進行功能富集分析［15］，將校正的P值小于0.05的差異表達基因顯著富集到各GO分類（term）。采用KOBAS（2.0）軟件進行通路富集分析［16］，差異表達基因經與KEGG數據庫比對，統計各個KEGG通路各層級的差異表達基因數量，并確定差異表達基因主要參與的代謝途徑和信號通路。

1.2.5 差異表達基因的qRT-PCR驗證 隨機選取10個差異表達基因，使用NCBI在線引物設計軟件Primer-Blast設計引物（上下游引物跨越外顯子-外顯子邊界），基因名稱及引物序列等信息見表1，其中YWHAZ和TBP內參基因根據文獻［17］選擇。按照SYBR Green（中國大連生物公司）和ABI 7500 SDS系統（Applied Biosystems，USA）提供的qRTPCR方法進行RNA-seq結果的可靠性驗證，每個樣品重復3次。qRT-PCR反應體系與條件參考Liu等［18］的方法，相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

2 結果

2.1 感染E. tenella后病雞的臨床表現

接種后1-3 d，各組雞無特殊癥狀且與感染前無差異；第4天，感染組雞開始排血糞；第5天排血糞最多；第6天排血糞開始減少。病雞精神萎靡，廢食，肛門周圍羽毛污穢，呈共濟失調，兩翅下垂，出現麻痹、痙攣等癥狀，感染組試驗期內未出現個體死亡情況。第7天剖檢病雞，部分見盲腸腫脹發黑，形成腸芯。非感染對照組試驗雞精神狀態良好，生長狀態和正常飼養雞無差異。

2.2 RNA轉錄組測序數據檢測質量

轉錄本測序結果及質量參數見表2。由表可見，每個樣本100個堿基（bp）長度的raw reads的數量在52432 520到64910 184之間，說明豐度高；GC堿基的百分含量在49.18%-50.62%之間，說明各樣本的GC含量較為一致；質量值Q20在96%以上，表明RNA-seq 測序數據的數量和質量均較高，可以用于后續分析。為了排除接頭和低質量reads對轉錄信息分析的干擾，6個樣本去除帶接頭、低質量和N（N表示無法確定堿基信息）比例大于10%的reads后得到34.8 Gb的clean reads。共有80%的clean reads比對到雞參考基因組上，其中78%是有唯一比對位置的reads。

2.3 差異表達基因的篩選結果

從差異倍數（Fold change）和顯著水平（Pvalue）兩個水平進行差異表達基因的評估篩選，將差異基因的表達倍數在2倍以上，顯著水平padj＜0.05確定為表達有顯著差異基因時，由圖1可見，E. tenella感染組和非感對照組共有2830個差異表達基因，其中表達上調的基因有1419個，下調的基因有1411個。當差異基因的表達倍數在5倍以上，顯著水平仍為padj＜0.05時，篩選到的差異表達基因共有57個，其中表達上調的基因有23個，下調的基因有34個。

2.4 差異表達基因的GO分類結果

GO分析表明，共有83.25%（2356個）差異基因獲得GO功能注釋，差異表達基因富集的GO terms共有11236個，其中顯著富集的有545個，涉及生物過程（Biological process），細胞成分（Cellular component）， 分 子 功 能（Molecular function）3大類。圖2為前30條顯著富集的GO terms。由圖可見，差異基因顯著富集的與生物過程有關的GO terms數量最多，達21個，其中富集最多的是細胞交流（GO：0007154），富集最少的是血管發育（GO：0001568）。其次為與細胞成分有關的terms有8個，差異基因富集最多的是膜（GO：0016020），富集最少的是線粒體內膜（GO：0005743），在分子功能方面，差異表達基因顯著富集的Term只有1個，其功能與氧化還原酶活性（GO：0016491）有關。

圖2 顯著富集的前30個GO類別

2.5 差異表達基因KEGG富集分析

KEGG差異表達基因顯著富集的前20條通路見圖3。其中最為顯著的通路有3條，分別是過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路（PPAR signaling pathway，ID：gga03320）、 黏 著 斑 通 路（Focal adhesion，ID：gga04510）和細胞外基質受體相互作用（ECM-receptor interaction，ID：gga04512），富集的差異基因分別有24、55和24個，3個通路中與免疫反應有關的基因有血管生成素樣蛋白4（ANGPTL4），長鏈脂酰輔酶A合成酶5（ACSL5），血管內皮細胞生長因子C（VEGFC），促分裂素原活化蛋白激酶10（MAKP10）和白細胞分化抗原分化簇44（CD44）等，相關信息見表3。

圖3 前20位顯著富集的功能性KEGG通路

表3 差異基因KEGG通路分析

2.6 熒光定量PCR驗證

在不同倍性（2-7倍）改變的差異基因中挑選上調和下調的差異基因各5個，以 YWHAZ和TBP作為內參［17］，運用熒光定量PCR驗證RNA-seq結果的可靠性。10個差異表達基因驗證結果見表4，所選10差異表達基因2種不同檢測方法的上調與下調倍數經相關分析，相關系數達到了0.988，相關極顯著（P＜0.000），決定系數R2=0.975。熒光定量測定數據進一步驗證了轉錄組測序結果的可靠性。

3 討論

雞球蟲病是一種嚴重危害養殖業的流行性急性寄生蟲病，給養殖業造成巨大的經濟損失［2］。傳統預防球蟲的方法存在很大的弊端，從分子水平上尋找球蟲感染有關的基因，用于抗病育種，提高群體的免疫抗性十分重要。本研究對雞E. tenella感染組和非感對照組盲腸組織的轉錄組文庫進行分析，發現存在2830個差異基因，其中上調基因1419個，基因下調1411個；與球蟲感染相關的免疫基因包括ANGPTL4、ACSL5、VEGFC、CD44和MAKP10等。主要通路有過氧化物酶體通路、黏著斑通路、細胞外基質受體相互作用，研究結果為從分子應答過程和免疫應答機制方面研究E. tenella的感染提供了依據。

表4 熒光定量對RNA-seq結果的驗證

過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARS）屬于細胞核受體超家族，主要功能是將環境、營養或炎癥等刺激轉化為細胞內信號，從而發揮重要的信使作用［19］。Daynes等［20］研究表明PPARS對調節免疫反應非常重要，包括調節樹突狀細胞和T細胞因子的產生和淋巴細胞的增殖。此外，Gou等［21］表明PPARS在細胞凋亡與腫瘤的發生發展中起重要的調節作用。該通路中的差異表達基因ANGPTL4是ANGPTL家族重要成員之一，它可以調節血管通透性和活性氧水平，促進血管生成和傷口愈合［22-23］。研究表明，ANGPTL4可增強內皮細胞間的連接，維持血管完整性，控制炎癥反應［24］。此外，Georgiadi等［25］研究發現ANGPTL4過表達在小鼠動脈粥樣硬化發展中具有抗炎作用。ACSL5是一種線粒體定位酶，參與細胞發育、凋亡以及腫瘤的發生［26］。有研究表明ACSL5可能在狼瘡樣小鼠模型的免疫功能障礙中起重要作用［27］。

黏著斑通路是細胞間或者細胞與細胞外基質之間連接的紐帶，控制細胞的生長、分化、擴散、黏附、遷移及凋亡等行為［28］，雞感染E. tenella后，盲腸組織會發生嚴重損傷，引發宿主一系列的生理反應以抵抗球蟲對腸道的破壞，此過程涉及到盲腸上皮屏障的緊縮，其原因可能是通過粘著斑通路加強上皮細胞和細胞外基質之間的相互作用來完成［29］。該通路上的一個差異表達基因VEGFC作為重要的淋巴管生長因子，主要參與淋巴管的生成，在動物的免疫防御以及腫瘤轉移中起重要的作用［30］。有研究表明，VEGFC能夠促進人類多種惡性腫瘤中淋巴系統的生成和轉移［31］，Küchler等［32］研究表明，斑馬魚淋巴系統的生長發育依賴于VEGFC的表達。本研究發現E. tenella感染組中VEGFC的表達量顯著上調，可能參與了雞淋巴系統的生成以增強免疫防御。該通路的另一個差異表達基因MAKP10（JNK3）在哺乳動物中具有重要作用，它是哺乳動物體內絲裂原活化蛋白激酶家族的重要一員，且JNK3主要在腦、心臟、睪丸等組織中大量表達［33］，Ying等［34］研究表明MAPK10基因在多種癌細胞中低表達，具有抑制腫瘤的發生和發展的功能。但MAPK10基因在禽類中它的主要表達組織及在禽類免疫中的作用尚不明確，有待進一步研究。

細胞外基質（ECM）是由結構大分子和功能大分子組成的復雜混合物，在維持細胞、組織的結構和發揮細胞、組織功能中起重要作用［35］。研究證明，ECM是通過多種跨膜分子（主要是整合素）直接或間接控制細胞活動，如細胞的粘附、遷移、分化、增殖和凋亡［36］。本研究在該通路上篩選到的與免疫有關的其中一個差異表達基因為CD44。CD44是透明質酸受體同時也是細胞表面的一種糖蛋白，參與細胞與細胞的相互作用，細胞粘附、遷移和侵襲［37］。DeGrendele等［38］研究表明T細胞與抗體結合可誘導CD44-HA的生成，促進了炎癥部位淋巴細胞的外滲，具有增強免疫功能的作用。Protin等［39］通過對CD44缺陷小鼠和正常組小鼠進行生長發育分析，表明CD44在成年動物的胸腺和周圍淋巴結的轉運中起重要作用。本研究在雞柔嫩艾美爾球蟲感染和非感染的盲腸組織轉錄組測序差異表達基因分析中發現CD44的表達差異顯著，可能該基因在雞球蟲的感染中有重要作用。

4 結論

本研究采用RNA-seq技術對雞E. tenella感染組與對照組組織的轉錄組進行測序分析，共有2830個差異表達基因，其中表達上調的基因有1419個，下調的基因有1411個。GO分析表明，共有83.25%（2356個）差異基因獲得GO功能注釋。KEGG通路富集分析發現，差異基因顯著富集的信號通路有黏著斑、細胞外基質-受體相互作用、過氧化物酶體增殖物激活受體。這些通路中的差異基因有ANGPTL4、ACSL5、VEGFC、CD44和MAKP10， 這些基因在宿主柔嫩艾美耳球蟲感染過程中發揮重要作用。