壯族與漢族頸動(dòng)脈粥樣硬化患者的血清同型半胱氨酸水平及亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性▲

盧紅華 許亮掌 覃發(fā)鳳

(廣西南寧市邕寧區(qū)人民醫(yī)院，1 內(nèi)科，2 內(nèi)兒科，3 呼吸內(nèi)科，南寧市 530299，電子郵箱：lhh891@126.com)

腦血管疾病嚴(yán)重威脅著中老年人的身心健康，隨著人口老齡化的加劇，腦血管疾病的危害也日益加重[1]。其中缺血性腦卒中是導(dǎo)致中老年人殘疾甚至死亡的首要原因[2-3]。頸動(dòng)脈粥樣硬化(carotid atherosclerosis，CAS)的發(fā)生以及其斑塊的形成，是老年人發(fā)生缺血性腦卒中、短暫性腦缺血等缺血性腦病的重要危險(xiǎn)因素，其受多種因素影響，如吸煙、飲酒、高血壓、高血脂、高同型半胱氨酸血癥等[4-5]。已有大規(guī)模流行病學(xué)研究證實(shí)，血清同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平升高是缺血性腦血管事件發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其與血管危險(xiǎn)性事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間呈劑量依賴關(guān)系[6]。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是Hcy的代謝酶，C677T點(diǎn)突變是其常見的基因突變類型，可使該酶活性下降，導(dǎo)致血漿Hcy的水平明顯升高。另有研究指出，血漿Hcy水平和MTHFR C667T基因多態(tài)性能增加早期缺血性腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[7]，且MTHFR C667T基因多態(tài)性與民族有關(guān)[8]。但血漿Hcy水平及MTHFR C677T基因多態(tài)性是否與不同民族的CAS的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，目前仍缺乏相關(guān)研究報(bào)道。壯族是我國(guó)人口最多的少數(shù)民族，而廣西則是壯族人口最多的省份，其壯族總?cè)丝谶_(dá)1 444.85萬人[9]。本研究選擇在我院就診的漢族及壯族CAS患者作為研究對(duì)象，分析兩者Hcy水平、MTHFR C667T基因多態(tài)性的差異，旨在為頸動(dòng)脈硬化粥樣硬化的防治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1月至2019年1月我院內(nèi)科收治的89例CAS患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)直系家屬報(bào)告或自我報(bào)告其三代以內(nèi)均為壯族血緣(或漢族血緣)；(2)年齡20～75歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有心、肝、腎功能不全及精神異常者；(2)既往患糖尿病、腦梗死、出血性腦血管疾病者；(3)既往有血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、自身免疫病者；(4)3個(gè)月內(nèi)服用過影響Hcy水平的藥物者；(5)病歷資料不完整者。其中壯族47例，漢族42例。壯族組和漢族組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 兩組一般資料的比較

注：▲曾經(jīng)吸過100支煙和每月至少飲酒1次。

1.2 觀察指標(biāo)的檢測(cè)方法

1.2.1 血清Hcy含量的測(cè)定：抽取所有研究對(duì)象清晨空腹靜脈血3 mL，采血后不抗凝，于1 h內(nèi)以4 000 r/min離心10 min分離血清，由本院檢驗(yàn)科采用日立HLTACHI-7600全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清Hcy水平。

1.2.2 MTHFR C677T基因多態(tài)性檢測(cè)：(1)標(biāo)本采集。抽取所有研究對(duì)象清晨空腹靜脈血3 mL，抗凝后充分搖勻，4 000 r/min離心10 min。(2)DNA提取。取中層白細(xì)胞，使用Solarbio公司的全血基因組DNA提取試劑盒(批號(hào)：D1850-50)提取基因組DNA。(3)目的基因擴(kuò)增。上游引物為5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3′，下游引物為5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′，引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。按照PCR檢測(cè)試劑盒(南京諾維贊生物科技有限公司，批號(hào)：P102-d1)配制PCR反應(yīng)體系20 μL，包括ddH2O 6.6 μL，2×Phanta Max Buffer 10 μL，dNTP Mix 0.4 μL，上下游混合引物1.6 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.4 μL，DNA模板1 μL。PCR條件為預(yù)變性94℃ 5 min，解鏈94℃ 30 s，退火62℃ 30 s，延伸72℃ 30 s；循環(huán)35次后再以72℃延伸7 min。擴(kuò)增完成后向PCR產(chǎn)物加入2 μL 10×loading buffer混勻備用。(4)PCR產(chǎn)物檢測(cè)。取2 μL的PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，將凝膠板放在紫外透射儀的石英玻璃上檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。(5)使用限制性內(nèi)切酶Hinf Ⅰ在37℃水浴下消化擴(kuò)增產(chǎn)物；配制20 μL反應(yīng)體系，將ddH2O 7.5 μL，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，10×緩沖液(美國(guó)NEB公司)2 μL，Hinf Ⅰ限制性內(nèi)切酶(美國(guó)NEB公司)0.5 μL加入到200 μL離心管，將離心管置于37℃溫浴至少8 h。溫浴后將酶切產(chǎn)物加入3%瓊脂糖凝膠孔中，接通電源并設(shè)置電壓110 V后電泳約90 min，電泳后用凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD，版本號(hào)：Gel Doc XRt)在紫外燈下觀察酶切后電泳帶及其位置，以DNA Marker(198 bp)為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，將電泳結(jié)果數(shù)據(jù)保存分析。

1.3 CAS判斷 所有入組患者均使用日本日立HI VISION Avius L型四維彩色多普勒超聲儀進(jìn)行檢查。患者平臥，暴露頸部，將中心頻率7.5 MHz的探頭置于頸部，分別檢查左右頸總動(dòng)脈(約為頸總動(dòng)脈分叉前1 cm處)、頸總動(dòng)脈分叉處、頸內(nèi)動(dòng)脈(約為頸總動(dòng)脈分叉后1 cm處)等3個(gè)位置血管后壁的內(nèi)-中膜厚度(intima-media thickness,IMT)；IMT值表示血管內(nèi)膜面至中層外表面的厚度；局部放大所測(cè)量部位，調(diào)節(jié)聲束方向，與管壁垂直后方可測(cè)量；取6個(gè)部位的IMT平均值作為最終結(jié)果。根據(jù)頸動(dòng)脈IMT值來判斷患者是否存在CAS，IMT≤1.0 mm為正常，1.0 mm

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用擬合χ2檢驗(yàn)對(duì)各組的基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTHFR基因C677T位點(diǎn)基因型的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 47例壯族組患者中檢出CC基因型6例，CT基因型28例，TT基因型13例，T等位基因頻率為57.45%，C等位基因頻率為42.55%；在42例漢族組患者中檢出CC基因型15例，CT基因型21例，TT基因型6例，T等位基因頻率為39.29%，C等位基因頻率為60.71%。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩組觀察值與理論值之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，表明本研究人群MTHFR C677T基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡，研究對(duì)象是同一群體。見表2。

表2 MTHFR基因C677T位點(diǎn)基因型的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

2.2 兩組MTHFR C677T基因多態(tài)性的比較 壯族組MTHFR C677T基因T等位基因頻率及TT基因型頻率均高于漢族組(均P<0.05)。見表3。

表3 壯族與漢族患者M(jìn)THFR C677T基因多態(tài)性的比較[n(%)]

2.3 兩組血清Hcy水平的比較 壯族組血清Hcy水平為(26.41±6.82)mol/L，高于漢族組的(23.34±8.21)mol/L，但是兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.625,P=0.089)。

3 討 論

Hcy是一種含硫氨基酸，體內(nèi)的Hcy是飲食攝取的蛋氨酸經(jīng)代謝后產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物。血清Hcy水平上升會(huì)影響血管平滑肌細(xì)胞、損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，激活炎癥介質(zhì)和活化炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，并可影響體內(nèi)轉(zhuǎn)甲基化反應(yīng)，從而導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生CAS病變，進(jìn)而造成血管受損，最終出現(xiàn)心腦血管事件[10-12]。有研究表明MTHFR基因多態(tài)性與血清Hcy水平有關(guān)[13]，但不同的研究報(bào)道結(jié)果仍存在較大差異[14]。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)MTHFR基因多態(tài)性與地域、民族等因素有關(guān)[8，15]。本研究結(jié)果顯示，壯族患者的TT基因型及T等位基因頻率均高于漢族(均P<0.05)，但兩者血清Hcy水平差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)，提示動(dòng)脈粥樣硬化患者中壯族與漢族人群MTHFR基因多態(tài)性存在差異，但MTHFR基因多態(tài)性的差異或許并不影響漢族與壯族人群的血清Hcy水平，這可能與血清Hcy代謝途徑有關(guān)。血清Hcy主要的代謝途徑有3種：在輔酶維生素B6催化下轉(zhuǎn)化為半胱氨酸，被甜菜堿甲基化成蛋氨酸，在輔酶維生素B12催化下被甲基四氫葉酸甲基化生成蛋氨酸。葉酸是甲基化途徑的甲基間接供體，也是維生素B6、維生素B12催化Hcy代謝的關(guān)鍵輔酶，而MTHFR是甲基直接供體甲基四氫葉酸的關(guān)鍵酶，可見，維生素B6、維生素B12、甜菜堿、葉酸攝入不足，或MTHFR發(fā)生基因突變使甲基四氫葉酸合成不足等因素均可導(dǎo)致Hcy代謝出現(xiàn)異常，而MTHFR基因多態(tài)性只是影響血清Hcy水平眾多因素中的一種[16]。

本研究中，雖然兩組Hcy水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但壯族組血清Hcy水平稍高于漢族，這可能與壯族人群高鈉飲食、喜食糯米與糯米制品、腌制食品、不健康的生活方式，教育程度低有關(guān)，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。目前仍沒有足夠的證據(jù)證實(shí)CAS患者的血清Hcy水平與民族存在的較高相關(guān)性，可能是由于本研究納入的樣本數(shù)較少，對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生一定的偏倚。

綜上所述，CAS患者中，壯族與漢族人群的MTHFR C667T基因多態(tài)性存在差異，但Hcy水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其或不受代謝酶基因多態(tài)性的影響。